Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

13.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59297

⸱

18 april 2019

 , 
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In dit artikel

Samenvatting

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Samenvatting

De huid is het grootste orgaan van het lichaam en heeft vele functies. De huid fungeert als een fysieke barrière en de beschermer van het lichaam en regelt lichaamsfuncties. Biomimetics is de nabootsing van de modellen, systemen en elementen van de natuur met het oog op het oplossen van complexe menselijke problemen1. Huid biomimetics is een nuttig instrument voor onderzoek van de ziekte in vitro en in vivo regeneratieve geneeskunde. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) hebben het kenmerk van onbeperkte proliferatie en de mogelijkheid van differentiatie op drie lagen van de kiem. Menselijke iPSCs worden gegenereerd uit verschillende primaire cellen, zoals cellen van het bloed, keratinocyten, fibroblasten en meer. Onder hen, hebben koord bloed mononucleaire cellen (CBMCs) naar voren gekomen als een bron van alternatieve cel vanuit het perspectief van allogene regeneratieve geneeskunde. CBMCs zijn nuttig in de regeneratieve geneeskunde omdat menselijke leukocyten antigeen (HLA) te typen naar de cel bankwezen essentieel. Wij bieden een methode voor de differentiatie van CBMC-iPSCs in keratinocyten en fibroblasten en generatie van een 3D huid organoid. Keratinocyten CBMC-iPSC-afgeleide en fibroblasten hebben kenmerken vergelijkbaar met een oplaadbare batterij-lijn. De 3D huid organoids worden gegenereerd door een epidermale laag op een dermale laag bedekken. Door het transplanteren van deze 3D huid organoid, wordt een gehumaniseerd muizen model gegenereerd. Deze studie toont aan dat een 3D menselijke iPSC afkomstige huid organoid een nieuwe, alternatieve tool voor dermatologische onderzoek in vitro en in vivo wellicht.

Inleiding

Huid heeft betrekking op de buitenste oppervlakte van het lichaam en beschermt de inwendige organen. De huid heeft verschillende functies, met inbegrip van bescherming tegen ziekteverwekkers, opvangen en opslaan van water, regulering van de lichaamstemperatuur, en lichaam afscheiden afval2. Huid protheses kunnen worden ingedeeld, afhankelijk van de bron van de huid; transplantaties met behulp van de huid van een andere donor allografts worden genoemd, en enten met de huid van de patiënt zijn autografts. Hoewel het een autograft is de aangewezen behandeling vanwege zijn lage afwijzing risico, zijn huid biopsieën moeilijk uit te voeren op patiënten met ernstige letsels of een onvoldoende aantal huidcellen. Bij patiënten met ernstige brandwonden zijn drie keer het aantal huidcellen nodig om grote gebieden bestrijken. De beperkte beschikbaarheid van huidcellen van het lichaam van een patiënt leidt tot situaties waarin allogenous transplantatie noodzakelijk is. Een allograft wordt tijdelijk gebruikt totdat autologe transplantatie kan worden uitgevoerd omdat het meestal wordt afgewezen door het immuunsysteem van de gastheer na ongeveer 1 week3. Om te overwinnen afwijzing door het immuunsysteem van de patiënt, moeten protheses komen uit een bron met dezelfde immuun identiteit als de patiënt4.

Menselijke iPSCs zijn een opkomende bron van cellen voor stamcel therapie5. Menselijke iPSCs worden gegenereerd uit lichaamscellen, met behulp van herprogrammering factoren zoals OCT4, SOX2, Klf4 en c-Myc6. Met behulp van menselijke iPSCs overwint de ethische en immunologische kwesties van embryonale stamcellen (SER's)7,8. Menselijke iPSCs pluripotent hebben en kunt onderscheiden in drie lagen van de kiem9. De aanwezigheid van HLA, een kritische factor in de regeneratieve geneeskunde, bepaalt de immuunrespons en de mogelijkheid van verwerping10. Het gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs verhelpt de problemen van cel-source beperking en immuunsysteem afwijzing. CBMCs hebben ook naar voren gekomen als een bron van alternatieve cel voor regeneratieve geneeskunde11. Verplichte HLA typen, die tijdens CBMC bankieren optreedt, kan gemakkelijk worden gebruikt voor onderzoek en transplantatie. Verdere, homozygoot HLA-type iPSCs kunt grote schaal toepassen van verschillende patiënten12. Een bank CBMC-iPSC is een roman en efficiënte strategie voor celtherapie en allogene regeneratieve geneeskunde12,13,14. In deze studie, wij gebruiken CBMC-iPSCs, onderscheiden in keratinocyten en fibroblasten, en genereren van gestratificeerde 3D huidlagen. Resultaten van deze studie suggereren dat een 3D huid CBMC-iPSC-afgeleide organoid een nieuwe tool voor in vitro en in vivo dermatologische onderzoek is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd overeenkomstig de laboratorium akte van de welzijn van de dieren, de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en de richtlijnen en het beleid voor knaagdieren experimenten geboden door de institutionele Animal Care en Gebruik Comité (IACUC) van de School of Medicine van de Katholieke Universiteit van Korea. Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van de Katholieke Universiteit van Korea (CUMC-2018-0191-01). De IACUC en het departement van laboratorium dieren (DOLA) van de Katholieke Universiteit van Korea, Songeui Campus geaccrediteerde de Korea Excellence dier laboratorium faciliteit van de Korea Food and Drug Administration in 2017 en verworven vereniging voor beoordeling en Erkenning van de internationale volledige accreditatie Laboratory Animal Care International (AAALAC) in 2018.

1. de celdifferentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van de huid

  1. Middellange voorbereiding
    Opmerking: Bewaar alle medium bij 4 ° C in een donkere omgeving voor maximaal 3 maanden. Filteren alle medium gebruik van een systeem van de filter van het polyethersulfon 0,22 μm vóór gebruik voor sterilisatie. Alle medium was beschikbaar in een totaal volume van 500 mL.
    1. Bereiden van KDM1 (Keratinocyt differentiatie medium 1). De mix Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) / F12 medium (3:1) met 2% foetale runderserum (FBS), 0.3 mmol/L L-ascorbinezuur, 5 μg/mL insuline en 24 µg/mL adenine.
    2. Bereiden van KDM2 (Keratinocyt differentiatie medium 2). Mix gedefinieerd Keratinocyt serumvrij middellange (Zie de Tabel van materialen) met 0.3 mmol/l-L-ascorbinezuur, 5 μg/mL insuline en 10 μg/mL adenine.
      Opmerking: Gedefinieerde Keratinocyt serumvrij medium is geoptimaliseerd voor de ondersteuning van de groei en de uitbreiding van keratinocyten.
    3. Bereiden van KDM3 (Keratinocyt differentiatie gemiddeld 3). Mix gedefinieerd Keratinocyt serumvrij medium en Keratinocyt serumvrij medium (1:1) Zie de Tabel van materialen voor meer informatie.
      Opmerking: Keratinocyt serumvrij medium is geoptimaliseerd voor de groei en het onderhoud van keratinocyten.
    4. Bereiden van FDM1 (fibroblast differentiatie medium 1). Mix DMEM/F12 medium (3:1) met 5% FBS, 5 μg/mL insuline 0.18 mM adenine en 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF).
    5. Bereiden van FDM2 (fibroblast differentiatie medium 2). Mix DMEM/F12 medium (1:1) met 5% FBS en 1% niet-essentiële aminozuren.
    6. EP1 bereiden (epitheliale medium 1). Mix DMEM/F12 (3:1) met 4 mM L-glutamine, 40 μM adenine 10 μg/mL transferrine, 10 μg/mL insuline en 0,1% FBS.
    7. Bereiden EP2 (epitheliale medium 2). Meng EP1 en 1,8 mM calciumchloride.
    8. Bereiden EP3 (epitheliale medium 3, cornification medium). Mix-F12 medium met 4 mM L-glutamine, 40 μM adenine, 10 μg/mL transferrine, 10 μg/mL insuline, 2% FBS en 1,8 mM calciumchloride.
  2. Embryonale lichaam generatie
    1. Genereren van CBMC-iPSCs met behulp van het protocol weergegeven in een eerdere studie12.
    2. Jas cultuur gerechten, met behulp van vitronectin. Bereiden 5 mL jas een schotel van 100 mm.
      1. Ontdooien en resuspendeer 50 μl van 0, 5 mg/mL vitronectin (eindconcentratie: 5 µg/mL) met 5 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg de oplossing aan de gerechten en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 1 h. Aspirate het materiaal van de bekleding vóór gebruik (niet te drogen).
    3. De CBMC afkomstige iPSCs tot de vitronectin-gecoat 100 mm plaat en veranderen het iPSC medium (E8) dagelijks bij 37 ° C met 10% CO2handhaven.
    4. Genereren van embryonale organen (EBs) met behulp van het protocol weergegeven in een eerdere studie15 (kort als volgt beschreven). Vouw iPSCs uit door het veranderen van het medium, totdat de cellen hebben 80% samenvloeiing bereikt. Bij 80% samenvloeiing, verwijder het medium en wassen met PBS.
    5. De cellen met 1 mL 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) behandelen. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 minuten en oogsten van de cellen met behulp van 3 mL E8 voedingsbodem. Centrifugeer de cellen bij 250 x g gedurende 2 min.
    6. De bovendrijvende substantie gecombineerd en 5 mL van E8 medium toepassen op de cellen. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en 1 x 106 cellen overbrengen in een nieuwe conische tube van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 250 x g gedurende 2 min.
    7. Resuspendeer de overgedragen cellen met 2,5 mL van EB vorming medium met 10 μM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer. Dalen 1 x 104 cellen (25 µL/druppel) op een noncoated cultuur plaat deksel met een 10-100 μl meerkanaalspipet. Formulier 100 EBs uit 1 x 106 cellen (1 x 104 cellen/1 EB). Draai de schotel en hangen de druppel aan het deksel.
      Opmerking: ROCK-remmer is nodig tijdens de stap van de bijlage bij het onderhoud en differentiatie. De ROCK-remmer alleen in de EB aggregatie stadium toevoegt.
    8. Incubeer de druppels bij 37 ° C met 5% CO2 voor 1 dag.
    9. De volgende dag, oogst de 100 EBs en ze gebruiken voor differentiatie. Het deksel van de plaat met iPSC medium (E8 medium) of PBS wassen en oogst van de inhoud ervan naar een conische tube van 50 mL. Het handhaven van het EBs op RT voor 1 min om hen settelen. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de EBs met E8 medium deze in een 90 mm petrischaal te handhaven tot de differentiatie.
  3. Differentiatie van CBMC-iPSCs in keratinocyten
    Opmerking: Voor een regeling van de Keratinocyt differentiatie van CBMC-iPSCs, Zie Figuur 1A.
    1. Oogst de 100 EBs aan een conische buis van 50 mL met iPSC medium of PBS. Zorg ervoor dat RT voor 1 min neer het EBs te regelen. Zorg ervoor dat ze zich aan de onderkant van de conische buis. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de EBs met E8 medium met 1 ng/mL bot morfogenetische eiwit 4 (BMP4). De EBs overbrengen in een 90 mm petrischaal en handhaven bij 37 ° C met 5% CO2 voor 1 dag.
    2. Jas gerechten, cultuur, gebruikmakend van type IV collageen. Bereiden van 5 mL van type IV collageen jas een schotel van 100 mm.
      1. Ontdooien en resuspendeer de type IV collageen oplossing (eindconcentratie: 50 µg/mL) met 0,05 N HCl. Voeg de oplossing aan de gerechten en Incubeer bij RT gedurende 1 h. gecombineerd het materiaal van de bekleding vóór gebruik (niet te drogen).
        Opmerking: Voordat u de platen, de afwas 3 x met PBS te verwijderen van een zuur.
    3. Oogst de EBs (stap 1.3.1) aan een conische buis van 50 mL en handhaven op RT voor 1 min om hen settelen. Zorg ervoor dat ze vestigen op de onderkant van de conische buis, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de EBs in 6 mL KDM1 met 10 µM ROCK-remmer. De EBs overbrengen in de type IV collageen beklede 100 mm schotel.
      Opmerking: Voeg het ROCK-remmer alleen het stadium EB bijlage.
    4. Tussen dagen 0 – 8, door het medium om de andere dag te KDM1 met retinoïnezuur 3 µM (RA) en 25 ng/mL elke BMP4 en EGF te wijzigen. Het handhaven van het EBs bij 37 ° C met 5% CO2.
    5. Tussen dagen 9 – 12: omzetten in het medium om de andere dag KDM2 met 3 µM RA, 25 ng/mL BMP4 en 20 ng/mL EGF.
    6. Tussen dagen 13 – 30: omzetten in het medium om de andere dag KDM3 met 10 ng/mL BMP4 en 20 ng/mL EGF.
  4. Differentiatie van CBMC-iPSC in fibroblasten
    Opmerking: Voor een regeling van de fibroblast differentiatie van CBMC-iPSCs, Zie Figuur 2.
    1. Jas cultuur gerechten, met behulp van kelder membraan matrix. Bereiden 5 mL jas een schotel van 100 mm.
      1. Ontdooien kelder membraan matrix (eindconcentratie: 600 ng/mL) en Verdun het met DMEM/F12 medium. Voeg de oplossing aan de gerechten en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten Aspirate de coating materiaal vóór gebruik (niet te drogen).
    2. Oogst de 100 EBs naar een conische tube van 50 mL, met behulp van een precisiepipet met iPSC medium of PBS. Zorg ervoor dat RT voor 1 min neer het EBs te regelen. Zorgen dat ze zich aan de onderkant van de conische buis. Verwijder het supernatant.
    3. Resuspendeer de EBs met behulp van een 1.000 µL precisiepipet in 6 mL FDM1 met 10 µM ROCK-remmer. De EBs (met medium) overbrengen in een kelder membraan 100 mm matrix beklede schotel en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Vernieuw de FDM1 elke andere dag gedurende 3 dagen.
      Opmerking: Alleen toevoegen de ROCK-remmer stadium de bijlage EB.
    4. 0.5 nM bot morfogenetische eiwit 4 (BMP 4) toevoegen aan de FDM1 tussen 4 en 6 dagen.
    5. Op dag 7, omzetten in het medium FDM2 om de andere dag voor 1 week.
    6. Op dag 14, voeg 1 mL 1 mM EDTA en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 min. oogst de cellen met 3 mL FDM2 en centrifuge op 250 x g voor 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL FDM1.
    7. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen, 2 x 106 cellen met FDM1 medium resuspendeer en overbrengen van de cellen naar de noncoated schotel. Handhaven van de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en wijzig het medium om de andere dag.
    8. Jas cultuur gerechten, met behulp van controletype I collageen. Bereiden 5 mL jas een schotel van 100 mm. Verdun controletype I collageen oplossing (eindconcentratie: 50 µg/mL) in 0,02 N azijnzuur. Voeg de oplossing aan de gerechten en Incubeer bij RT gedurende 1 h. Aspirate het materiaal van de bekleding vóór gebruik (niet te drogen).
      Opmerking: Voordat u de platen, de afwas 3 x met PBS te verwijderen van het zuur.
    9. Op dag 21, voeg 1 mL 1 mM EDTA en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 min. oogst de cellen met 3 mL FDM1 en centrifuge op 250 x g voor 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL FDM1. Graaf de cellen met behulp van een hemocytometer en de overdracht 2 x 106 cellen met het type ik 100 mm collageen beklede schotel met FDM1 medium. Handhaven van de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en wijzig het medium om de andere dag.
    10. Op dag 28, voeg 1 mL 1 mM EDTA en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 min. oogst de cellen met 3 mL FDM1 en centrifuge op 250 x g voor 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL FDM1. Tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer en 2 x 106 cellen overbrengen door een noncoated schotel met FDM1 medium. Handhaven van de cel bij 37 ° C met 5% CO2 en wijzig het medium om de andere dag.
      Opmerking: iPSC afkomstige fibroblasten vermenigvuldigen als een primaire fibroblast cellijn en passage tot 10 passages. In deze studie gebruikten we iPSC afkomstige fibroblasten van twee tot vijf passages voor verdere analyse.

2. de toepassing van gedifferentieerde cellen hiPSC afkomstige

  1. Generatie van 3D huid organoid
    1. Bereiden van geneutraliseerde type I collageen op ijs, na de aanbevelingen van de fabrikant. Als de uiteindelijke concentratie, gebruik maken van 3 mg/mL voor type I collageen (voorraad concentratie van controletype I collageen is 3,47 mg/mL), en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van het mengsel is 5 mL. Berekenen van het volume van 10 x PBS (laatste volume/10 = 0,5 mL). Berekenen van het volume van controletype I collageen moet worden gebruikt (eindvolume x laatste collageen concentratie / voorraad collageen concentratie = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Berekenen van het volume van 1 N NaOH (hoeveelheid collageen te gebruiken x 0.023 mL = 0,1 mL). Berekenen van het volume van de dH2O (eindvolume - volume van collageen - volume van 10 x PBS - volume van 1 N NaOH = 5 mL - 4,32 mL-0,5 mL 0,1 mL = 0,08 mL). Meng de inhoud van de tube en houden het op ijs totdat klaar voor gebruik.
    2. 1 mL van de EDTA toevoegen aan de fibroblasten iPSC-afgeleid uit stap 1.4.10 en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 2 min. oogst de vrijstaande cellen, cellen met behulp van een hemocytometer tellen en 2 x 105 cellen overbrengen in een nieuwe conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 2 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de cellen van de iPSC-afgeleide fibroblasten in 1,5 mL van FDM1 en het type geneutraliseerd ik collageen oplossing (1:1).
      Opmerking: Meng de oplossing voorzichtig om te voorkomen dat de bubbels.
    3. Plaats het membraan invoegen op een 6-well microplate, het mengsel overbrengen in de insert en Incubeer bij RT gedurende 30 min.
      Opmerking: Verplaats niet de platen.
    4. Na het bevestigen van de gelering, voeg toe 2 mL medium naar de top van het donormateriaal en 3 mL tot de bodem van de put. Incubeer de matrix van fibroblasten en collageen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 5-7 dagen, totdat de gelering voltooid is en niet langer contracten.
    5. Na de volledige gelering, Los de iPSC-afgeleide keratinocyten (uit stap 1.3.6) met behulp van EDTA. Voeg 1 mL EDTA en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 2 min. oogst de vrijstaande cellen tellen ze met behulp van een hemocytometer en 1 x 106 cellen overbrengen in een nieuwe conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 2 min.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer 1 x 106 cellen in 50-100 µL van lage calcium epitheliale medium 1 (EP1).
    7. Alle medium in de matrix gecombineerd (zie stap 2.1.5) en 1 x 106 cellen van de iPSC-afgeleide keratinocyten op elke laag van de fibroblast zaad. Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO2 voor 30 min.
      Opmerking: Verplaats de plaat niet en voeg niet elk medium voor de bevestiging van keratinocyt.
    8. Voeg 2 mL EP1 tot de bovenkant van het donormateriaal en 3 mL EP1 naar de bodem van de put.
    9. Na 2 dagen, gecombineerd alle medium in de membraan invoegen plaat en wijzig het medium in normale calcium EP2 voor 2 dagen.
    10. Na 2 dagen, gecombineerd alle middellange en voeg 3 mL van het cornification medium alleen aan de onderkant voor het genereren van een lucht-vloeistof-interface.
    11. De organoid 3D huid gedurende maximaal 14 dagen bij 37 ° C met 5% CO2 en wijzig het medium om de andere dag. Oogst de 3D huid-organoid door het snijden van de rand van het invoegen en gebruiken voor een verdere studie van de kleuring en huidtransplantatie.
  2. Huidtransplantatie
    1. Inademing verdoving uitvoeren op knik/scid muizen (mannelijke, 6 weken oud), met behulp van een standaard, institutioneel erkende methode. Scheren voor huidtransplantatie, de vacht van de dorsale huid van elke muis.
    2. Verwijder een sectie 1 x 2 cm van de muis in de huid, met behulp van gebogen schaar met een tang.
    3. Plaats de 3D huid CBMC-iPSC-afgeleide organoid op de site van defect en hechtdraad met behulp van de methode van een stropdas-over dressing met zijde hechtingen.
    4. Observeren van de muizen voor 2 weken en offeren ze histologische p.a.. De kleuring protocol werd gecontroleerd in eerdere studies16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Huid is samengesteld, voor het grootste deel van de epidermis en de dermis. Keratinocyten zijn de belangrijkste celtype van de epidermis en fibroblasten de belangrijkste celtype van de dermis. De regeling van Keratinocyt differentiatie is afgebeeld in Figuur 1A. CBMC-iPCSc werden onderhouden in een vitronectin-gecoate schotel (Figuur 1B). In deze studie onderscheiden we CBMC-iPSCs in keratinocyten en fibroblasten met EB vorming....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Menselijke iPSCs hebben gesuggereerd als een nieuw alternatief voor gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde17. Gepersonaliseerde iPSCs patiënt afkomstige weerspiegelen patiënt kenmerken die kunnen worden gebruikt voor de modellering van de ziekte, drug screening, en autologe transplantatie18,19. Het gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs kan ook problemen met betrekking tot de primaire cellen, een gebrek aan voldoende cel nummers en immuu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het Korea gezondheidszorg Technology R & D Project, ministerie van volksgezondheid, welzijn en familie zaken, Republiek Korea (H16C2177, H18C1178).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AdenineSigmaA2786Component van differentiatiemedium voor fibroblast
AggreWell Medium (EB formatiemedium)STEMCELL05893EB formatie
Anti-Fibronectin antilichaamabcamab23750Fibroblast marker
Anti-KRT14 antilichaamabcamab7800Keratinocytmarker
Anti-Loricrine antilichaamabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 antilichaamabcamab124762Keratinocytmarker
Anti-Vimentin antilichaamSanta cruzsc-7558Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Verband
Basement membrane matrix (Matrigel)BD354277Component van differentiatiemedium voor fibroblast
BLACK SILK sutureAILEEESK617Huidtransplantatie
CaCl2SigmaC5670Component van epitheelmedium voor 3D huid organoïde
Collageen type IBD3542363D huid organoïde
Collageen type IVSanta-cruzsc-29010Component van differentiatiemedium voor keratinocyt
Gedefinieerd keratinocyt-Serum Vrij MediumGibco10744-019Component van differentiatiemedium voor keratinocyt
DMEM, hoge glucoseGibco11995065Component van differentiatiemedium
DMEM/F12 MediumGibco11330-032Component van differentiatiemedium
Essential 8 mediumGibcoA1517001iPSC medium
FBS, GekwalificeerdCorning35-015-CVComponent van differentiatiemedium voor fibroblast en keratinocyt
Glutamax Supplement Gibco35050061Component van differentiatiemedium voor fibroblast
InsulinInvtrogen12585-014Component van differentiatiemedium voor fibroblast en keratinocyt
Iris standaard gebogen schaarProfessionalPC-02.10Chirurgisch instrument
Keratinocyt Serum Vrij MediumGibco17005-042Component van differentiatiemedium voor keratinocyt
L-ascorbinezuur 2-fosfata sesquimagnesium zout hydraatSigmaA8960Component van differentiatiemedium voor keratinocyt
MEM Niet-Essentiële AminozuurGibco1140050Component van differentiatiemedium voor fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cmHIROSEHC 2265-1Chirurgisch instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/JThe Jackson Laboratory001303Muisstam voor huidtransplantatie
Petri schotel 90 mmHyundai MicroH10090Kunststof gereedschap
Recombinant Human BMP-4R&D314-BPComponent van differentiatiemedium voor keratinocyt
Recombinant human EGF eiwitR&D236-EGComponent van differentiatiemedium voor keratinocyt
Retinoic acidSigmaR2625Component van differentiatiemedium voor keratinocyt
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100Kunststof gereedschap
TransferrinSigmaT3705Component van epitheelmedium voor 3D huid organoïde
Transwell-COL collageen-gecoate membraan inserts CorningCLS3492Kunststof gereedschap voor 3D huid organoïde 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC cultuur
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC cultuur

Referenties

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

mononucleaire cellen uit navelstrengbloed3D-huidorganoïdekeratinocytdifferentiatiefibroblastdifferentiatievorming van embryonale lichamentype I collageentype IV collageenROCK-remmerBone Morphogenetic Protein 4
Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.