Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

Samenvatting

De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.

Samenvatting

Dit werk toont een nieuwe methode voor het meten van de stabiliteit van de enzymactiviteit door isothermische titratie calorimetrie (ITC). De piek warmteverbruik waargenomen na een enkele injectie van het substraat oplossing in een oplossing van het enzym is gecorreleerd met enzymactiviteit. Meerdere injecties van het substraat in dezelfde enzym oplossing na verloop van tijd weergeven het verlies van de enzymactiviteit De bepaling is autonoom, waarvoor weinig personeel tijd, en is van toepassing op de meeste media en enzymen.

Inleiding

Enzymen zijn eiwitten staat een breed scala aan organische reacties te katalyseren. De meeste enzymen functie in waterige oplossing bij in de buurt van neutrale pH dus het vermijden van het gebruik van agressieve oplosmiddelen. Vanwege hun hoge selectiviteit, enzym-gekatalyseerde reacties produceren minder (in sommige gevallen geen bijproducten) bijproducten dan niet-selectieve katalysatoren zoals zuren en basen¹. Dit is vooral relevant in de voedingsmiddelen verwerkende waar alle chemische reacties moeten gebeuren zodat het uiteindelijke product veilig voor menselijke consumptie is. Op dit moment worden enzymen gebruikt voor het produceren van hoge fructose corn siroop², kaas³, bier⁴, lactose-vrij melk⁵en andere belangrijke voedingsmiddelen. Hoewel dit document richt zich op enzym gebruik in de voedingsindustrie, zijn er vele andere toepassingen voor enzymen waaronder in groene chemie en drug synthese.

Het nut van enzymen wordt beperkt door de stabiliteit van de enzymactiviteit, die afhangt van het behoud van de driedimensionale structuur van het enzym. De structuur van het enzym kan worden gestabiliseerd door wijzigingen zoals PEGylation⁶, immobilisatie op een stevige steun⁷, genetische modificaties⁸en formuleringen. Momenteel, enzym stabiliteit wordt meestal gemeten door differentiële scanning calorimetrie (DSC) en eindpunt enzymactiviteit testen⁹. DSC meet de temperatuur waarbij een enzym ontvouwt; Hoe hoger de temperatuur, hoe meer stabiele de structuur. Verlies van activiteit treedt echter vaak op bij een lagere temperatuur dan nodig te ontvouwen de enzym of domeinen binnen de enzym-¹⁰. DSC is daarom niet voldoende om te bepalen of een wijziging van het enzym de stabiliteit van de enzymactiviteit verhoogt. Eindpunt enzym testen zijn meestal tijd intensieve, vereisen meerdere monsters, en vaak een gekoppelde colorimetrische reactie die geldt niet voor zeer gekleurd of ondoorzichtig oplossingen of schorsingen te betrekken.

Dit werk wordt een methode voor rechtstreekse meting van de stabiliteit van de enzymactiviteit gedemonstreerd door isothermische titratie calorimetrie (ITC). ITC meet de snelheid hitte vrijgegeven of geabsorbeerd in de loop van een reactie. Aangezien bijna alle reacties produceren of warmte absorberen, kan ITC worden gebruikt voor de meeste enzym-gekatalyseerde reacties, met inbegrip van de reacties die niet over een gekoppelde reactie of optreden in ondoorzichtige media zoals melk. ITC is gebruikt voor vele decennia voor het meten van chemische kinetische parameters voor vele soorten reacties, maar het protocol hier gepresenteerd richt zich op het gebruik van ITC voor het meten van het warmteverbruik van de piek van enzym-gekatalyseerde reacties en toont aan dat de enzymactiviteit lineair is gecorreleerd met de pieksnelheid voor warmte. ITC metingen van piek warmte tarieven zijn meestal autonome en weinig personeel tijd nodig om te installeren en te analyseren.

Protocol

1. voorbereiding van de monsters

1. 1000 mL 0,1 M natrium acetaat buffer met een pH van 4.6
   1. 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL studeerde af te meten.
   2. Weeg 8,2 g watervrij natriumacetaat en toe te voegen aan het bekerglas.
   3. Plaats het bekerglas op een bord roer, breng een roer in het bekerglas, zet op het roer plaat en roer tot het volledig is opgelost.
   4. Wanneer de watervrije Natriumacetaat volledig is opgelost, wordt de pH van de oplossing met een gekalibreerde pH-meter.
   5. Voeg 1 M HCl of NaOH dienovereenkomstig te verkrijgen van de gewenste pH 4.6.
   6. Voeg gedistilleerd water totdat het totale volume 1000 mL is.
   7. Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik.
2. Enzym oplossing
   1. 10 mL van de cilinder van de oplossing binnen het bereik van de 10-30 mg/mL door eerste meten 8 mL van de 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 in een 15 mL studeerde enzym voor te bereiden.
   2. Bufferoplossing toevoegen in een conische tube van 15 mL met enzym en schud krachtig totdat het enzym heeft opgelost.
   3. Voeg meer bufferoplossing totdat het totale volume 10 mL is.
   4. De enzym-oplossing bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
3. Substraat oplossing
   1. Ter voorbereiding van een substraat oplossing binnen het bereik van 300-600 mM, berekent het bedrag van substraat nodig om de gewenste concentratie in gram.
   2. Weeg af uit het substraat en breng in een bekerglas van 100 mL glas
   3. Meten van 20 mL van de bufferoplossing met behulp van een 25 mL studeerde aan de cilinder en vervolgens toevoegen aan het glas bekerglas.
   4. Plaats het bekerglas op een roer-plaat en breng een magnetische roer af in het bekerglas. Zet de warmte en de opzwepende snelheid dienovereenkomstig aan te passen.
   5. Toestaan om te blijven totdat het substraat is opgelost.
   6. Giet de substraat oplossing in een conische tube van 50 mL en Voeg 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 totdat het totale volume 45 mL is. Meng door schudden.
   7. Het substraat oplossing bij kamertemperatuur bewaren tot gebruik.

2. uitvoeren van het experiment

1. Voorbereiding van het ITC-instrument
   1. Zorg ervoor dat de referentie cel is geladen met 350 µL van gedistilleerd water. Voordat het enzym in de steekproef cel laden, controleert u of dat de steekproef-cel is schoongemaakt.
   2. Schoonmaak protocol-Fill de laden spuit met 500 µL van 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), schuif voorzichtig de naald in de monster-cel, vult u de cel en Verwijder langzaam de vloeistof met behulp van de dezelfde spuit. Het afvoeren van de vloeistof in een bekerglas. Herhaal deze stap tweemaal met 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), driemaal met 70% ethanol en vervolgens tien keer wassen met gedestilleerd water.
   3. Vul de spuit laden met 450 µL van enzym oplossing, zorgvuldig de naald helemaal naar de onderkant van het monster cel invoegen en druk op de zuiger naar de 100 µL regel langzaam om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.
   4. Spoel de injectiespuit 50 µL titratie met gedestilleerd water driemaal door het plaatsen van de naald-tip in water langzaam inneemt van het water in de spuit vervolgens, verstrekking van het water in een afvalcontainer.
   5. Verwijder Residuele water door te spoelen met substraat oplossing driemaal.
   6. Vul de spuit titratie met substraat oplossing door te tekenen van de oplossing tot de spuit volledig zonder eventuele luchtbellen is.
   7. Met de spuit nog steeds in het substraat oplossing, verwijder de zuiger en toestaan van ongeveer 2 µL van lucht voor het invoeren van de top van de spuit en opnieuw de plunjer.
   8. Verwijder het handvat van de buret van het ITC, plaatst u de spuit in de buret greep en schroef tot strak.
   9. Het puntje van de roerder met een pluisvrije weefsel, veeg dan zorgvuldig de buret greep plaats in de ITC-instrument en het vergrendelen.

3. het opzetten van ITCrun

1. Open ITCrun op de computer en klikt u op instellen.
2. Klik onder roeren tarief en stel tot 350 tpm. Controleer de grootte van de spuit (µL) en controleer dat het bedraagt 50 µL.
3. De temperatuur en druk op Update. Het wordt aanbevolen dat deze stap worden uitgevoerd ten minste 1 uur vóór de voorbereiding van het ITC. Dit laat voldoende tijd voor het instrument opwarmen of afkoelen zo nodig.
4. Voor de instellingen van het experiment, selecteert u incrementele titratie.
5. Klik op Invoegen om de opstelling van de injecties. Aanpassen van de interval van de injectie tot 5.400 s, geïnjecteerde volume (µL) tot 4 en aantal injecties tot en met 4. Druk op OK om de instellingen te bevestigen.
6. Selecteer in het vak van de evenwichtsinstelling, Auto-equilibreer en Large verwacht heats. (Als de verwachte voorrondes klein zijn, een kleine kunt selecteren onder verwachte heats; maar dit zal de verhoging van de equilibratietijd.)
7. De eerste basislijn ingesteld op 300 s.
8. Om te beginnen met de uitvoering, klik het begin symbool naast roeren tarief en klikt u op Start naast de moersleutel symbool.
9. Sla het bestand op en laat het instrument uit te voeren.

4. het analyseren van gegevens

1. Open het bestand in NanoAnalyze. Klik op gegevens en selecteert u gegevenskolommen.
2. Selecteer alle gegevens, kopieer en plak de gegevens in Microsoft Excel.
3. Nul basislijn aanpassen door de waarde bij 300 vereist s te maken nul. Deze correctie toepassen op de hele kolom met warmte tarief waarden.
4. Vindt u de waarde van de minimum- of maximumwaarde van het warmteverbruik voor elke injectie met behulp van de vergelijking: =MIN(cell:cell) of MAX(cell:cell). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de piek enzymatische activiteit van het enzym bij elke injectie.
5. Plot de grafieken van de MIN of MAX waarden tegen de tijd waarop de waarde heeft plaatsgevonden tijdens de titratie.

Resultaten

De representatieve resultaten in Figuur 1 en Figuur 5 worden gegevens uit twee enzymen, lactase en invertase verschijnen. Lactase en invertase katalyseren de hydrolyse van een disaccharide in twee monosacchariden, endothermically en exotherm, respectievelijk. Beide enzymatische reacties werden uitgevoerd bij concentraties die uitgesloten van de verzadiging van het enzym.

De lactase gegevens aantonen hoe ITC gegevens kunnen worden gebr...

Discussie

Een groot voordeel van de ITC enzym stabiliteit test hier beschreven is automatisering. Zodra alle passende buffers en oplossingen zijn gemaakt, is de tijd van de set-up voor elke assay ongeveer 15 min. voor de persoon die de test doet. In tegenstelling, de conventionele testen voor invertase en lactase-activiteit vereisen ongeveer 2 h met voortdurende betrokkenheid van de persoon die de test doet en veel enzymatische activiteit testen nemen aanzienlijk meer manuren. In een eerdere publicatie, hebben wij aangetoond hoe g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
a-Lactose	Fisher Scientific	onbekend (te oud)	500g
Sodium Acetaat, Watervrij 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrochloorzuur Oplossing, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (reinigingsoplossing)