Methodenartikel

Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren

DOI:

10.3791/59325

⸱

20 augustus 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring om de endotheliale cellen van de muis aorta direct te observeren. Deze techniek is nuttig bij het bestuderen van het cellulaire en moleculaire fenotype van endotheel cellen in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afwijkende veranderingen in endotheliale fenotype en morfologie worden beschouwd als initiële gebeurtenissen in de pathogenese van atherosclerose. Directe observatie van het intacte endotheel zal waardevolle informatie bieden voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de dysfunctionele endotheel cellen. Hier beschrijven we een gemodificeerde en gezicht immunofluorescentie kleuringstechniek die wetenschappers in staat stelt om duidelijke beelden van het intact endotheliale oppervlak te verkrijgen en de molecuul expressie patronen in situ te analyseren. De methode is eenvoudig en betrouwbaar voor het observeren van de gehele endotheliale monolaag op verschillende locaties van de aorta. Deze techniek kan een veelbelovend instrument zijn voor het begrijpen van de pathofysiologie van atherosclerose, vooral in een vroeg stadium.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vroege veranderingen in de vasculatuur beginnen voornamelijk in het endotheel, dat fungeert als een selectieve barrière tussen het bloed en de wand van het vat met zijn intercellulaire strakke junctieve complexen1. Substantieel bewijs wijst op een cruciale rol voor de mechanische effecten van de bloedstroom in modulerende endotheliale functie2. Vloeibare shear stress, een wrijvingskracht gegenereerd door de doorbloeding, differentieel vormen endotheliale celmorfologie en functie, afhankelijk van de specifieke stroom paradigma's op verschillende vasculaire locaties2,3. Atherosclerotische laesies komen bij voorkeur op plaatsen van verstoorde bloedstroom (d-flow), zoals krommingen van het vat, stroom afscheiders en vertakkingspunten, in vergelijking met regio's van steady flow (s-flow), zoals het rechte segment van de slagader. Daarom moet directe observatie van endotheliale morfologie en molecuul expressie patronen belangrijke inzichten geven in de structurele en functionele fenotypes van endotheliale cellen in verschillende stromings paradigma's.

Gekweekte endotheelcellen mogen het eigenlijke fenotype niet uitdrukken zoals in vivo, deels als gevolg van het verlies van de impact van vloeibare shear stress, omringende cytokines en celcelcellen of celextracellulaire matrix interacties. Om dit te helpen, kan de intacte endotheliale celmonolayer worden bestudeerd op dwarsdoorsneden met behulp van klassieke immunohistochemie. Echter, de endotheliale monolaag is zo dun en kwetsbaar dat het meestal niet duidelijk kan worden waargenomen. En face immunohistochemie is gebruikt om het inwendige oppervlak van het endotheel te observeren, maar is gecompliceerd of onregelmatig in de resultaten omdat het endotheel gemakkelijk uit het onderliggende weefsel kan worden ontdaan, of slechts een deel van de arteriële wand van ratten of konijnen, waarvan de wanden dik zijn, is4,5gemonteerd.

Muismodellen hebben in veel opzichten aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere dieren. Hier gebruiken we een gemodificeerde en gezicht immunofluorescentie techniek om endotheliale cellen van de aortaboog en thoracale aortin C57BL/6 muis te analyseren. Een dergelijke techniek is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de endotheliale pathofysiologie in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose6,7,8,9,10. Deze methode stelt wetenschappers in staat om het hele oppervlak van het endotheel duidelijk te observeren en om de expressie patronen van een gegeven eiwit te vergelijken in gebieden onder verschillende vocht afschuiving stress.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de experimentele protocollen die zijn goedgekeurd door de Commissie dierlijke hulpbronnen van de Shanghai Jiao Tong University.

1. perfusie van de muis aorta

  1. Kort, verdoven 12-week-oude C57BL/6 muizen met intraperitoneale injecties van natriumpentobarbital (50 mg/kg lichaamsgewicht). Bevestig de juiste anesthetisering door de staart zachtjes te knijpen.
    Opmerking: als er geen beweging wordt waargenomen, is het dier voldoende verdoofd om de experimenten te starten.
  2. Plak de klauwen van de muis op een stapel papieren handdoeken met zelfklevende tapes.
  3. Houd de huid van de muis met een tang en snijd de huid met een schaar van de buik naar de bovenkant van de thorax.
  4. Open de buikholte onder de ribbenkast met een scherp paar schaar.
  5. Til het borstbeen met de Tang en snijd het diafragma; Snijd vervolgens de ribbenkast weg om de thoracische holte bloot te leggen.
  6. Snijd de Vena Cava net boven de lever af, met een schaar.
  7. Druk parfuse (100 mmHg) de arteriële boom gedurende 5 minuten met voorgekoelde normale fysiologische zoutoplossing met 40 eenheden/mL heparinein door de linker ventrikel totdat de longen en de lever bleek worden. Parfuseer vervolgens met voorgekoelde 4% Paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) gedurende 3 min.
  8. Verwijder alle spieren, organen en vetten totdat de aorta wordt blootgesteld.
  9. Plaats de muis onder een ontleed Microscoop.

2. dissectie en longitudinaal openen van de aorta

  1. Bloot de aorta duidelijk onder een ontleed Microscoop en verwijder de bindweefsels langs de aorta zo schoon mogelijk, met delicate Tang en een paar delicate schaar (Figuur 1).
  2. Ontleden de thoracale aorta van het hart naar de coeliakie stam met een paar delicate schaar en zet de aorta in een 6 cm celkweek schotel met PBS. Snijd de aorta longitudinaal, langs de mindere curve, en langs de grotere curve open totdat het rechte segment wordt bereikt. Snijd de drie takken van de aortaboog open, met inbegrip van de innominate, links common halsslagader en de linker subclavia slagader, met micro-schaar, zoals weergegeven in Figuur 2.

3. voor behandeling en immunokleuring van de aorta

  1. Permeabiliseer de aorta met 0,1% polyoxyethyleen octyl fenylether in PBS gedurende 10 min en Blokkeer het met 10% normaal geiten serum in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 2,5% Polysorbaat 20 voor 1 uur bij kamertemperatuur in een 12-well celkweek plaat.
  2. Inbroed vervolgens de aorta met 5 g/mL konijn anti-VCAM-1 en 5 g/mL rat anti-VE-cadherin in de blokkerende buffer, 's nachts bij 4 °C.
  3. Na het spoelen van het monster 3x met wasoplossing (TBS bevattende 2,5% Polysorbaat 20), breng de fluorescentie-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:1000 verdunning, Alexa Fluor 555-gelabelde anti-konijn IgG en Alexa Fluor 488-gelabelde anti-rat IgG) voor 1 uur in kamer Temperatuur. Spoel 3x in de wasoplossing.
  4. Beits de aorta met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1 μg/mL) gedurende 10 min en spoel het 3x in de wasoplossing.

4. montage van de aorta op de glazen glijbaan

  1. Plaats de aorta op een dekslip met het Luminale oppervlak naar beneden en verplaats het langzaam naar de anti fade montage oplossing die eerder op de dekslip is gevallen. Strek de aorta voorzichtig uit om het preparaat plat te houden.
  2. Omgekeerde de afdekplaat en zet hem op het glaasje. Er moet worden gezorgd dat er geen luchtbellen tussen het preparaat en het glas mogen blijven.

5. observatie van de aorta

  1. Onderzoek de aorta met een laser scanning confocale Microscoop.
  2. Analyseer kleur intensiteiten van verschillende kanalen uit de gewenste regio in de en face beelden met Image-Pro Plus software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een 12-weekse C57BL/6-muis werd geëerd en geperfoniseerd met een normale zoutoplossing die 40 eenheden/mL heparine en vervolgens voorgekoelde 4% Paraformaldehyde bevat. De muis aorta werd blootgesteld onder een ontleed Microscoop (Figuur 1), ontleed, en snijd open longitudinaal (Figuur 2). En gezicht immunofluorescentie kleuring van de vasculaire endotheliale cellen werd uitgevoerd zoals geïllustreerd in Figu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het endotheel wordt blootgesteld aan talrijke proatherogene factoren, waaronder lipiden, ontstekingsmediatoren en vloeibare shear stress1,11,12. Directe observatie van endotheelcellen in situ biedt de speciale voordelen voor het analyseren van veranderingen in celmorfologie, intercellulaire kruispunten en molecuul expressie patronen in reactie op de letsel stimuli.

Eerdere studies hebben twee verschil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 81670451, 81770430), het Shanghai Rising-Star-programma (Grant No. 17QA1403000) en het Science Technology Committee van de gemeentelijke overheid van Shanghai (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antifade mountantServicebioG1401
Delicate ForcepsRWD Life ScienceF11001-11
Delicate ScissorsRWD Life ScienceS12003-09
Dissecting ForcepsRWD Life ScienceF12005-10
Mciro Spring ScissorsRWD Life ScienceS11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)AmrescoM143
Polysorbate 20 (Tween 20)Amresco0777
VCAM-1 antibodyAbcamab134047
VE-Cadherin antibodyBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgGinvitrogenA-21208
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aortadissectieconfocale microscopieVCAM 1 expressieVE cadherine markervloeistofschuifspanningDAPI tegenkleuringendotheelmorfologieatheroscleroseonderzoek

Gerelateerde artikelen