Een oncogene hepatocyte-geïnduceerde Orthotopic muis model van hepatocellulaire kanker ontstaan in de setting van leverontsteking en fibrose

Samenvatting

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een klinisch relevant muriene model van leverkanker die de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) recapituleren.

Samenvatting

De afwezigheid van een klinisch relevant diermodel dat de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) aanpakt, heeft de verheldering van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën aanzienlijk belemmerd. Om een ideaal diermodel te ontwikkelen dat het humaan HCC samenvoert, krijgen immunocompetente mannelijke C57BL/6J-muizen eerst een koolstoftetrachloride (CCl₄)-injectie om leverfibrose te induceren, waarna ze histologisch-normale oncogene hepatocyten van jonge mannen krijgen SV40 T antigeen (TAg)-transgene muizen (MTD2) door intra-splenic (ISPL) inoculatie. Androgeen gegenereerd in de ontvangende mannelijke muizen in de puberteit initieert TAg expressie onder controle van een lever-specifieke promotor. Als gevolg daarvan, de overgedragen hepatocyten worden kankercellen en vorm tumor massa's in de setting van leverfibrose/cirrose. Dit nieuwe model bootst Human HCC initiatie en progressie na in de context van leverfibrose/cirrose en weerspiegelt de meest typische kenmerken van humaan HCC inclusief immuun disfunctie.

Inleiding

Hepatocellulaire kanker (HCC) is de snelst groeiende vorm van kanker in de Verenigde Staten (VS)^1,2,3. Elk jaar worden ongeveer 850.000 nieuwe gevallen gediagnosticeerd^4,5 en 700.000 patiënten sterven aan deze dodelijke ziekte^6,7,8,9,10 , waardoor het de op één na hoogste oorzaak van kanker-gerelateerde dood wereldwijd. Het beheer van HCC omvat chirurgische resectie, transplantatie, ablatie, chemoembolisatie of systemische therapieën, zoals sorafenib¹¹. Vroegtijdige diagnose en behandeling met chirurgische resectie of transplantatie hebben het hoogste totale overlevingsvoordeel⁴. Helaas, de meerderheid van de patiënten aanwezig in een later stadium en vereisen Management met ablatie, chemoembolisatie of sorafenib¹². Sorafenib, een receptor tyrosine kinase remmer (rtki), werd goedgekeurd door de Food and Drug Administration in 2008 als de enige systemische medicamenteuze therapie beschikbaar voor de behandeling van inoperabel HCC. Hoewel het medicijn alleen een bescheiden toename van de totale overleving biedt, van 7,9 tot 10,7 maanden¹³, voorzag het in een nieuwe therapeutische strategie die kon worden gebruikt om HCC te beheren.

Het manipuleren van het immuunsysteem om gevestigde kankers te elimineren is een snel groeiend veld in kankeronderzoek¹⁴. Immuun Checkpoint studies hebben aanzienlijk geavanceerde immunotherapeutische drug ontwikkeling in de behandeling van kanker^15,16. De FDA keurde het gebruik van antilichamen (ABS) goed tegen cytotoxisch T-lymfocyten antigeen 4 (CTLA-4), geprogrammeerde celdood proteïne 1 (PD-1), en zijn ligand PD-L1 voor de behandeling van melanoom, longkanker, hoofd-en nekkanker, en blaaskanker^{17, 18 , 19 , 20}. klinische studies met monotherapie-of combinatietherapie waarbij gebruik wordt gemaakt van één of meerdere antilichamen tegen pd-1, PD-L1 of ctla-4 voor de behandeling van Advanced HCC zijn aan de gang^21,22,23, en sommige proeven hebben gunstige resultaten opgeleverd. In 2017, de FDA verleende versnelde goedkeuring voor anti-PD-1 antilichaam voor de behandeling van HCC patiënten, die resistentie tegen sorafenib zijn, maar de totale responspercentage van deze therapie is slechts 14,3%. Andere strategieën zijn niet vertaald in de klinische praktijk op dit moment^24,25. Overwinnen van tumor-geïnduceerde diepgaande immuun tolerantie ter verbetering van immune Checkpoint therapie²⁶; voorspellen van de werkzaamheid van immuuncontrolepunt therapie; preventie van immuungerelateerde ongewenste voorvallen; het optimaliseren van de toedieningsroute, dosering en frequentie; en het vinden van effectieve combinaties van therapieën^27,28,29 blijven allemaal uiterst uitdagende taken.

Er zijn verschillende conventionele benaderingen gebruikt voor het induceren van HCC in muismodellen momenteel en worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeker specifieke onderzoek vraag³⁰. Chemisch geïnduceerde HCC-Muismodellen met genotoxische verbindingen bootsen letsel geïnduceerde maligniteit na. Xenograft-modellen via ectopische of orthotopic implantatie van HCC-cellijnen zijn geschikt voor geneesmiddelen screening. Een aantal genetisch gemodificeerde muizen is ontwikkeld om de pathofysiologie van HCC te onderzoeken. Transgene muizen die virale genen, oncogenen en/of groeifactoren uitdrukken, maken de identificatie mogelijk van trajecten die betrokken zijn bij hepatocarcinogenese. Vanwege inherente beperkingen, deze modellen niet recapituleren de typische immuunkenmerken gezien in humaan HCC, die aanzienlijk heeft belemmerd verheldering van de onderliggende mechanismen en ontwikkeling van innovatieve immunotherapeutische strategieën^{14 ,15}. Onlangs hebben we een klinisch relevant Murine model gecreëerd. Dit nieuwe model bootst niet alleen menselijke HCC initiatie en progressie na, maar weerspiegelt ook de meest typische kenmerken van menselijke ziekte, waaronder immuun disfunctie. We hebben de biologische en immunologische kenmerken ervan gekenmerkt. Gebruikmakend van dit nieuwe model hebben we verschillende immunotherapeutische strategieën onderzocht voor de behandeling van HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. dit unieke platform stelt ons in staat om mechanismen van tumor-geïnduceerde immunotolerance te bestuderen en om proof-of-concept therapeutische strategieën te ontwikkelen voor HCC naar uiteindelijke klinische vertaling.

Protocol

Opmerking: alle procedures inclusief dierproef personen zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Universiteit van Missouri. Alle muizen kregen humane verzorging volgens de criteria die zijn uiteengezet in de "gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren". De volgende procedure voor celisolatie en inoculatie moet worden uitgevoerd in een afzuigkap. Alle performers moeten de standaard persoonlijke beschermingsmiddelen dragen voor het hanteren van de muizen en weefsels.

1. inductie van leverfibrose en cirrose met IP-injectie van tetrachloorkoolstof (CCl₄)

Opmerking: Zie afbeelding 1. (CCl₄ is zeer gevaarlijk reagens, moet zorgvuldig worden behandeld en met chemicaliën bestendige handschoenen)

1. Verkrijg mannelijke C57BL/6J muizen die zes tot acht weken oud zijn (Zie tabel met materialen).
2. Bereid 10% CCl₄ (v/v) oplossing in maïsolie in een centrifugebuis. Bepaal het totale volume op basis van het aantal te injecteren muizen (zie stap 1,6).
3. Gebruik geschikte muizen handlingtechniek om één muis voor injectie te selecteren.
4. Handmatig de muis met de rugzijde (buik) omhoog te rebelasten.
5. Reinig de injectieplaats op de buikwand van de muis door te schrobben met 70% alcohol.
6. Injecteer mannelijke C57BL/6J muizen met 160 μL 10% CCl₄ oplossing door intraperitoneale (IP) injectie met een 25-gauge wegwerp naald.
7. Zorg ervoor dat de naald door de buikwand dringt (ongeveer 4-5 mm) met schuine kant naar boven en licht schuin op 15-20 graden.
8. Injecteer muizen twee keer per week gedurende een totaal van vier weken-elke muis krijgt in totaal acht injecties.
   Opmerking: twee weken na de laatste injectie zijn behandelde muizen klaar voor ISPL-inoculatie van oncogene hepatocyten van MTD2 muizen.

2. isoleren van tag-transgene hepatocyten van lijn MTD2 muizen

Opmerking: Zie tabel 1 voor oplossings recepten.

een uitgebalanceerde zoutoplossing van 10x Earle zonder CA of mg (EBSS zonder CA of mg)	4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2O 10 g dextrose Voeg water toe aan 1 liter, pH tot 4,32 Doorlopen filter
Oplossing 1	20 mL 10x EBSS zonder CA of mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1,5 M Hepes 10 mL van 10 mL EGTA Voeg water toe aan 200 mL
Oplossing 2	100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Voeg water toe aan 1 liter
0,75% Collagenase-oplossing	15 mg Collagenase type 1 20 mL oplossing 2
Volledige medium	2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Penicillaire-streptomycine

Tabel 1: oplossings recepten.

1. Verkrijg lijn MTD2 muizen³⁸ om te dienen als de bron van oncogene hepatocyten.
2. Anesthetize 5-week-oude MTD2 muizen met 2,5% isoflurane.
   Opmerking: goede anesthetisering zal worden gecontroleerd door middel van de teen pinch methode. In het kort, met behulp van twee vingers, geef de muis teen/voet een goede squeeze. Als er geen terugtrekkings reactie is, wordt het dier diep genoeg beoordeeld om een operatie te starten.
3. Plaats muizen in een liggende positie en fixeer de extremiteiten met tape om voldoende blootstelling van het buik oppervlak te bieden.
4. Voer een middellijn laparotomie incisie met behulp van een schaar langs de lengte van de linea alba groot genoeg om te zorgen voor een adequate blootstelling van de lever.
5. Verplaats de darmen naar links om een betere blootstelling van de lever en portaal triade te bieden.
6. Ontleden boven de lever om de onderste vena cava (IVC) bloot te leggen.
7. Ligate de IVC boven de lever met behulp van een slagader klem.
8. Terugkeren naar de inferieure grens van de lever, gebruik een vlindernaald (Zie materialen) te krijgen IV toegang tot de poortader. Repareer katheter met de hand.
9. Achtereenvolgens parfumeer de muis lever met behulp van een injectiespuit op 8,9 mL/min met 15 mL oplossing 1, 15 mL 0,75% Collagenase oplossing 2, en 15 mL oplossing 2 via de katheter.
10. Oogst de geperfundeerd lever door snijden en het nemen van de tumor massa van MTD2 muizen in een 50 ml conische buis met 10-15 ml PBS.
11. Verwijder PBS en was een extra tijd met PBS; niet centrifugeren bij deze stap.
12. Snijd de lever in kleinere stukken met behulp van een schaar en spoel vervolgens opnieuw met PBS 2x om het resterende bloed te verwijderen.
13. Voeg 5 mL volledig RPMI medium toe aan de conische buis en de lever voortdurend met een schaar op kleine stukjes (< 3 mm)-weefsel moet soepel door een 5 mL pipet gaan.
14. Voeg complete RPMI toe aan een eindvolume van 30 mL en onderbreek de lever met een 5 mL pipet.
15. Filtreer de gemengde oplossing met een 70 μm zeef in een conische buis van 50 mL.
16. Was de zeef meerdere malen met volledige RPMI en stel het eindvolume in op 50 mL door extra RPMI-medium toe te voegen.
17. Draai de suspensie snel door te centrifugeren tot een maximum van 500 rpm; Zodra de snelheid wordt versneld tot 50 x g, moet de centrifuge worden gestopt.
18. Decanterende de supernatant en Suspendeer pellets in 20 mL PBS.
19. Tel cellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer, stel vervolgens de celconcentratie in op 2,5 x 10⁶/ml voor de volgende celinoculatie.
    Opmerking: de verwachte opbrengst van 5 gram tumorweefsel is 80.000.000 hepatocyten met levensvatbaarheid > 95%.

3. Inoculating van de hepatocyten van MTD2 muizen naar de lever van wild type C57BL/6J muizen door ISPL injectie

1. De aseptische techniek moet worden gebruikt in alle procedures
2. Anesthetiseer de CCl₄-behandelde mannelijke C57BL/6j-muizen met 2,5% Isofluraan, de muizen moeten worden behandeld met een ooglube om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
3. Bereid spuiten met 200 μL hepatocyten voor injectie.
4. Plaats muizen met de linker kant omhoog wanneer ze voldoende verdoofd zijn.
5. Scheer de hele linkerflank van de muizen en schrobben het gebied af, afgewisseld tussen 70% alcohol en Betadine drie keer.
6. Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe vóór de chirurgische incisie.
7. Maak een incisie van 1 cm op de linkerflank evenwijdig aan de 13^e rib van de dorsale extreme beginnend net onder de rugspier.
8. Identificeer de milt en exterioriseer het met behulp van bot-puntige Tang.
9. Klem de milt met twee middelgrote Titanium klemmen. Plaats beide clips tussen de milt slagader en de ader, laat de ruimte tussen de clips na de inoculatie later knippen.
   Opmerking: het doel is om de inferieure pool van de milt te isoleren om het risico op zaaien te verminderen.
10. Injecteer 200 μL (500.000) van de bereide hepatocyten in de onderste pool van de milt met een naald van 27 G.
11. Clip de inferieure tak van de pedile (inferieure milt Pole vaten) met één middelgrote clip.
12. Snijd de milt tussen de twee in eerste instantie geplaatste clips.
13. Verwijder de inferieure pool van de milt die direct met tumorcellen werd geïnjecteerd.
14. Gebruik 3-0 polyglactin 910 onderbroken hechten om de binnenste spier laag te sluiten.
15. Gebruik gesteriliseerde stalen wond klemmen om de buitenste huidlaag te sluiten.
    Opmerking: stalen klemmen hebben de voorkeur boven hechtingen om te voorkomen dat dieren hechtingen uitkauwen en een gapende wond achterlaten.
16. Dien 5 mg/kg carprofen subcutaan toe na hecht.
17. Plaats alle herstellende dieren op een temperatuurgestuurde verwarmingspad en monitor nauwkeurig tot volledig hersteld van anesthesie.
18. Geef muizen vrije toegang tot water na de operatie. Als de muis tijdens een operatie gedehydrateerd wordt, dien dan subcutane vloeistoffen toe (< 1 mL).
19. Verwijder skin clips op 7-10 dagen na de operatief.

Resultaten

Oncogene hepatocyten die zijn geïsoleerd van TAg-transgene muizen (Figuur 2) werden in de lever van wild type muizen geënt door intra-milt injectie (Figuur 3). De getransplanteerde hepatocyten succesvol en betrouwbaar groeide orthotopic HCC tumoren (Figuur 4) met tumor specifieke antigeen SV40 TAg (Figuur 5) in de setting van hepatische ontsteking en fibrose (Figuur 1).

Discussie

Met dit protocol hebben we een betrouwbaar en reproduceerbaar muriene model van HCC opgezet dat menselijke HCC initiatie en progressie nabootst. Klinisch, veel risicofactoren achtereenvolgens induceren leverletsel, leverfibrose, cirrose en de laatste fase van HCC. In ons protocol wordt IP-injectie van CCl₄ gebruikt om eerst leverfibrose te produceren in wild type muizen, waardoor de daaropvolgende oncogene hepatocyten de tumoren vormen in de setting van leverfibrose. We ontdekten dat tumorvorming het meest suc...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anesthesieapparaat	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesieapparaat voor chirurgie
Vlindernaald	BD	8122963	Naald gebruikt voor leverperfusie
C57BL/6 muizen	Jackson Lab	000664	muizen gebruikt in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen voor pijnverlichting
Celzeef	CORNING	REF 431751	Celzeef, 70µm, voor hepatocytenisolatie
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge voor celaisolatie
Klemmen	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium klemmen voor milt
Microscoop	Zeiss	Primovert	microscoop voor celaobservatie
Mtd2 muizen	N/A		Gift van Dr. William A Held bij het Roswell Park Cancer Institute in 2002, onderhouden in ons lab
Naald	BD	REF 305109	BD precisionglide naald, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Hechtdraad	ETHICON	J303H	gecoate VICRYL hechtdraad
SV40 T Ag antilichaam	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigeenantilichaam voor IHC
Spuit	BD	REF 309626	1 mL TB spuit voor celainjectie
Trypan blauw	SIGMA	T 8154	Trypan blauw oplossing voor celalevensvatbaarheidstest
Wondklemmen	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	roestvrijstalen wondklemmen voor wondsluiting