Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
DNA gelelektroforese met behulp van agarose is een gemeenschappelijk instrument in moleculaire biologie laboratoria, waarmee een scheiding van de fragmenten van DNA door grootte. Na scheiding, is DNA gevisualiseerd door kleuring. Dit artikel laat zien hoe u thiazole oranje om vlek DNA. Thiazole oranje vergeleken gunstig met gemeenschappelijke kleuring methoden, in die zin dat het gevoelige, goedkope, prikkelbaar met UV- of blauw licht (monster om schade te voorkomen) en veiliger dan ethidiumbromide. Laboratoria die reeds uitgerust is om uit te voeren van de experimenten van DNA elektroforese gebruik van ethidiumbromide kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen in het algemeen overschakelen naar bestaande protocollen, met behulp van UV-licht voor detectie. Blauw-licht detectie om te voorkomen dat monster schade kan bovendien worden bereikt met een blauw-licht bron en emissie-filter. Labs reeds uitgerust voor blauw-licht detectie kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen eenvoudig overschakelen naar bestaande protocollen.
Inleiding
Het doel van deze methode is om te identificeren van DNA in agarose gel met behulp van thiazole oranje (TO) voor de detectie van de fluorescentie. Door zijn lage kosten en gunstige veiligheidsprofiel, kan thiazole oranje bepaald voordeel in undergraduate onderwijs labs en onderzoeklaboratoria uitvoeren van moleculaire biologie, met name ligations en klonen ziet.
Ethidiumbromide blijft de meest voorkomende kleurstof voor opsporing van DNA in agarose gel. Dit is vooral omdat het zeer goedkoop kan worden verkregen en vereist alleen excitatie met UV-licht voor detectie. Beide ethidium bromide en thiazole oranje zijn goedkoop, met lage detectie ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van het gel
Opmerking: Voor de protocollen van de Elektroforese van het gel van de algemene, zie ook P.Y. Lee, et al.. 14.
- Meng agarose (~ 1% w/v, percentage kan worden gevarieerd voor bepaalde grootte scheidingen) in buffer (ongeveer 70 mL voor een mini gel (8 x 7 cm)). Buffers zijn vaak TAE (tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM acetaat, 1 mM EDTA, pH ongeveer 8,6) of FSME (tris-boraat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boraat, 2 mM EDTA, pH ongeveer 8.3)).
- Thiazole oranje toevoegen om een eindconcentratie van 1.3 μg/mL.
- Ontbinden thiazole oranje in DMSO te maken van een st....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Thiazole oranje maakt detectie van DNA, zonder gebruik van ethidiumbromide en zonder gebruik te maken van DNA-schadelijk UV-licht. Ethidiumbromide is bekend als mutageen, dus het wegwerken van het lab voordeel kan opleveren. UV-licht beschadigt DNA en verlaagt transformatie-efficiëntie aanzienlijk, terwijl blauw licht DNA niet beschadigt. Detectiegrenzen lijken tussen ethidiumbromide, thiazole oranje en een gemeenschappelijke, blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA kleurstof (Figuur 1, Zi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ethidiumbromide is al lang een standaardhulpmiddel in de moleculaire biologie lab, ondanks bekende toxiciteit. Het lijdt ook waarbij UV-licht, die het DNA schade zoals het wordt ontdekt. Thiazole oranje biedt een goedkoop alternatief voor ethidiumbromide, evenals nuttig, maar dure commerciële kleurstoffen.
De voordelen van thiazole oranje zijn dus tweeledig. Eerst, thiazole oranje kan gewoon worden gebruikt als vervanging aan ethidiumbromide. Gels kunnen identiek aan EtBr, met aan vervangen al.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door opstarten middelen aan TDG van Christopher Newport University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blauwlicht zaklamp | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalaire Blauwe LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethidiumbromide | Fisher | BP1302-10 | Voor vergelijking, niet noodzakelijk voor het protocol |
| Gelapparatuur (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel-extractiekit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager kijkbrillen | Invitrogen | S37103 | Noodzakelijk voor het gebruik van blauwlicht zaklamp.* |
| SafeImager 2.0 (Blauwlichttransilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blauwlicht zaklamp kan als alternatief worden gebruikt |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Voor vergelijking, niet noodzakelijk voor het protocol |
| TAE (Tris-Acetaat-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Brillen worden ook geleverd bij Invitrogen G6600 |
Referenties
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
