Methodenartikel

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

DOI:

10.3791/59321

⸱

1 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt een snelle en efficiënte omzetting van geïnduceerde pluripotente stamcellen in motorische neuronen met een wervelkolom of schedel identiteit, door buitenbaarmoederlijke expressie van transcriptiefactoren van afleidbaar piggyBac vectoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een methode om functionele spinale en craniale motor neuronen te verkrijgen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Directe omzetting in motor neuron wordt verkregen door een buitenbaarmoederlijke expressie van alternatieve modules van transcriptiefactoren, namelijk Ngn2, Isl1 en Lhx3 (NIL) of Ngn2, Isl1 en Phox2a (NIP). NIHIL en NIP specificeren, respectievelijk, spinale en craniale motor neuron identiteit. Ons protocol begint met de generatie van gemodificeerde iPSC lijnen waarin nihil of NIP stabiel zijn geïntegreerd in het genoom via een piggyBac transposon vector. Expressie van de transgenen wordt vervolgens geïnduceerd door doxycycline en leidt, in 5 dagen, tot de omzetting van iPSCs in MN progenitoren. Latere rijping, voor 7 dagen, leidt tot homogene populaties van spinale of craniale MNs. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere protocollen: het is zeer snel en vereenvoudigd; het vereist geen virale infectie of verdere MN isolatie; het maakt het genereren van verschillende MN sub-populaties (spinale en craniale) met een opmerkelijke mate van rijping, zoals blijkt uit de mogelijkheid om treinen van actiepotentialen brand. Bovendien kan een groot aantal motor neuronen worden verkregen zonder zuivering van gemengde populaties. iPSC-afgeleide spinale en craniale motor neuronen kunnen worden gebruikt voor in vitro modellering van Amyotrofische laterale sclerose en andere neurodegeneratieve ziekten van de motor neuron. Homogene motor neuron populaties kunnen vertegenwoordigen een belangrijke bron voor cel type specifieke drug screenings.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motor neuron (MN) degeneratie speelt een oorzakelijke rol bij menselijke ziekten, zoals amyotrofische lateraal sclerose (ALS) en spinale spieratrofie (SMA). Het opzetten van geschikte in vitro Cell modelsystemen die de complexiteit van de menselijke MN recapituleren is een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zijn begiftigd met opmerkelijke plurilineage differentiatie eigenschappen, zijn nu afgeleid van een aantal patiënten die getroffen zijn door motor neuron ziekten1,2. Extra iPSC lijnen die pathogene mutaties in verband met MN ziekten zijn gegenereerd door het bewerken van genen, te beginnen van de controle "gezonde" pluripotente stamcellen3. Deze lijnen vertegenwoordigen nuttige hulpmiddelen voor in vitro Disease modellering en drug screening, op voorwaarde dat passende methoden voor iPSC differentiatie in MNs beschikbaar zijn. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze methode is om de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd in MN ziekten met een snelle en efficiënte differentiatie protocol die aanleiding geven tot volwassen functionele MNs te bieden. Het eerste voordeel van deze methode is het tijdsbestek van de uitvoering. Een ander relevant punt van sterkte komt uit de afschaffing van om het even welke reinigingsstap. Ten slotte kan het protocol worden gebruikt om twee verschillende populaties van motorische neuronen te genereren.

De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypen van MNs is bijzonder relevant voor het modelleren van MN ziekten. Niet alle MN subtypen zijn even kwetsbaar in ALS en SMA en het begin van de symptomen in verschillende motor units sterk van invloed op de prognose. In ALS, spinale begin met symptomen die beginnen in de bovenste en onderste ledematen leidt tot de dood in ongeveer 3-5 jaar4. Omgekeerd, bulbaire begin, te beginnen met degeneratie van craniale MNs, heeft een slechtste prognose. Bovendien is het percentage van bulbaire begin significant hoger bij patiënten met mutaties in de RNA-bindende eiwitten FUS en TDP-43 dan bij personen met SOD1 mutaties5. Bijna de totaliteit van alternatieve MN differentiatie protocollen is gebaseerd op de activiteit van retinoic zuur (RA), die een spinale karakter verleent aan differentiëren iPSCs6,7,8. Dit beperkt de mogelijkheid van het bestuderen van intrinsieke factoren, die kunnen worden beschermend in specifieke MN subtypen9,10.

In overeenstemming met een eerdere werk in de muis embryonale stamcellen11, hebben we onlangs aangetoond dat in de menselijke iPSCs buitenbaarmoederlijke expressie van Ngn2, Isl1 en LHX3 (Nil) induceert een spinale MN identiteit, terwijl Ngn2 en Isl1 plus PHOX2A (NIP) specificeren craniale MNs12. We hebben dus ontwikkelde een efficiënt protocol, wat leidt tot de productie van menselijke MNs begiftigd met functionele eigenschappen in een 12 dagen turnaround. Het doel van deze methode is om, in een korte tijd en zonder de noodzaak voor de reiniging (bijv. door FACS), cel populaties zeer verrijkt voor MNs met spinale of craniale identiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. onderhoud van de menselijke iPSCs

  1. Bereiding van matrix gecoate platen
    1. Dooi één 5 mL flacon van matrijs (Zie de lijst van materialen) bij 4 °c 's nachts. De originele matrijs voorraden komen op verschillende voorraad concentraties en de hoeveelheid wordt gemaakt volgens de verdunningsfactor die op het gegevensblad wordt vermeld, specifiek voor de individuele partij. Het is belangrijk om de flacon en de buizen ijskoud te houden om vroegtijdige geleer van de matrix te voorkomen. Doseer de matrix in de voor gekoelde cryobuizen op het ijs. Bevriezen ongebruikte fracties bij-20 °C.
    2. Plaats één hoeveelheid ijs voor ongeveer 2 uur om te ontdooien.
    3. Verdun de hoeveelheid matrix met 20 mL koude DMEM/F12 in een conische buis van 50 mL.
    4. Meng goed en verdeel 1 mL verdunde matrix in 35 mm schotels (equivalente hoeveelheden per oppervlakte van andere gerechten).
    5. Houd de afwas met verdunde matrix voor 1 h bij kamertemperatuur om coating mogelijk te maken.
      Opmerking: Gerechten, verzegeld met Parafilm, kunnen worden opgeslagen bij 4 °C voor maximaal 2 weken.
  2. Voor bereiding van de stockoplossing (20 ml) en 1x werk hoeveelheid van de zachte cel dissociatie reagens (Zie de lijst van materialen).
    1. Los poeder op 10 mg/mL in PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
    2. Filter steriliseren door middel van een 0,22 μm filter membraan.
    3. Bereid 20 maal (1 mL per stuk) en bewaar bij-20 °C.
    4. Verdun vóór gebruik één hoeveelheid in PBS (CA2 +/mg2 + Free) tot 1 mg/ml (1x werk hoeveelheid).
      NB: 1x werk hoeveelheid kan maximaal 2 weken bij 4 °c worden opgeslagen.
  3. Passaging menselijke iPSCs.
    1. Voor aanvang: indien opgeslagen bij 4 °C, pre-warm matrijs-met een laag bedekte platen in de incubator bij 37 °C voor 20-30 min. pre-warm bij kamertemperatuur de hoeveelheid menselijk iPSC middel (Zie vereiste lijst van materialen). Pre-warm de DMEM/F12.
    2. Aspireren cultuurmedium.
    3. Spoel iPSCs met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
    4. Voeg 1x zachte dissociatie oplossing toe (0,5 mL voor een 35 mm schotel). Incubeer bij 37 °C tot de randen van de kolonies beginnen te losmaken van de plaat, gewoonlijk 3-5 min.
    5. Aspireren de zachte dissociatie oplossing, oplettend om iPSC kolonies niet los te koppelen.
    6. Was de cellen met DMEM/F12 (2 mL voor een 35 mm schotel) en aspireren wordt voorzichtig niet te ontkoppelen van de cellen. Herhaal deze stap nog een keer.
    7. Voeg humaan iPSC medium toe (1 mL voor een 35 mm schotel).
    8. Maak de kolonies voorzichtig los met een cel lifter en breng deze over naar een 15 mL Tube.
    9. Breek de cel bosjes voorzichtig door het pipetteren op en neer met een P1000 pipetter 3-4 keer.
    10. Aspireren de bovendrijvende uit de matrix beklede plaat (en).
    11. Zaad de cellen in het aangewezen cultuur volume van menselijk iPSC middel. De split ratio kan variëren van lijn tot lijn en is ongeveer 1:4-1:8. Verander het medium dagelijks.

2. generatie van NIL en NIP Afleidbaar iPSC lijnen

  1. Cel transfectie.
    1. Spoel de cellen met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
    2. Voeg cel dissociatie reagens toe (Zie de materiaallijst) (0,35 ml voor een 35 mm schotel) en Incubeer bij 37 °c tot enkele cellen gescheiden zijn (5-10 min).
    3. Voorzichtig complete cel scheiding door pipetten op en neer met een P1000 pipetter 3-4 keer.
    4. Verzamel in een 15 mL Tube en voeg PBS (CA2 +/mg2 + gratis) toe aan 10 ml. Tel de cellen.
    5. Pellet 106 cellen en opnieuw op te schorten in 100 l van buffer R (opgenomen in de cel Electroporation Kit, Zie tabel van materialen).
    6. Voeg plasmide DNA toe voor Transfectie: 4,5 μg van transponerende vector (epB-BSD-TT-NIL of epB-BSD-TT-NIP12) en 0,5 μg van piggyBac transposase plasmide13.
    7. Transfect met de cel Electroporation systeem (Zie tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant en zoals eerder beschreven3 met de volgende parameters: 1.200 V spanning, 30 MS breedte, 1 puls. Zaad van de cellen in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 μM Y-27632 (ROCK-remmer, Zie tabel van materialen) in een 6 mm matrix-gecoate schotel.
  2. Selectie met antibiotica.
    1. Voeg twee dagen na transfectie 5 μg/mL blasticidin toe aan het kweekmedium.
    2. De meeste van de niet-transfected cellen zullen sterven binnen 48 h van blasticidin selectie. Houd de cellen in blasticidin gedurende ten minste 7-10 dagen te Counter-Selecteer de cellen die niet hebben geïntegreerd de transgenes in het genoom.
    3. Handhaaf stabiel transfected cellen als gemengde bevolking, die uit cellen met verschillend aantal genen en verschillende integratie plaatsen wordt samengesteld, of isoleert enige klonen.
    4. Bereid een extra schotel om te controleren op effectieve expressie van de transgenen, op 1 μg/mL doxycycline inductie, door RT-PCR met transgene-specifieke primers voor Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Omgekeerde: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), zoals eerder beschreven12.
    5. In dit stadium, bevriezen de voorraden van de roman NIL-en NIP-iPSC lijnen in bevriezend middel voor menselijke iPSCs (Zie lijst van materialen).

3. motor neuron differentiatie

  1. Scheid de cellen met het reagens van de cel dissociatie zoals beschreven (stappen 2.1.1.-2.1.3.). Verzamel gescheiden cellen in een 15 mL buis en Verdun met 5 volumes van DMEM/F12. Pellet de cellen en opnieuw op te schorten in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Tel de cellen en zaad op matrix-gecoate gerechten bij een dichtheid van 62.500 cellen/cm2.
  2. De dag na, vervang het medium met DMEM/F12, aangevuld met 1x stabiele L-glutamine analoog, 1x niet-essentiële aminozuur (NEAA) cel cultuur aan te vullen en 0,5 x penicilline/streptomycine, en met 1 μg/mL doxycycline. Dit wordt beschouwd als dag 0 van differentiatie. Op dag 1, vernieuw het medium en doxycycline.
  3. Op dag 2, verander het medium om Neurobasal/B27 medium (Neurobasal medium aangevuld met 1x B27, 1x stabiele L-glutamine analoog, 1x NEAA en 0,5 x penicilline/streptomycine), met 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 en 1 μg/mL doxycycline (Zie tabel van materialen ). Vernieuw het medium en doxycycline elke dag tot dag 5.
  4. Dag 5: cellen dissociatie met cel dissociatie reagens (Zie de lijst van materialen).
    1. Spoel de cellen met PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
    2. Voeg cel dissociatie reagens (0,35 mL voor een 35 mm schotel) en Incubeer bij 37 °C tot de gehele cel monolayer scheidt van de schotel. Merk op dat enkele cellen niet worden gescheiden tijdens de incubatie.
    3. Voeg 1 mL DMEM/F12 toe en verzamel de cellen in een buis van 15 mL.
    4. Voorzichtig complete cel scheiding door pipetten op en neer met een P1000 pipetter 10-15 keer.
    5. Voeg 4 mL DMEM/F12 toe en Tel de cellen.
    6. In dit stadium, bevriezen motor neuron progenitoren in cel bevriezing medium (Zie tabel van materialen), volgens de fabrikant instructies.
    7. Pellet de cellen en opnieuw op te schorten in neuronale medium (Neurobasal/B27 medium aangevuld met 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF en 200 ng/mL L-ascorbinezuur, Zie tabel van materiaals) aangevuld met 10 μM Rock-remmer.
    8. Zaad de cellen op poly-Ornithine/laminin-of alternatief op matrijs-met een laag bedekte steunen bij de dichtheid van 100.000 cellen/cm2. Gebruik µ-dia plastic steunen met polymeer dekglaasje (Zie lijst van materialen) voor immunokleuring analyse.
  5. Op dag 6, verander het medium met verse neuronale medium verstoken van ROCK-remmer. Op de volgende dagen, Vernieuw de helft van het medium om de 3 dagen. Het medium van de cultuur moet zeer zorgvuldig worden veranderd om detachement van de oppervlakte te verhinderen.

4. immunokleuring analyse

  1. Cel fixatie. Spoel de cellen met PBS (met CA2 +/mg2+) en incubeer voor 15 min in 4% Paraformaldehyde in PBS (met CA2 +/mg2 +) bij kamertemperatuur.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig en verdacht om kanker te veroorzaken. Vermijd contact met huid en ogen en handvat onder een chemische rook kap.
  2. Permeabilize met PBS (met CA2 +/mg2 +) met 0,1% Triton X-100 voor 5 min bij kamertemperatuur.
  3. Incubeer voor 30 min bij kamertemperatuur in antilichaam blokkerende oplossing (ABS: 3% BSA in PBS met CA2 +/mg2 +).
  4. Incubeer voor 1 h bij kamertemperatuur met primaire antilichamen in ABS: anti-TUJ1 (1:1000; konijn) en anti-Oct4 (1:200; muis) of anti-PRAATJE (anti-choline Acetyltransferase; 1:150; geit). Zie de lijst van materialen.
  5. Incubeer voor 45 min bij kamertemperatuur met het aangewezen ezel secundaire antilichaam paar in ABS: anti-muis Alexa Fluor 647 (1:250), anti-konijn Alexa Fluor 594 (1:250) en anti-geit Alexa Fluor 488 (1:250). Zie de lijst van materialen.
  6. Incubeer in 0,4 μg/mL DAPI voor 5 min bij kamertemperatuur om kernen te labelen.
  7. Monteer de cellen met een bevestigings medium (Zie de materiaallijst) voorbeeld vorming bij een fluorescentiemicroscoop.

5. functionele karakterisering via flard-klem opnamen

  1. Bereid de HEPES-geëquilibreerd externe oplossing (NES) als volgt voor: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 10 mm Hepes, en 10 mm glucose. Stel de osmolariteit tussen 290-300 mΩ. Stel de pH in op 7,3 met behulp van 1N NaOH en bewaar de oplossing bij 4 °C.
  2. Bereid de interne oplossing voor: 140 mM K-gluconaat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm Hepes, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Pas de pH aan 7,3 met 1M KOH en controleer of de osmolariteit is ingesteld op ongeveer 290 mΩ. Bevriezen van de oplossing bij-20 °C in kleine fracties.
  3. Voor het uitvoeren van de experimenten, pre-warm de NES oplossing in een waterbad tot ongeveer 28-30 ° c.
  4. Trek enkele borosilicaatglas micropipetten (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) voorzien van een tip weerstand: 5-6 MΩ en vul met de intracellulaire oplossing alvorens in de pipet houder te monteren.
    Opmerking: Vergeet niet om chloride zilveren draden van de opname-elektrode en referentie-elektrode in bleekmiddel voor ten minste 30 min om een uniforme laag van AgCl op het draad oppervlak te vormen.
  5. Breng de Petri schaal in de opname kamer over en laat de kamer met de NES oplossing op 1-2 mL/min. Laat de stroom passeren een inline kachel ingesteld op temperatuur van 30 ° c om de oplossing warm te houden.
  6. Plaats elektrofysiologische opname kamer onder een rechte Microscoop. Record membraan stromingen met de patch-klem versterker en het verwerven van gegevens met een passende software.
  7. Open de software voor de versterker besturing en stel de signaal winst op waarde 1 en het Bessel-filter in op 10 kHz. Zorg ervoor dat het Bessel-filter 2,5 keer lager is dan de bemonsteringsfrequentie.
  8. Stel de experimentele protocollen voor spanning-klem en stroom-klem experimenten in de opname software.
  9. In het protocolinstelling, Tick episodische stimulatie-modus en stel de sampling frequentie op 25 kHz. Dan, ga naar de golfvorm tab en typ de spanning of de huidige stap amplitude en lengte als volgt.
  10. Voor de voltage-gated natrium stromingen, gebruik 15 spannings stappen (50 MS duur elk) van-100 mV tot + 40 mV (10 mV Increment). Voer het protocol na het opleggen van de gepatchte cel een holding potentieel van-60 mV via de versterker. Ook de voltage-gated kalium stromen worden opgeroepen door spannings stappen (250 MS duur elk) van-30 mV tot + 50 mV (10 mV Increment) die de opgenomen cel-40 mV.
  11. Voor het onderzoeken van de vuren eigenschappen van iPSC-afgeleid craniale en spinale MNs, de cellen van de klem, in stroom-klem wijze, bij een membraan potentieel van-70 mV en gebruik 4 huidige impulsen (1 s duur elk) van stijgende omvang (van + 20 pA aan + 80 pA; 20 pA toename).
  12. Verwerf voor elke cel voltage-geactiveerde stromen, opgeroepen vuren activiteit en drie passieve eigenschappen als gehele-cel capaciteit (cm), de weerstand van de celmembraan (RM) en rustend membraan potentieel (RMP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische beschrijving van de differentiatie methode wordt weergegeven in Figuur 1. Human iPSCs (WT I lijn3) werden transfected met EpB-BSD-TT-Nil of EpB-BSD-TT-NIP, het genereren, op blasticidin selectie, stabiel en afleidbaar cel lijnen12, hierna aangeduid als iPSC-Nil en iPSC-NIP, respectievelijk. Onderscheidende cellen werden gekenmerkt voor de uitdrukking van de pluripotentie marker OCT4 en de pan-neuronale marker TUJ1. Immunokleuri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt het mogelijk om efficiënt te converteren menselijke iPSCs in spinale en craniale motor neuronen dankzij de buitenbaarmoederlijke expressie van Lineage-specifieke transcriptiefactoren. Deze transgenen worden afleidbaar door doxycycline en stabiel geïntegreerd in het genoom dankzij een piggyBac op transposon gebaseerde vector. In een gemengde populatie, zal een of meerdere exemplaren van de piggyBac vector willekeurig worden geïntegreerd in het genoom van de individuele cellen, het verhogen van het risic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de Imaging Facility te bedanken bij Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, voor ondersteuning en technisch advies. Wij zijn dankbaar voor de leden van het centrum voor het leven nano wetenschap voor nuttige discussie. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een toelage van AriSLA (proef toelage 2016 "StressFUS") aan AR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1Gchemicals voor elektrofysiologische oplossingen
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML Celdissociatiereagens
anti-CHATEMD Millipore AB144PAnti-Choline Acetyltransferase. Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_2079751; Lotnummer: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken. RRID: AB_2534102; Lotnummer: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken. RRID: AB_162542; Lotnummer: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_398736; Lotnummer: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. Lotnummer: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594 Immunological SciencesIS-20152-1Secundair antilichaam gebruikt voor immonofluorescentieonderzoeken
anti-TUJ1 Sigma-Aldrich T2200Primair antilichaam gebruikt in immunokleuringsonderzoeken. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566Serumvrij supplement voor het onderhouden van neuronale cellen
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Celvriesmedium, hier gebruikt voor motorische neuron voorlopers
BDNFPreproTech450-02Brain-Derived Neurotrophic Factor
BlasticidinSigma-Aldrich203350Nucleosidische antibiotica die eiwitsynthese in prokaryoten en eukaryoten remmen
BSASigma-AldrichA2153Bovien Serum Albumine. Blocking agent om niet-specifieke binding van antilichamen in immunokleuringsonderzoeken te voorkomen
CaCl2Sigma-AldrichC3881chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
Clampex 10 softwareMolecular DevicesClampex 10Membranstromen opnamesysteem
Corning Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Gereconstitueerde basale membraanvoorbereiding uit het Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muissarcoom. Gebruikt voor het hechten van iPSC aan plastic en glazen ondergronden
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EVriesmedium voor humane iPSC's
D-GlucoseSigma-AldrichG5146chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
DAPI poederRoche102362760014',6-diamidino-2-fenylindole. Fluorescente kleurstof die bindt aan adenine-thymine rijke gebieden in DNA, gebruikt voor kleuring van kernen in immonofluorescentieonderzoeken
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005Gamma secretase inhibitor
DispaseGibco17105-041Reagens voor zachte dissociatie van humane iPSC's
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLBasismedium voor celkweek
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1G Gebruikt om expressie van transgenen uit epB-Bsd-TT-NIL en epB-Bsd-TT-NIP vectoren te induceren
DS2U WiCellUWWC1-DS2UCommerciële menselijke iPSC lijn
E.Z.N.A Total RNA Kit Omega bio-tekR6834-02Kit voor totale extractie van RNA uit gekweekte eukaryotische cellen
GDNFPreproTech450-10Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Commerciële menselijke iPSC lijn
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Een alternatief voor L-glutamine met verhoogde stabiliteit. Verbetert celgezondheid.
HepesSigma-AldrichH4034chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR Bio-Rad1708841Kit voor genexpressieanalyse met behulp van real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad172-5121 Klaar voor gebruik reactie master mix geoptimaliseerd voor kleurstof-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR) op elk real-time PCR instrument
K-GluconateSigma-AldrichG4500chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
KClSigma-AldrichP9333chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
L-ascorbinezuurLKT LaboratoriesA7210Gebruikt in celkweek als antioxidant
LaminineSigma-Aldrich11243217001Bespoedigt hechting en groei van neurale cellen in vitro
Laser scanning confocal microscope Olympus iX83 FluoView1200Confocale microscoop voor het verkrijgen van immunokleuringsbeelden
Mg-ATPSigma-AldrichA9187chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
MgCl2Sigma-AldrichM8266chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
Mounting Medium Ibidi50001Mounting oplossing gebruikt voor confocale microscopie en immunofluorescenceonderzoeken
Multiclamp patch-clamp versterkerMolecular Devices700BMembranstromen opnamesysteem
Na-GTPSigma-AldrichG8877chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
NaClSigma-Aldrich71376chemicals voor elektrofysiologische oplossingen
NEA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

Gerelateerde artikelen