We presenteren een geoptimaliseerde lokale ejectieprocedure met behulp van een glazen micro-pipet en een snelle twee-fotonen hyperstack-beeldvormings methode, die nauwkeurige meting van veranderingen in de capillaire diameter mogelijk maakt en het onderzoek van de verordening in drie dimensies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door een complex netwerk van schepen. Echter, de regulering van cerebrale doorbloeding (CBF) is niet volledig begrepen, vooral op het capillaire niveau. Two-photon microscopie is een krachtig hulpmiddel op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van CBF en de verordening. Momenteel wordt dit veld beperkt door het ontbreken van in vivo twee-fotonen microscopie studies die onderzoeken (1) CBF-responsen in drie dimensies, (2) voerden vasculaire reacties uit en (3) gelokaliseerde interventies binnen het vasculaire netwerk. Hier beschrijven we een 3D in vivo-methode met behulp van twee-fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire reacties te bestuderen die worden opgewekt door lokale uitwerpen van ATP met een glazen micro pipet. Onze methode maakt gebruik van snelle en repetitieve hyperstack Two-photon Imaging voor nauwkeurige diameter metingen door de maximale intensiteit projectie van de verkregen beelden. Bovendien tonen we aan dat deze methode ook kan worden gebruikt om 3D astrocytische calcium responsen te bestuderen. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van het inbrengen van glazen micropipetten en twee Fobe hyperstack-beeldvorming.
Inleiding
De hersenen hebben een hoog energieverbruikpercentage. Ongeveer 20% van de zuurstof en 25% van de glucose verbruikt door het menselijk lichaam zijn gewijd aan de hersenfunctie, terwijl de hersenen slechts 2% van de totale lichaamsmassa inneemt. Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door de bloedtoevoer in een complex netwerk van schepen. Lokale hersenactiviteit en cerebrale doorbloeding (CBF) zijn robuust gekoppeld, afhankelijk van de functionele eigenschappen van neuronen, astrocyten, pericytes, gladde spiercellen (Smc's) en endotheel cellen (ECs)1. Onlangs zijn de eerste pa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Deens nationaal ethisch comité overeenkomstig de richtsnoeren die zijn uiteengezet in het Verdrag van de Europese Raad inzake de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden en voldoen aan de richtlijnen voor de aankomst. Dit is een terminale procedure waarbij de muizen voorafgaand aan verdovings herstel worden geëmoriseerd.
1. pre-chirurgische voorbereiding
- Reinig de chirurgische tafel en alle omliggende gebied met 70% ethanol. Grondig reinigen en drogen van de chirurg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Nadat de operatie voltooid was, werden muizen getransporteerd naar twee-photon Microscoop (Figuur 1A). Er werd een glazen micro pipet met 1 mM ATP in de nabijheid van het bestemmings bloedvat op de doellocatie ingebracht (Figuur 1B).
We voerden hyperstack Imaging uit terwijl we een Puff van 1 mM ATP gaven (afbeelding 2a, aanvullende video 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een uitdaging voor vasculaire studies is de precieze meting van de diameter van het vat. De methode die we hier beschrijven gebruikten een gemotoriseerde piëzo-doelstelling om snelle en repetitieve hyperstack-beeldvorming te maken met twee fotonmicroscopie. Ten eerste, deze methode maakt herhaalde onderzoeken van de penetrerende Arteriole, 1St orde en 2ND orde capillairen zonder verlies van focus en leidde tot de ontdekking van langzaam uitgevoerde vasculaire reacties in capillairen in vivo. Ten twe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gesteund door de Stichting Lundbeck, de Stichting NOVO-Nordisk, de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Medische wetenschappen, en de NORDEA Foundation verlenen aan het centrum voor gezonde veroudering.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Aanbrengen op de blootgestelde cortex voor bescherming |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Kleurstof voor het verven van het opblaasbare compound naar rood fluorescerend |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator en vasoconstrictor, opblaasbaar compound |
| Cyanoacrylaatlijm en activator | Loctite | Adhesives en SF7452 | Lijm voor metalen onderdeel en dekglas |
| Oogsmeer | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denemarken | De ogen van de muis vochtig houden | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Kleurstof voor bloedserum, groen fluorescerend |
| NG2DsRed muizen | Jackson Laboratory | 8241 | Deze transgene muizen drukken een rood fluorescerend eiwitvariant (DsRed) uit onder controle van de muis NG2 (Cspg4) promotor |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyt-specifieke virale vectoren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Kleurstof voor bloedserum, rood fluorescerend |
| Lijst van apparatuur | |||
| Luchtpomp | WPI | PV830 | Luchtdruk geven voor het opblazen van de pipet |
| Bloedgasanalysator | Radiometer | ABL 700 | Meet niveaus van bloedgas |
| Bloeddrukmeter | World Precision Instruments | BP-1 | Controleer de arteriële bloeddruk |
| Lichaamstemperatuurregelaar | CWE | Model TC-1000 | Houd de lichaamstemperatuur van de muis binnen fysiologische grenzen |
| Capnograaf | Harvard Apparatus | Type 340 | Controleer het eind-expiratoire CO2 van de muis |
| Elektrische stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Toepassen van snorhaarkussentjestimulatie |
| Mechaanse ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechaans beademen van de muis binnen fysiologische grenzen |
| Micropipettrekker | Sutter Instrument | P-97 | |
| Twee-fotonmicroscoop | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| Lijst van chirurgische instrumenten | |||
| Anatomisch pincet | Lawton | 09-0007 | |
| Gevlochten en gebalanceerd pincet | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris schaar | Lawton | 05-1450 | |
| Microvasculaire klem | S&T AG | 462 | |
| Vasculaire katheters voor muizen | Verutech | 100828 |
Referenties
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
