Methodenartikel

Biosynthese van een Flavonol van een Flavanone door het opzetten van een One-pot Bienzymatische Cascade

DOI:

10.3791/59336

⸱

14 augustus 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China, Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety, Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center, Yangzhou University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afleiding van een Flavonol is cruciaal voor de toepassing ervan in de gezondheidszorg en de voedingsindustrie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de biosynthese van een Flavonol van een flavanone en bespreken de cruciale stappen en de voordelen ervan ten opzichte van andere benaderingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van flavonoïden met een verscheidenheid aan biologische en farmacologische activiteiten. Hier, we bieden een methode voor de in vitro enzymatische synthese van een Flavonol. In deze methode worden Atf3h en Atfls1, twee belangrijke genen in de biosynthetische route van de flavonolen, gekloond en overexpressie in Escherichia coli. De recombinant enzymen worden gezuiverd via een affiniteits kolom en vervolgens wordt een bienzymatische Cascade vastgesteld in een specifieke synthetische buffer. Twee flavonolen worden gesynthetiseerd in dit systeem als voorbeelden en bepaald door TLC-en HPLC/LC/MS-analyses. De methode geeft duidelijke voordelen in de afleiding van flavonolen over andere benaderingen. Het is tijd-en arbeidsbesparing en zeer kosteneffectief. De reactie is gemakkelijk om nauwkeurig te worden gecontroleerd en dus opgeschaald voor massaproductie. Het doel product kan gemakkelijk worden gezuiverd door de eenvoudige componenten in het systeem. Echter, dit systeem is meestal beperkt tot de productie van een Flavonol van een flavanone.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van planten flavonoïden en zijn betrokken bij de ontwikkeling van planten en pigmentatie1,2,3. Belangrijker, deze verbindingen bezitten een breed scala van gezondheid-heilzame activiteiten, zoals anti-kanker4,5, anti-oxidatieve6, anti-inflammatoire7, antiobesity8, anti-hypertensieve9 , en geheugen terugroepen eigenschappen10, wat leidt tot een groot aantal studies over deze plant afgeleide secundaire metabolieten. Traditioneel, deze verbindingen zijn voornamelijk afgeleid van planten extractie met behulp van organische oplosmiddelen. Echter, vanwege hun zeer lage inhoud in planten11,12,13, de productiekosten voor de meeste flavonolen blijft hoog, die grote beperkingen oplegt aan hun toepassing in de gezondheidszorg en het voedsel Industrie.

In de afgelopen decennia, wetenschappers hebben een flink aantal methoden ontwikkeld om te ontlenen flavonoïden14,15. Chemische synthese van deze gecompliceerde moleculen bezit echter een verscheidenheid aan intrinsieke nadelen16. Het vereist niet alleen giftige reagentia en extreme reactieomstandigheden, maar ook vele stappen voor de productie van een doel flavonoïde samengestelde14,17. Bovendien, een andere belangrijke uitdaging in deze strategie is de chirale synthese van actieve flavonoïde moleculen. Daarom is het geen ideale strategie om flavonoïden op commerciële schaal te produceren via chemische synthese16,17.

Onlangs hebben wetenschappers een veelbelovende alternatieve strategie ontwikkeld om deze gecompliceerde natuurlijke verbindingen te produceren door technische microben met een traject voor flavonoïde biosynthese18,19,20, 21 , 22, die met succes is ontcijferd in planten23. Duan et al. introduceerde bijvoorbeeld een biosynthetische route in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae om kaempferol (kmf)24te produceren. Malla et al. geproduceerd astragalin, een geglycosyleerde Flavonol, door de invoering vanflavanone 3-hydroxylase (f3h), Flavonol synthase (fls1), en UDP-glucose: Flavonoïde 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 genen in Escherichia coliBL21 (DE3)17. Ook al zijn er nogal wat paradigma's, niet alle genetisch gemanipuleerde microben produceren de producten van belang als gevolg van de complexiteit van een cellulair platform, de onverenigbaarheid tussen kunstmatig gesynthetiseerde genetische elementen en hosts, de remmende effect van doel producten tegen gastheer cellen, en de instabiliteit van een Engineered cellulaire systeem zelf16.

Een andere veelbelovende alternatieve strategie voor de productie van flavonoïden is het vestigen van een multienzymatische Cascade in vitro. Cheng et al. hebben gemeld dat enterocin polyketides met succes kan worden gesynthetiseerd door het assembleren van een volledige enzymatische route in één pot25. Deze cel-vrije synthetische strategie omzeilt de beperkingen van een microbiële productiefabriek en is dus haalbaar voor het produceren van sommige flavonoïden in grote hoeveelheid16.

Onlangs hebben we met succes een bienzyme synthetisch systeem ontwikkeld om met (NRN) om te zetten in KMF in één pot16. Hier beschrijven we dit systeem in grote details en de methoden die betrokken zijn bij het analyseren van de producten. We presenteren ook twee voorbeelden die dit systeem gebruiken voor het produceren van KMF van NRN en quercetine (qrc) van eriodictyol (ERD). Daarnaast bespreken we cruciale stappen van deze methode en toekomstige onderzoeksrichtingen in de biosynthese van flavonoïden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isoleer totaal RNA uit plantenweefsels26,27

  1. Homogeniseren de plantenweefsels.
    1. Verzamel 100 mg van een vers plantenweefsel (bijv. 4 weken oude zaailingen uit Arabidopsis thaliana). Vries het weefsel en een stamper en mortel met vloeibare stikstof, gevolgd door het slijpen van het weefsel in poedervorm.
    2. Voeg 1 mL RNA-isolatie reagens (Zie tabel met materialen) toe aan de mortel. Het reagens wordt onmiddellijk bevroren. Homogeniseren het weefselmonster met de stamper wanneer het bevroren reagens smelt.
    3. Breng het homogenaat over in een buis van 1,5 mL, Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en breng vervolgens de geclearde homogenaatoplossing over naar een andere verse 1,5-ml buis.
    4. Incuberen het gehomogeniseerde monster bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  2. Isoleer totaal RNA.
    1. Voeg 0,2 mL chloroform toe aan het homogenaat, sluit de buis stevig aan, schud de slang met de hand krachtig voor 15 s en infiltreer het monster bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c en breng de kleurloze bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Het monster scheidt in drie fasen na centrifugeren.
    3. Voeg 0,5 mL isopropylalcohol toe aan de waterige fase, schud de buis met de hand op een krachtige manier en inbroed het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    4. Centrifugeer het mengsel op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant.
    5. Was de RNA-pellet één keer met 1 mL 75% ethanol door vortexing, gevolgd door centrifugeren bij 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    6. Herhaal stap 1.2.5.
    7. Lucht droog de pellet gedurende 5-10 minuten en los het RNA op in diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water door pipetteren op en neer, gevolgd door het meten van de totale RNA-concentratie met een micro-spectrofotometer (Zie tabel met materialen).

2. synthetiseren aanvullend DNA (cDNA)28

  1. Synthetiseren van de eerste streng van cDNA met behulp van een Kit (Zie tabel met materialen). Stel een reactiesysteem van 20 μL in zoals weergegeven in tabel 1 en inbroed de reactie buis in een PCR-instrument voor 50 min bij 42 °c, gevolgd door de reactie op 85 °c gedurende 5 minuten te beëindigen. Bewaar het reactieproduct bij-20 °c voor toekomstige amplificatie van genen.
ReagentiaVolume
dNTP mix, 2.5 mM elk4,0 μL
Primer mix2,0 μL
RNA template1,0 μg
Reverse transcriptase buffer, 5 ×4,0 μL
Reverse transcriptase, 200 U/μL1,0 μL
RNase-vrij H2Otot 20,0 μL

Tabel 1: omgekeerde transcriptie van totaal RNA in cDNA

3. construeren van recombinant plasmiden29

  1. Ontwerp PCR-primers.
    1. Ontwerp de PCR-primers met behulp van een software (Zie tabel met materialen) op basis van de sequenties van belangrijke enzym genen die zijn verkregen uit de GenBank-database en synthetiseren de primers door een bedrijf (Zie tabel met materialen). Voeg in het 5 ' einde van de primer een restrictie-enzym site toe (bijv. BAMHi of Ecori in dit Protocol).
      Opmerking: de primers die in deze studie worden gebruikt, worden weergegeven in tabel 2.
Sequentie, 5 ' → 3 'Purpose
AAGgatccatggctccaggaactttgactVoorwaartse primer voor PCR-versterking van Atf3h gen uit Arabidopsis thaliana. BAM HI site is cursief en gekoppeld voor klonen in pET32a (+).
AAGaattcctaagcgaagatttggtcgaOmgekeerde primer voor PCR-versterking van Atf3h gen van A. thaliana. Eco RI-site is cursief en gekoppeld voor klonen in pET32a (+).
AAGgatccatggaggtcgaaagagtccaVoorwaartse primer voor PCR-versterking van Atfls1 gen van A. thaliana. BAM HI site is cursief en gekoppeld voor klonen in pET32a (+).
AAGaattctcaatccagaggaagtttatOmgekeerde primer voor PCR-versterking van Atfls1 gen van A. thaliana. Eco RI-site is cursief en gekoppeld voor klonen in pET32a (+).

Tabel 2: oligonucleotide primers gebruikt in de huidige studie

  1. Kloon de genen in een prokaryotische expressie vector.
    1. Versterk de genen van het eerste onderdeel van het gesynthetiseerde cDNA met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase (Zie tabel met materialen). Stel een PCR-reactiesysteem van 100-μL in zoals weergegeven in tabel 3 en voer de volgende PCR-cyclus uit: 94 °c gedurende 2 minuten voor initiële denaturatie; vervolgens 35 cycli van 94 °C gedurende 30 sec. voor denaturatie, 55 °C gedurende 2 minuten voor gloeien en 72 °C gedurende 1 minuut voor verlenging; gevolgd door een definitieve rek bij 72 °C gedurende 10 min. laat het reactiemengsel afkoelen tot 12 °C.
      Opmerking: de Verleng tijd is variabel en wordt bepaald door de genlengte met polymerisatie van ongeveer 1000 basissen per minuut voor de meeste DNA-polymerasen.
    2. Visualiseer de PCR-producten (meestal 5 μL) op een 1% agarose-gel en zuivert het specifieke DNA-fragment uit de overgebleven producten met behulp van een DNA-clean-up Kit (Zie tabel met materialen).
    3. Verteren het gezuiverde DNA-fragment en de vector (bijv. pET-32a (+)) met restrictie enzymen (bijv. BAMHi of Ecori in dit Protocol). Stel een 50-μL-reactiesysteem in een PCR-buis van 0,2 mL zoals weergegeven in tabel 4 en inbroed het mengsel bij 37 °c gedurende 3 uur. Scheid het VERTEERDE DNA op een 1% agarose gel.
    4. Herstel de DNA-band met behulp van een gel extraction Kit (Zie tabel van de materialen). Het DNA verder zuiveren met behulp van een DNA clean-up Kit (Zie tabel van de materialen), gevolgd door het meten van de concentratie van DNA met een micro-spectrofotometer (Zie tabel van de materialen).
    5. Ligate het gen-fragment in het gelineariseerde vector DNA met behulp van een T4 DNA ligase (Zie tabel van materialen). Stel een ligatie reactie in een buis van 1,5 mL zoals weergegeven in tabel 5 en inbroed de buis bij kamertemperatuur voor 2-3 h.
      Opmerking: de molaire verhouding van een insert op een vector is variabel en varieerde van 3:1 tot 10:1.
    6. Voeg 2,5 μL van het ligatie mengsel toe aan 50 μL chemisch competente Escherichia coli cellen (BIJV. top10 of DH5α), meng zachtjes en houd de buis gedurende 30 min op het ijs. hitteschok de cellen bij 42 °c voor 90 s en plaats de tube onmiddellijk 2 minuten op ijs.
    7. Voeg 200 μL vloeibaar LB-medium toe zonder antibiotica in de buis en inincuberen van de buis in een 37 °C Shaker bij 220 rpm gedurende 1 uur. Verdeel 50-100 μL van de cellen op een LB plaat met 100 μg/mL ampicilinen inincuberen bij 37 °C 's nachts.
ReagentiaVolume
Pfu Master Mix, 2 ×50,0 μL
Voorwaartse primer, 10 μM4,0 μL
Omgekeerde primer, 10 μM4,0 μL
Cdna2,0 μL
H2O40,0 μL

Tabel 3: instellen van een PCR-reactiesysteem

ReagentiaVolume
DNA fragment/vector3,0 μg
BAM Hallo1,0 μL
Eco Ri1,0 μL
Cutsmart buffer, 10 ×5,0 μL
H2Otot 50,0 μL

Tabel 4: dubbele vertering van een DNA fragment/vector

ReagentiaVolume
InvoegenX μL (0,09 pmol)
VectorY μL (0,03 pmol)
Ligatie buffer, 10 ×1,0 μL
T4 DNA-ligase, 400 U/μL1,0 μL
H2Otot 10,0 μL

Tabel 5: ligatie van een gen-fragment in een gelineariseerde vector

  1. Scherm positieve kolonies.
    1. Inoculeren een enkele kolonie uit de LB-plaat in 200 μL vloeibaar LB-medium met 100 μg/mL ampicilinaat en incuberen bij 37 °C, 250 rpm voor 2-3 h.
      Let op: in het algemeen, pick 4-8 kolonies voor het screenen van positieve kolonies.
    2. Stel een 10-μL kolonie-PCR-reactie op, vergelijkbaar met die in stap 3.2.1.
      Opmerking: gebruik 1 μL LB-cultuur in plaats van 1 μL cDNA-sjabloon.
    3. Visualiseer de PCR-producten op een 1% agarose gel. Beënt de overblijvende cultuur met een positief resultaat in 3 mL vloeibaar LB-medium met 100 μg/mL ampicilinaat en incureer in een 37 °C Shaker bij 250 rpm voor 14-16 h.
    4. Isoleer plasmide DNA van recombinant E. coli culturen met behulp van een plasmide miniprep Kit (Zie tabel van de materialen).
    5. Identificeer de gezuiverde recombinant plasmiden door een dubbel restrictie-enzym analyse (bijv. BAMHi en Ecori in dit Protocol). Stel een reactiesysteem van 10 μL in dat vergelijkbaar is met dat in stap 3.2.3, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 3 uur. Visualiseer de specifieke band die is vrijgegeven van het recombinant plasmide op een gel van 1% agarose.
  2. Controleer de sequenties van positieve recombinant plasmiden.
    1. Stuur de plasmiden naar een bedrijf voor sequencing. Analyseer de resultaten met behulp van een DNA sequentieanalyse software (Zie tabel van de materialen) door het vergelijken van de sequentie verkregen van de sequencing bedrijf met de referentie sequentie verkregen uit de GenBank database.

4. Express recombinant enzym eiwitten30

  1. Transformeer de juiste recombinant plasmide in competente E. coli BL21 (DE3).
    1. Voeg 0,1 μL van het plasmide toe aan 10 μL van de bevoegde E. coli BL21 (DE3) in een buis van 1,5 ml op ijs en houd de buis op het ijs gedurende 5 min.
    2. Warmte schok de cellen in een waterbad van 42 °C voor 90 s en plaats het opnieuw op ijs voor 2 minuten.
    3. Voeg 200 μL LB vloeibaar medium toe zonder antibiotica en inincuberen in een 37 °C Shaker bij 220 rpm gedurende 5 min.
    4. Verdeel 50 μL van de transformatie op een LB agar-plaat met 100 μg/mL ampicilinein en incueren de plaat 's nachts in een incubator van 37 °C.
  2. De expressie van genen induceren.
    1. Inoculeren 3-5 kolonies van de plaat in een buisje met 3 mL LB vloeibaar medium met 100 μg/mL ampicilinein en incuberen bij 250 rpm in een 37 °C Shaker 's nachts.
    2. Breng alle overnachtings cultuur over in 300 mL LB vloeibaar medium met 100 μg/mL ampicilinaat en inincuberen bij 250 rpm in een 37 °C Shaker tot de extinctie van de kweek bij 600 nm tussen 0,4-0,6 ligt.
    3. Voeg Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe aan de cultuur met een eindconcentratie van 0,2 mM en induceert de expressie van de genen bij 250 rpm, 20-22 °C gedurende 3 uur.

5. Reinig de recombinant enzym eiwitten31

  1. Oogst de bacteriën door centrifugeren van de cultuur bij 4 °C, 12.000 x g gedurende 10 minuten.
  2. Respendeer de pellet in 15 mL bacteriële Lysisbuffer met 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinine, 1 μg/mL leupeptine en 1 μg/mL pepstatin in 50 mM tris-cl (pH 8,0).
  3. Soniceren de bacteriële suspensie om de recombinant enzym eiwitten vrij te geven, gevolgd door centrifugeren bij 13.000 x g, 4 °c gedurende 10 minuten.
  4. Oogst en aliquot de supernatant in 1,5-mL tubes op 1 mL/buis en bewaar ze bij-70 °C voor toekomstig gebruik.
  5. Breng 500 μL van zijn-tag zuiverings hars (Zie tabel met materialen) aan op een herbruikbare lege affiniteits kolom. Was de hars met 5 bedvolumes gedeïoniseerd water om de ethanol in de stamoplossing te verwijderen. Breng de hars in balans met 10 bedvolumes van de bindings buffer bestaande uit tris-cl (20 mM, pH 7,9), imidazol (10 mM) en NaCl (0,5 M).
  6. Breng 4 mL van de supernatant van stap 5,4 aan op een slurry van de bovenstaande hars en Blokkeer twee uiteinden van de kolom met stoppers.
  7. Inbroed het mengsel bij 4 °C op een Rotator bij lage snelheid gedurende 2 uur.
  8. Was het fusie-eiwit gebonden hars met 15 bed volumes van de bindings buffer bij 4 °C bij een debiet van 1 mL/min voor elutie.
  9. Voeg 500 μL elutie buffer (met 20 mm tris-cl (pH 7,9), 500 mm imidazol, 0,5 M NaCl) toe aan de kolom en inbroed de slurry bij 4 °c op een Rotator bij een lage snelheid gedurende 10 min. Verzamel de eluens als gezuiverde proteïne monsters.
  10. Herhaal stap 5,5 nog vier keer.
  11. Was de hars opeenvolgend met 10 bedvolumes gedeïoniseerd water en 3 bed volumes van 20% ethanol. Week de hars in 20% ethanol. Blokkeer de kolom met stoppers en bewaar deze op 4 °C.
  12. Meet de concentratie van de gezuiverde eiwitten door de Bradford Protein assay. Bepaal de zuiverheid van de eiwitten op een 10% SDS-PAGE gel en visualiseer de banden met de Coomassie Blue kleurings test.
  13. Voeg glycerol toe aan de gezuiverde eiwit oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10% om de enzymactiviteit te stabiliseren. Aliquot en bewaar het bij-80 °C.

6. een Flavonol produceren uit een flavanone in een in vitro bienzym synthetisch systeem16

  1. Buffers voorbereiden.
    1. Maak 2x synthetische buffer zonder ferro sulfaat, bestaande uit 200 mM tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM α-ketoglutaarzuur, 0,8% natrium ascorbaat en 20% glycerol. Los 1,938 g van tris Base, 0,640 g Natriumascorbaat, 0,250 g α-ketoglutaarzuur en 16 mL glycerol op aan 64 mL gedeïoniseerd water. Breng de pH op 7,2 aan met zoutzuur (HCl) en Voeg gedeïoniseerd water toe tot 80 mL. Bewaar de buffer bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
    2. Maak een 100x stockoplossing van 2 mM ferro sulfaat. Los 55,6 mg ferro-sulfaat heptahydraat op in 50 mL gedeïoniseerd water, roer en voeg water toe tot 100 mL.
    3. Maak een stamoplossing van 25 mM flavonoïde. Los een flavonoïde in methanol grondig op en opgeslagen bij-20 ° C.
  2. Een synthetisch systeem opzetten om een Flavonol van een flavanone te produceren.
    1. Bereid het synthetische systeem zoals weergegeven in tabel 6.
    2. Inincuberen de reactie bij 40 °C in een open tube van 2,0 mL bij 600 RPM (in een schud hitte blok) voor 40 min.
    3. Beëindig de reactie door toevoeging van 10 μL azijnzuur en 100 μL ethylacetaat.
    4. Twee uur later, breng de organische fasen over naar 1,5-mL buizen voor het drogen van de lucht in een kap bij kamertemperatuur.
ReagentiaVolume
2 × synthetische buffer zonder ferro sulfaat50,0 μL
25 mM Flavonol2,0 μL
2 mM ferro sulfaat0,5 μL
1 mg/mL AtF3H2,5 μL
1 mg/mL AtFLS12,5 μL
25 mM flavanone2,0 μL
H2Otot 100,0 μL

Tabel 6: het in dit Protocol gebruikte synthetische systeem.

7. Analyseer de reactieproducten

  1. Analyse van dunne-laag chromatografie (TLC).
    1. Zwembad 5 buizen van de flavonoïde monsters uit stap 6.2.4 en neem 300 μL voor het drogen van de lucht. Het flavonoïde poeder opnieuw oplossen in 160 μL methanol. Maak authentieke flavonoïde monsters met seriële concentraties van 12,5, 25, 50, 100 en 200 ng/μL in methanol. Laad 1 μL van de reactie monsters en de authentieke flavonoïde monsters op polyamide 6 platen.
    2. Voer de voorbeeldbelaste platen uit in een oplosmiddelsysteem bestaande uit chloroform/methanol/ethylacetaat/mierenzuur in een verhouding van 5,0:1,5:1,0:0,5.
    3. Lucht droog de platen bij kamertemperatuur. Spuit de platen met 1% ethanolische oplossing van aluminiumchloride (AlCl3), gevolgd door luchtdroging opnieuw bij kamertemperatuur.
    4. Dertig minuten later, visualiseer de vlekken op de platen onder een UV-licht op 254 nm en maak beelden.
    5. Analyseer de grijze waarde van elke plek op de afbeeldingen met behulp van een beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld ImageJ v 1,51 J8 in dit Protocol).
      1. Open de software ImageJ. Klik op bestand > openen om de te analyseren afbeelding te openen.
      2. Klik op de linker meest Rectangular selectie tool in de imagej-gebruikers interface. Schets de regio van belang (ROI) in de afbeelding met de muis en druk figure-protocol-1 op om de eerste ROI te labelen.
      3. Verplaats de rechthoekige selectie met de muis naar rechts naar de volgende ROI en figure-protocol-2 druk op om de tweede ROI te labelen.
      4. Herhaal de vorige stap om alle andere ROIs te labelen.
      5. Druk figure-protocol-3 op om profiel plots voor alle Rois in een pop-upvenster te genereren.
        Opmerking: op dit moment wordt de tool voor het selecteren van rechte lijnen in de imagej-gebruikers interface automatisch geactiveerd.
      6. Gebruik het gereedschap lineaire selectie om basislijnen te tekenen om een gesloten gebied te definiëren voor elke rente piek.
      7. Activeer het gereedschap Toverstaf door op het corresponderende pictogram in de imagej-gebruikers interface te klikken. Klik in de piek om de resultaten voor alle pieken in een pop-upvenster weer te geven.
    6. Maak een op TLC gebaseerde standaard curve van de authentieke flavonoïde door de grijze waarden uit stap 7.1.5.7 tegen de corresponderende flavonoïde concentraties uit stap 7.1.1 te plotten. Bereken vervolgens de opbrengst van de in dit protocol geproduceerde flavonoïde volgens de resulterende formule.
  2. Analyse van hogedrukvloeistof chromatografie (HPLC) en vloeistofchromatografie/massaspectrometrie (LC/MS)
    1. Verwerken van de monsters van stap 7.1.1 opeenvolgend via 0,45 μm en 0,22 μm filters.
    2. Laad de monsters in een HPLC/LC/MS-systeem (Zie tabel met materialen) en scheid de monsters bij 30 °c met behulp van een C18 (4,6 × 150 mm; i.d., 5 μm) kolom. Elute de kolom bij 1,0 mL/min met een gradiënt van 10-85% (v/v) acetonitril (ACN) in water (0-10 min, 10-25% ACN; 10-35 min, 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 min, 85-10% ACN; 50-60 min , 10% ACN) en bewaak de extinctie van het eluaat van 200 tot 800 nm. Voer de LC/MS-analyse uit in een negatieve Ion-modus met een droog stikstof debiet van 10 L/min bij 300 °C en een mantel gasstroom van 7 L/min bij 250 °C en Verzamel gegevens met behulp van een ingebouwde software (Zie tabel met materialen).
    3. Extractie van enkele golflengte chromatografen voor het berekenen van de piek gebieden van de reactie monsters en authentieke flavonoïde verbindingen met behulp van een software (Zie tabel met materialen).
      1. Open het programma kwalitatieve analyse en klik op bestand ≫ gegevensbestand openen. Selecteer het bestand (en) dat u wilt analyseren in het venster gegevensbestand openen en klik op openen om het bestand (en) te openen.
      2. Klik met de rechtermuisknop op de muis in het venster chromatogram Rresultaten en vervolgens op de EXtract Chromatogrammen in een pop-upmenu.
      3. Open het dialoogvenster EXtract Chromatograms . Klik in de lijst type op andere chromatogrammen. Selecteer in de keuzelijst met invoervak detector DAD1. Klik vervolgens op OK om de HPLC-resultaten weer te geven in het venster resultaten van Chromatogram .
      4. Klik op het pictogram Mjaarlijkse Integration aan de bovenkant van het venster resultaten Chromatogram . Teken een basislijn voor de piek die nodig is voorhand matige integratie analyse met de muis.
      5. Klik op > integratie piek lijst weergeven om de resultaten weer te geven.
    4. Maak een HPLC-gebaseerde standaard curve van de authentieke flavonoïde door de piek gebieden uit stap 7.2.3.5 te plotten tegen de corresponderende flavonoïde concentraties uit stap 7.2.1. Bereken vervolgens de opbrengst van de in dit protocol geproduceerde flavonoïde volgens de resulterende formule.
    5. Analyseer de MS-gegevens voor de exacte massa van flavonoïde verbindingen met behulp van een software (Zie tabel met materialen).
      1. Herhaal de stappen 7.2.3.1-7.2.3.3.
      2. Klik op het bereik selecteren pictogram op de Chromatogram resultaten werkbalk.
      3. Selecteer de piek van de rente. Met de rechtermuisknop op de muis in het geselecteerde bereik en klik op de extract MS spectrum in het pop-upmenu om de resultaten weer te geven in de MS spectrum resultaten venster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F3H en FLS1 zijn twee belangrijke sleutel enzymen bij de omzetting van een flavanone in een Flavonol in planten, zoals weergegeven in Figuur 1. Voor de ontwikkeling van een in vitro biosynthetisch systeem voor de productie van een Flavonol uit een flavanone, Atf3h (GenBank toetredingsnr. NM_ 114983.3) en Atfls1 (GenBank toetredingsnr. NM_ 120951.3) genen werden gekloond uit de zaailingen van 4 weken oude a. thaliana in een prokaryot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een flink aantal studies zijn gericht op de afleiding van flavonolen als gevolg van hun potentiële toepassing in de gezondheidszorg en voedingsmiddelenindustrie. Echter, traditionele planten extractie met behulp van organische oplosmiddelen en chemische synthese bezitten intrinsieke nadelen, die hun gebruik in de productie van flavonolen beperken. Hier rapporteren we een gedetailleerde methode voor het produceren van een Flavonol van een flavanone in één pot door het opzetten van een in vitro bienzymatische Cascade. De k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel gesteund door de Universiteit van Yangzhou, speciaal benoemd professor start-up funds, Jiangsu speciaal benoemd professor start-up funds, Six talent Peaks project in de provincie Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016), en een project gefinancierd door de prioritaire academische programma ontwikkeling van de Jiangsu hogeronderwijsinstellingen (diergeneeskunde). We danken het testcentrum van de Universiteit van Yangzhou voor HPLC en MS-analyses van flavonoïden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2× Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717APCR-amplificatie van genen met hoge trouw
Agilent 1200 Series RRLC systeem met een Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systeemAgilent Technologies, IncN/Aeen apparaat voor analyse van flavonoïden door HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (versie B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aeen software voor het verzamelen van gegevens van het Agilent 1200 Series RRLC systeem met een Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systeem
dihydrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216tussenproduct voor het produceren van kaempferol uit naringenin
dihydroquercetineSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371tussenproduct voor het produceren van quercetine uit eriodictyol
DNA Clean-up KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301zuivering van PCR-versterkte of gel-gezuiverde DNA
eriodictyolShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substraat voor het produceren van quercetine
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809bacteriestam voor het tot expressie brengen van doelgenen
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808bacteriestam voor plasmideproliferatie
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry SystemLabconco Corporation7740020een apparaat voor het lyofiliseren van in organisch oplosmiddel opgeloste flavonoïden
Gel Extraction KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302zuivering van een DNA-band van een agarosegel
Gel Imaging SystemShanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd.Tanon-
2500		een apparaat voor visualisatie van DNA-band op een agarosegel of flavonoïde vlek op een polyamide TLC-plaat
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparatie van plasmiden
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010uiteindelijk reactieproduct en standaardsubstantie
MassHunter Quanlitative Analysis (versie B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aeen software voor analyse van HPLC/LC/MS-gegevens
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLeen apparaat voor bepaling van DNA/RNA-concentratie
naringeninSigma-Aldrich Co. LLCN5893substraat voor het produceren van kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010zuivering van His-tagged fusie-eiwitten
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmide voor het klonen en tot expressie brengen van doelgenen
plasmide sequencingGENEWIZ SuzhouN/Asequencing van recombinante plasmiden
primer synthesisGENEWIZ SuzhouN/Asynthese van PCR-primers
quercetineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.Q111273uiteindelijk reactieproduct en standaardsubstantie
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synthese van de eerste streng van cDNA van totaal RNA
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0016ligatie van een insert in een gelineariseerd vector-DNA
TrizolThermo Fisher Scientific15596018isolatie van totaal RNA
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099een software voor PCR-primerontwerp en DNA-sequentieanalyse
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aeen software voor analyse van HPLC-gegevens

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flavonolbiosyntheseflavanonconversieenzymatische cascadeAtf3h overexpressieAtfls1 overexpressieEscherichia coli expressieaffiniteitszuiveringTLC analyseHPLC analyseLC MS analyse

Gerelateerde artikelen