In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen van menselijke schildklier tumorvorming als een platform voor het testen van microRNA-gebaseerde remmer behandelingen. Deze aanpak is ideaal voor het bestuderen van de functie van niet-coderende Rna's en hun potentieel als nieuwe therapeutische doelen.

Samenvatting

MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie door hun vermogen om mRNA te destabiliseren en de vertaling van doelwit Mrna's te remmen. Een toenemend aantal studies heeft miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, en ook als therapeutische doelen, waardoor een extra dimensie wordt toegevoegd aan de evaluatie en behandeling van kanker. In de context van schildklierkanker leidt tumorigenese niet alleen tot mutaties in belangrijke genen, maar ook uit de overexpressie van vele Mirna's. Dienovereenkomstig evolueert de rol van miRNAs in de controle van de schildklier genexpressie als een belangrijk mechanisme in kanker. Hierin presenteren we een protocol om de effecten van de levering van Mirna-remmers te onderzoeken als een therapeutische modaliteit bij schildklierkanker met behulp van humane tumor xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen. Na engineering stabiele schildklier tumorele cellen die GFP en Luciferase uitdrukken, cellen worden geïnjecteerd in naakt muizen om tumoren te ontwikkelen, die kan worden gevolgd door bioluminescentie. De in vivo remming van een miRNA kan tumorgroei en upregulate miRNA gentargets verminderen. Deze methode kan worden gebruikt om het belang van een bepaald miRNA in vivo te beoordelen, naast het identificeren van nieuwe therapeutische doelen.

Inleiding

Schildklierkanker is een endocriene maligniteit met een toenemende incidentie, hoewel het in algemene termen een goed resultaat heeft¹. Niettemin ontwikkelen sommige patiënten agressieve vormen van de ziekte die onbehandelbaar zijn en de moleculaire basen slecht worden begrepen².

miRNAs zijn 22-nucleotide lange niet-Codeer Rna's die de genexpressie in veel weefsels reguleren, meestal door de binding van het basis koppel aan de 3 ' untranslational Region (3 ' UTR) van de target Messenger Rna's (Mrna's), waardoor mRNA-degradatie of translationele onderdrukking wordt geactiveerd ^{3 , 4}. er is toenemend bewijs dat aantoont dat de deregulering van de microRNA-uitdrukking een kenmerk is van kanker, aangezien deze moleculen proliferatieve signalering, migratie, invasie en metastase moduleren en resistentie kunnen bieden tegen apoptosis ^5,6. In de afgelopen jaren hebben veel studies miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor kankerdiagnose en prognose, evenals therapeutische doelstellingen⁷, die een nieuwe dimensie bieden aan de evaluatie en behandeling van kanker.

miRNAs heeft een centrale plaats in humane moleculaire oncologie als belangrijkste drijfnetten voor menselijke schildklier tumoren^{8,9, 10,11,12}. Onder de miRNAs up-gereguleerd, is miR-146b sterk overuitgedrukt in papillaire schildkliercarcinoom (PTC) tumoren en bleek de celproliferatie significant te verhogen en geassocieerd te worden met agressiviteit en Dismal prognose^{6, 12 , 13 , 14 , 15}. Bovendien regelt miR-146b verschillende schildklier genen die betrokken zijn bij differentiatie¹², en ook belangrijke tumor SUPPRESSOR genen zoals PTEN¹⁶ en DICER1¹⁷. Ondanks hun belang in de Kankerbiologie, miRNA gebaseerde kankertherapie is nog in zijn vroege stadia, en zeer weinig studies hebben aangepakt schildklierkanker-de meest frequente van de endocriene tumoren¹⁸. Hier beschrijven we een protocol met behulp van twee verschillende Muismodellen met mens-afgeleide tumoren, waarin de toediening van een synthetische miRNA-remmer (antagomiR) die specifiek een cellulaire miRNA remt kan tumorgroei blokkeren. We eerst gebruikt een gemeenschappelijk xenotransplantaatmodellen is model, en de lokale intratumor administratie van een antagomir verminderde tumorgroei gemeten als een afname van de tumor bioluminescentie¹⁶. Omdat de oprichting van robuuste Muismodellen die de menselijke tumorprogressie nabootsen essentieel is om unieke therapeutische benaderingen te ontwikkelen, is orthotopic implantatie van primaire menselijke tumoren een waardevoller platform voor klinische validering van nieuwe geneesmiddelen dan subcutane implantatie modellen. Om het therapeutische potentieel van de antagomiR beter te kunnen beoordelen, gebruikten we dus een orthotopic muismodel met systemische toevoer in de bloedstroom, waarbij dezelfde resultaten werden verkregen.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het Europese Gemeenschapsrecht (86/609/EEG) en de Spaanse wet (R.D. 1201/2005), met goedkeuring van de ethische commissie van de Consejo Superior de onderzoekt Aciones Científicas (CSIC, Spanje).

1. flank inoculatie van cellen en intratumoral antagomiR behandeling

1. Voorbereiding van de cel
   1. Ingenieur een Cal62 menselijke schildklierkanker cellijn (kras^G12R en p53^A161D mutaties) om een transgene constructie te overdrukken die constitutief de uitdrukking GFP en plaats (CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP). Selecteer de transgene cellen door antibioticaresistentie of door het sorteren van de GFP-positieve cellen met Flow cytometrie.
   2. Kweek de cellen in het gemodificeerde Adelaar's medium (DMEM), aangevuld met penicillaire, streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO₂.
   3. Onderbreek 1 x 10⁶ cellen in 50 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °c.
2. Celinenting in de flanken van muizen
   1. Meng de cellen met dezelfde hoeveelheid kelder membraan matrix. Voeg bijvoorbeeld 1 x 10⁶ cellen in 50 μL PBS toe aan 50 μL van de kelder membraan matrix (Zie tabel met materialen) en meng zachtjes.
      Opmerking:
   2. Injecteer 100 μL van het monster (cellen in PBS + kelder membraan matrix) subcutaan in de linker flank van 6-weekse-oude immunodeficiënte BALB/c nu/nu muizen met behulp van een 1 ml Insulinespuit met een 27g 1/2 ' ' (0,4 x13 mm) naald.
3. Intratumoral antagomiR behandeling.
   1. Onderbreek de antagomiR (Zie tabel van de materialen) of de negatieve controle in 500 ΜL RNase-vrij gedestilleerd water.
   2. Bereid vóór de injectie 2 nmol van de antagomiR of de controle samen met een in vivo afleverings reagens (Zie tabel van de materialen) voor elke injectie.
      1. Meng eerst de antagomiR-oplossing (Zie tabel met materialen) en de complexatiebuffer (zie tabel met materialen) in een verhouding van1:1. Voeg bijvoorbeeld 80 μL miRNA-remmer oplossing (16 nmol) toe aan 80 μL complexvormende buffer (opgenomen in de in vivo leveringreagenskit, Zie tabel met materialen).
      2. Breng het in vivo lever reagens op kamertemperatuur. Voeg 160 μL toe aan een buis van 1,5 mL en voeg onmiddellijk 160 μL verdunde antagomiR oplossing toe. Retourneer het resterende reagens tot-20 °C. Bewaar het reagens indien nodig gedurende maximaal één week na ontdooien bij 4 °C.
      3. Vortex onmiddellijk (10 s) om te zorgen voor de complexering van de in vivo lever reagens-antagomiR.
      4. Inbroed de in vivo afgifte reagens-antagomiR mengsel gedurende 30 min bij 50 °C. Centrifugeer de buis kort om het monster te herstellen.
      5. Verdun de complexe 6-voudige door toevoeging van 1360 μL PBS pH 7,4 en meng goed.
      6. Ga verder met in vivo levering van het reagens-antagomiR complex (8 muizen/aandoening), of bewaar het complex bij 4 °C gedurende maximaal één week voorafgaand aan de injectie. Injecteer 200 μL intratumorally in elke tumor (2 nmol van antagomiR).
         Opmerking: het volume en de hoeveelheid van de antagomiR is onafhankelijk van het tumor volume.
   3. Voer de behandeling 3 keer per week uit (maandag, woensdag en vrijdag) gedurende 2 weken.
4. Analyse van tumorgroei
   1. Injecteer 50 μL van een 40 mg/mL oplossing van D-Luciferin substraat (Zie tabel van de materialen) subcutaan op elk tijdstip met een 1 ml spuit met een 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm) naald.
      1. Bij 8 min na de injectie, anesthetiseren de muizen met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof. Evalueer het niveau van anesthesie door pedaal reflex (stevige teen pinch) en pas verdoving levering zo nodig om chirurgische vliegtuig te handhaven.
      2. Breng oogheelkundige zalf aan beide ogen om uitdroging te voorkomen.
   2. Beeld het bioluminescente signaal met in vivo imaging software (Zie tabel van de materialen).
      Opmerking: remklauwen kunnen ook worden gebruikt om het tumor volume en de tumorgroei te meten.
   3. Nadat de Bioluminescentie signalen zijn verkregen, analyseert u de tumorele groei die beide behandelingen vergelijkt en bepaalt u de significantie met behulp van een t-toets. Voor het analyseren van de afwijking binnen de groep gebruikt u de SEM.
5. Tumor excisie
   1. Zeven dagen na het einde van de behandeling met antagomiR, offeren de muizen, accijnzen de tumor en extract eiwit en/of RNA voor toekomstige analyse. Als alternatief, sectie de tumoren en Fix ze voor immunohistochemie.

2. schildklier orthotopic inoculatie van cellen en systemische antagomiR behandeling

1. Voorbereiding van de cel
   1. Ingenieur een Cal62 menselijke schildklierkanker cellijn te overdrukken een transgene constructie die constitutief spreekt GFP en Luciferase. Selecteer de transgene cellen door antibioticaresistentie of door het sorteren van de GFP-positieve cellen met Flow cytometrie.
   2. Deze cellen groeien in DMEM aangevuld met antibiotica (penicillaire en streptomycine) en 10% FBS bij 37 °C en 5% CO₂.
   3. 1 x 10⁵ cellen in 5 μL PBS opschorten.
2. Celinenting in de schildklier van muizen
   1. Injecteer 100 μL analgeticum (buprenorfine) en 100 μL antibioticum (cefalosporin) subcutaan in de 7-weekse-oude BALB/c nu/nu muizen. Desinfecteer de injectieplaats met alcohol.
   2. Injecteer 5 μL van de celoplossing in de schildklier van de muizen.
      1. Anesthetiseer de muis met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof en plaats het onder een stereomicroscoop in een steriele stroom kast.  Evalueer het niveau van anesthesie door pedaal reflex (stevige teen pinch) en pas verdoving levering zo nodig om chirurgische vliegtuig te handhaven.
      2. Breng oogheelkundige zalf aan beide ogen om uitdroging te voorkomen.
      3. Desinfecteer voor elke muis de nek met iodopovidon en maak een incisie van ongeveer 2 cm in de huid met een schaar. Eenmaal geopend, bloot de nek door het verplaatsen van de speekselklieren.
      4. Dissect de spieren van de riem met behulp van dissectie Tang en/of schaar om de luchtpijp en de schildklier bloot. Injecteer met een spuit van 10 μL microliter 5 μL van de celoplossing in de juiste schildklier lobule, gelegen aan de zijkant van het cricoïde kraakbeen.
      5. Herpositioneer de speekselklieren en hecht de incisie met zijde met behulp van gevlochten, gecoate, niet-absorbabele hechtingen.
      6. Voeg iodopovidone toe aan het wondgebied en plaats de muis op een thermische deken terwijl het herstelt van de anesthesie.
   3. De volgende dag na de operatie, injecteren subcutaan analgetische (buprenorfine) en voeg 3 mL vloeibare ibuprofen (40 mg/mL) in 250 mL van het drinkwater voor 1 week.
3. Systemische antagomiR behandeling
   Opmerking: Voer deze stap uit 2-3 weken na de injectie van de cel, wanneer het bioluminescente signaal detecteerbaar is.
   1. De antagomiR of de negatieve controle in gedestilleerd RNase-vrij water opschorten.
   2. Bereid vóór de injectie 7 nmol van de antagomiR of de controle samen met het in vivo lever reagens voor elke injectie.
      1. Voor de antagomiR en de in vivo levering reagens oplossing voorbereiding Zie stap 1,3 maar voeg 7 nmol van de miRNA-remmer per muis toe.
   3. Dien de oplossing intraveneus toe door een retroorbitale injectie van de veneuze sinus van de muis. Gebruik Isofluraan om anesthesie te induceren.
      Opmerking: Evalueer het niveau van anesthesie met pedaal reflex (stevige teen pinch).
   4. Behandel de muizen 3 keer per week (maandag, woensdag en vrijdag) gedurende 2 weken.
4. Analyse van tumorgroei
   1. Bepaal het tumor bioluminescente signaal tweemaal per week om de tumorgroei te berekenen.
      1. Injecteer 50 μL van een 40 mg/mL oplossing van D-Luciferin substraat op elk tijdstip via subcutane injectie.
      2. Na 8 minuten na de injectie anesthetiseren de muizen met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof en beeld het bioluminescente signaal met in vivo imaging software.
   2. Nadat de Bioluminescentie signalen zijn verkregen, analyseert u de tumorele groei die beide behandelingen vergelijkt en bepaalt u de significantie met behulp van een t-toets. Voor het analyseren van de afwijking binnen de groep gebruikt u de SEM.
5. Tumor excisie
   1. Zeven dagen na afloop van de antagomiR behandelingsperiode, offeren de muizen, accijnzen de tumor en extract eiwit en/of RNA voor toekomstige analyse. Als alternatief, sectie de tumoren en Fix ze voor immunohistochemie.

Resultaten

We gebruikten twee verschillende muizen modellen om te bepalen of de neutralisatie van een miRNA de tumorgroei kon onderdrukken. Dienovereenkomstig werden humane tumor schildklier Cal62-Luc cellen subcutaan geïnjecteerd in de flanken van naakte muizen om een xenograaf model te genereren. Na twee weken, tumoren werden vastgesteld en kon worden gemeten met remklauwen. Op dat moment werden muizen intratumoreel geïnjecteerd met de miR-146b-remmer, of een geschikte controle, en het tumor volume werd gevolgd voor nog eens twee...

Discussie

Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van de in vivo functie van een miRNA om beter te begrijpen zijn rol in tumor initiatie en progressie, en zijn potentieel als een therapeutisch doelwit in schildklierkanker. De tumor xenotransplantaatmodellen is modellen hier beschreven zijn gebaseerd op het gebruik van cellen die kunnen worden gevolgd door hun bioluminescentie signaal, waardoor de meting van tumorgroei in vivo onder invloed van een behandeling. Daarnaast beschrijven we het gebruik van een miRNA-gebas...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Verdund in PBS