Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59382

⸱

31 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

Samenvatting

CCCTC-bindende factor (CTCF)-gemedieerde stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) spelen een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich bevinden in het naburige TADs. CTCF speelt een belangrijke rol bij de regulering van de ruimtelijke en temporele expressie van HOX -genen waarmee embryonale ontwikkeling, lichaam patronen, Haematopoiese en leukemogenesis. Het blijft echter grotendeels onbekend of en hoe HOX loci verbonden CTCF grenzen chromatine organisatie en expressie van HOX -genen regelen. In het huidige protocol, is een specifieke sgRNA gepoolde bibliotheek gericht op alle CTCF bandplaatsen in de HOXA/B/C/D loci gegenereerd om te onderzoeken van de effecten van CTCF-geassocieerde chromatine grenzen op TAD vorming en HOX gen verstoren expressie. Via CRISPR-Cas9 is genetische screening, de CTCF binding site gelegen tussen HOXA7/HOXA9 genen (CBS7/9) geïdentificeerd als een kritische regulator van oncogene chromatine domein, maar ook als belangrijk voor het behoud van ectopische HOX -genen expressiepatronen in MLL-herschikt acute myeloïde leukemie (AML). Dus, deze sgRNA bibliotheek screening aanpak biedt nieuwe inzichten in CTCF gemedieerde genoom organisatie in specifiek gen loci en biedt ook een basis voor de functionele karakterisering van de geannoteerde genetische regelgevende elementen, zowel codering en Noncoding, tijdens normale biologische processen in het post-menselijke genoom project tijdperk.

Inleiding

Recente genoom interactie onderzoek uitgewezen dat het menselijk genoom van de nucleaire vormen stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) die zijn bewaard in de celtypen en soorten. De organisatie van het genoom in aparte domeinen vergemakkelijkt en interacties tussen regelgevende elementen (bijvoorbeeld versterkers en initiatiefnemers) beperkt. De CCCTC-bindende factor (CTCF) bindt aan TAD grenzen en speelt een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich in aangrenzende TADs1 bevinden. Echter, genoom-brede CTCF bindende gegevens bleek dat hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, het vaak als een barrière van de chromatine op een specifieke site in één celtype maar niet in de andere fungeert, wat suggereert dat CTCF-functies samen met andere activiteiten in de vorming van chromatine grenzen2. Wat blijft onbekend is of de grens elementen (CTCF-bandplaatsen) rechtstreeks gekoppeld zijn aan de biologische functie van CTCF, en hoe deze koppelingen optreden. We veronderstellen daarom dat specifieke CTCF bandplaatsen in het genoom direct de vorming van TADs regelen en promotor/versterker interacties binnen deze domeinen of tussen naburige domeinen. De voltooiing van de mens en de muis genoom sequencing projecten en de daaropvolgende epigenetische analyses hebben ontdekt nieuwe moleculaire en genetische handtekeningen van het genoom. De rol van specifieke handtekeningen/wijzigingen in genexpressie en cellulaire functie, evenals hun moleculaire mechanism(s), moeten echter nog volledig worden begrepen.

Meerdere lijnen van bewijsmateriaal ondersteunen dat de CTCF-gemedieerde TADs functionele chromatine domeinen3,4,5 vertegenwoordigen Hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, bleek genoom-brede CTCF ChIP-seq gegevens dat de CTCF vaak als een barrière van de chromatine in één celtype maar niet in de andere2 fungeert. CTCF speelt een essentiële rol tijdens de ontwikkeling door het genoom organisatie4,6,7te bemiddelen. Verstoring van de CTCF grenzen verminderde versterker/promotor interacties en genexpressie, leidt tot ontwikkelingsstoornissen verstopping. Dit suggereert dat CTCF TADs gemedieerde zijn niet alleen de structurele onderdelen, maar ook de regelgevende eenheden vereist voor een juiste versterker actie en gene transcriptie5,8,9.

HOX -genen spelen een kritieke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en ze zijn stoffelijk als ruimtelijk beperkt in hun expressiepatronen. De locus HOXA vormt twee stabiele TADs anterior en posterior genen te scheiden door een element van de CTCF-geassocieerde grens in zowel hESCs als IMR90 cellen1. Uit recente rapporten blijkt dat HoxBlinc, een HoxB verbonden locus lncRNA, de vorming van CTCF bemiddelt geregisseerd TADs en versterker/promotor-interacties in de locus HOXB . Dit leidt tot anterior HOXB gene activering tijdens ESC inzet en differentiatie10. Anderzijds op specifiek gen loci met inbegrip van het HOXA locus, wijziging van de CTCF gemedieerde TAD domeinen veranderd lineage specifiek gen expressieprofielen en werd geassocieerd met de ontwikkeling van ziekte staten11,12. Het bewijs ondersteunt een primaire functie voor CTCF in coördinatie van de transcriptie van het gen en het bepalen van de cel identiteit door het organiseren van het genoom in functionele domeinen.

Ondanks haar rol in de ontwikkeling van het embryo, tijdens Haematopoiese, reguleren HOX -genen hematopoietische stamcellen en voorlopercellen functie van de cel (HS/PC). Dit wordt gedaan door het beheersen van het evenwicht tussen de proliferatie en differentiatie10,13,14,15. De expressie van HOX -genen is strak geregeld gedurende de specificatie en de differentiatie van hematopoietische cellen, met de hoogste expressie in HS / PCs. HOX genexpressie daalt geleidelijk tijdens de rijping, met het laagste niveau die zich in gedifferentieerde hematopoietische cellen16. HOX gene disregulatie is een dominante mechanisme van leukemische transformatie door dysregulating eigenschappen van de zelf-vernieuwing en differentiatie van HS/PCs leidt tot leukemische transformatie17,18. Het mechanisme van het opzetten en onderhouden van de normale vs. oncogene expressiepatronen van HOX -genen, alsmede bijbehorende regulerende netwerken blijft echter onduidelijk.

CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotheek screening is wijd verbeid gebruikt om te ondervragen van eiwit-codeert genen19 als ook als niet-codeert genen, zoals lncRNA20 en miRNA21 in verschillende soorten. De kosten voor het gebruik van de CRISPR-Cas9-sgRNA-bibliotheek te identificeren van nieuwe genomic doelstellingen blijft echter hoog, omdat high-throughput genoom sequencing vaak toegepast wordt om te controleren of de sgRNA bibliotheek screening. Onze sgRNA screening systeem is gericht op de specifieke genoom loci en resulteert in de targeting sgRNAs via one-step RT-PCR volgens de genexpressie markering, zoals HOXA9. Bovendien kan Sanger sequencing bevestigd dat de sgRNA werd geïntegreerd in het genoom, en Indel mutaties worden gedetecteerd om te identificeren van de sgRNA dat targeting site. Via de loci-specifieke CRISPR-Cas9 genetische screening, is de grens van de chromatine CBS7/9 geïdentificeerd als een kritische regulator voor totstandbrenging oncogene chromatine domein en het onderhoud van ectopische HOX gen expressiepatronen in AML pathogenese 12. de methode kan algemeen worden toegepast om te identificeren niet alleen specifieke functie van de CTCF grens in de embryonale ontwikkeling, Haematopoiese, leukemogenesis, maar ook CTCF grens als therapeutisch doelwit voor toekomstige Epigenetische therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. CTCF sgRNALibrary Design met behulp van een Online Tool

  1. Het ontwerp van de sgRNA dat targeting CTCF bandplaatsen in de menselijke HOX loci hulpprogramma voor het genetische perturbation platform (GPP) ontwerper (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Synthetiseren totaal 1,070 sgRNAs bestaande uit sgRNAs dat targeting 303 willekeurige targeting genen, 60 positieve controles, 500 niet-mens-targeting besturingselementen, en 207 CTCF elementen of lncRNA gericht op genen (Figuur 1, tabel 1). Elk targeting DNA element wordt gericht door 5-10 verschillende sgRNAs.

2. sgRNA bibliotheek klonen

  1. De samengestelde oligonucleotides klonen in de CRISPR lentivirale ruggengraat vector (lentiCRISPRv2).
    1. Het verteren van het LentiCRISPRv2 vector met BsmBI restrictie-enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    2. Kijk voor de aanwezigheid van de grotere band (ongeveer 12,873 bp) op de gel na BsmBI de spijsvertering, en vervolgens het zuiveren met de gel extractie kit.
      Opmerking: Een 2 kb kleine vuller stuk is ook aanwezig op de gel na vertering, maar dit moet worden genegeerd.
    3. De samengestelde oligonucleotides afbinden en verteerd LentiCRISPR vector met 150 ng van LentiCRISPR DNA, 1 µL van 10 µM oligos, 2 µL van 10 x T4 ligase buffer, 1 µL van T4 ligase, verteerd en vervolgens hen bij 16 ° C na een nacht bebroeden.
  2. Transformeer de lentivirale CRISPR/sgRNA-bibliotheek in electro-bevoegde cellen voor versterking.
    1. De electroporator bereiden op 1.8 kV, 200 Ω en 25 µF. Dan vooraf warm het herstel SOC media in een waterbad 37 ° C, en vooraf warm LB ampicilline antibiotica platen bij 37 ° C.
    2. Ontdooi de bevoegde cellen op ijs gedurende 10 minuten.
    3. Bereiden 1,5 mL micro-centrifuge buizen en 1 mm electroporation cuvettes op ijs.
    4. Meng 1 µL van een 10 ng/µL bibliotheek plasmide DNA in 25 µL van bevoegde cellen in een 1,5 mL micro-centrifuge buis, en zachtjes Meng door flicking de onderkant van de buis een paar keer handmatig.
    5. Zodra de cuvette koud genoeg is, het DNA/bevoegde mengsel van de cel naar het overbrengen. Tik tweemaal op het aanrecht en veeg eventuele waterdruppels vanaf de buitenkant van de Cuvet met een papieren zakdoekje. Vervolgens plaatst de cuvette in de module electroporation en druk op de pols.
    6. Voeg onmiddellijk 975 µL van 37 ° C voorverwarmde SOC media. Meng door omhoog en omlaag pipetteren en overdracht aan een tube van 15 mL.
    7. Draaien en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    8. Verdun 100 µL cellen in 900 µL van SOC media en 100 µL plaats op een LB ampicilline antibiotica agarplaat. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  3. Pak het plasmide DNA uit de gecombineerde koloniën een maxi-prep kolom gebruiken zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
    1. Schraap alle kolonies van de agarplaat LB en enten van een starter cultuur van 2 mL van LB antibioticum ampicilline medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met krachtig schudden (~ 200 x g).
    2. Verdun de starter cultuur 1:500 in 100 mL van LB ampicilline medium en Incubeer bij 37 ° C voor 12-16 h met krachtig schudden (~ 200 x g).
    3. Oogst van de bacteriële cel pellet door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
    4. Resuspendeer de bacteriële pellet in 10 mL schorsing buffer.
    5. Lyse van de gesuspendeerde pellet met 10 mL van de lysis-buffermengsel, en krachtig omkeren 4 - 6 keer. Incubeer de lysate gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Neutraliseer de lysate met 10 mL gekoeld neutralisatie Buffer. Meng door zachtjes het omkeren van de buisjes 4 - 6 maal en Incubeer het gedurende 20 min op ijs.
    7. Spin down bij 13.500 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Onmiddellijk overdracht het supernatant met de plasmide DNA aan een nieuwe buis.
    8. Herhaal stap 2.3.7 en snel overbrengen van de bovendrijvende substantie met de plasmide DNA aan een nieuwe buis.
    9. De kolom equilibreer door 10 mL evenwichtsinstelling buffer toe te passen en laat de kolom leeg door zwaartekracht stroom.
    10. De bovendrijvende substantie aan de kolom toevoegen en laat ze om de hars door zwaartekracht stroom.
    11. Was de kolom met 2 x 30 mL buffer te wassen.
    12. Elueer het DNA met 15 mL elutie buffer.
    13. Neerslaan van het DNA met 10,5 mL isopropanol en de kamertemperatuur aan eluted DNA. Mix en spin down onmiddellijk bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C en zachtjes de bovendrijvende vloeistof decanteren.
    14. Wassen van de DNA-pellet met 5 mL 70% ethanol, centrifuge DNA pellet bij 15.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant helder.
    15. Herhaal stap 2.5.14 tweemaal meer.
    16. Centrifugeer DNA pellet bij 15.000 x g gedurende 10 min, en zachtjes decanteren in de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de DNA-pellet.
    17. De pellet gedurende 5-10 min. drogen, en los van het DNA in een vereiste omvang van de buffer (TE buffer, pH 8,0).

3. de hoge Titer sgRNA bibliotheek Lentivirus generatie

  1. Cel voorbereiding: Cultuur HEK293T cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% (vol/vol) foetale runderserum (FBS) en 1% (vol/vol) penicilline-streptomycine (PS) antibioticum in T-25 kolven aangevuld. Plaats ze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Pakket lentivirus: Co transfect HEK293T cellen met 20 µg gezuiverde bibliotheek vectoren uit stap 2, 15 µg voor het pakket plasmide (psPAX2) en 10 µg voor de envelop plasmide (pMD2.G) voor 48 uur vóór het oogsten van de virussen.
  3. Virus collectie: na 48 h, collectthe virus supernatant en filteren het supernatant door een membraan van 0,45 µm laag eiwitgehalte bindende PVDF virus.
  4. Virus concentratie: concentreren van het supernatans dat lentivirale door de 50-fold met behulp van de concentrator en testen van het virus MOI in stap 5.
  5. Virus-opslag: Aliquot geconcentreerd virussen en winkel in een vriezer-80 ° C.

4. geoptimaliseerd Puromycin concentratie

  1. Cultuur van de cel leukemie: Cultuur MOLM13 AML cellen in RPMI 1640 aangevuld met 10% (vol/vol) foetale runderserum (FBS) en 1 x penicilline-streptomycine (PS) antibiotica in een maatkolf van T-125. Plaats ze in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: Cellen worden meestal iedere 4-5 d op een split-ratio van 1:4 of 1:6, nooit toestaan cellen te bereiken meer dan 70% confluentie doorgegeven.
  2. Instellen van MOLM13 cellen in een 12-well-plaat met een dichtheid van 1,0 x 104 cellen/mL, op een totaal volume van 2 mL per putje (2.0 x 104 cellen).
  3. Tijdsverloop assay: behandelen MOLM13 cellen met puromycin voor 7 dagen in de toenemende concentraties (0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL en 2,0 µg/mL)
    1. Van MOLM13 cellen zonder puromycin behandeling op dag 0 instellen en 3 repliceren wells zonder puromycin behandeling als een besturingselement vanaf dag 0 tot dag 7.
    2. Traktatie MOLM13 cellen met 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL en 2,0 µg/mL, afzonderlijk, repliceren met elke experimentele voorwaarde met 3 wells.
    3. De verhouding tussen de levende cellen tellen en maken een bocht van de overleving van dag 0 naar dag 7 met alle voorwaarden.
  4. Overleving curve: Stain cellen met Trypan blauw en graaf levensvatbaarheid dagelijks te verkrijgen van de curven van de overleving voor elke concentratie puromycin.
  5. Optimaliseren van de minimale puromycin concentratie: bepalen van de concentratie van de minimale puromycin door Trypan blauw kleuring, in welke alle MOLM13 cellen zijn gedood tussen 5-7 dagen.

5. titratie van lentivirale bibliotheek in MOLM13 leukemie cellen

  1. AML cellen voorbereiding: verzamelen MOLM13 AML cellen met de signaaltransductie medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS en 8.0 µg/mL coating medium) bij een dichtheid van 1.5 x 106 cellen /mL.
  2. Plaats MOLM13 cellen in de 12-well plaat met 1.5 x 106 cellen in elk putje.
  3. Ontdooi de lentivirus: Verwijder de geconcentreerde lentivirus uit de vriezer-80 ° C en het ontdooien op ijs.
  4. Mix MOLM13 cellen met een verschillende dosis van de geconcentreerde lentivirus in aparte putten, met inbegrip van 0, 1, 2.5, 5, 7,5 en 10 µL (totaal 6 groepen).
  5. Onmiddellijk na centrifugeren van deze mengsels bij 1.000 x g gedurende 2 uur bij 33 ° C en de 12-Wells-platen ook terug overzetten naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 uur.
  6. Na 4 uur, spin down de geïnfecteerde cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Zachtjes de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet, gecombineerd en resuspendeer de getransduceerde cellen met verse media (RPMI 1640, 10% FBS en 1% PS), en vervolgens overbrengen naar T-25 kolven en Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur zonder puromycin.
  8. Na 48u, deze cellen te splitsen in 2 flacons (2 groepen): een experimentele groep gedurende 5 dagen behandeld met 1 µg/mL puromycin, en een controlegroep zonder puromycin behandeling voor 5 dagen.
  9. Verrichten puromycin selectie voor 5 dagen met 1 µg/mL puromycin volgens de stap 4 totdat alle niet-getransduceerde controle cellen dood zijn. In ruil voor verse media om de 2 dagen.
  10. De geoptimaliseerde waarde van de MOI voor signaaltransductie meten door het verdelen van het aantal levende cellen behandeld met puromycin met het aantal cellen zonder puromycin behandeling.

6. transductie van de gebundelde CRISPR-Cas9 KO-bibliotheek

  1. Transductie met lentivirus: infecteren 1.5 x 106 MOLM13 cellen met 0.3 MOI van sgRNA gebundeld lentivirus in medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS, en 8 µg/mL coating medium) in 6-well plaat en de cellen zonder de lentivirus infectie als een besturingselement gebruiken.
  2. Onmiddellijk na centrifugeren van de 6-well plaat bij 1.000 x g gedurende 2 uur bij 33 ° C tot spinfect de cellen en de platen ook terug overzetten naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 uur.
  3. Spin down de geïnfecteerde cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Zachtjes bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet, gecombineerd en resuspendeer de getransduceerde cellen met verse media (RPMI 1640, 10% FBS en 1% PS), en vervolgens overbrengen naar T-25 kolven en Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur zonder puromycin.
  5. Na 48u, cellen met 1 µg/mL puromycin te behandelen voor 5 dagen. Verse media inruilen na 2 dagen en houd bij een optimale celdichtheid.
  6. Zaad van de één kloon in 96-wells-platen met verdunning methoden te beperken en deze één klonen bij 37 ° C en 5% CO2uit te broeden. Cultuur ze voor 3-4 weken.
  7. Nadat een eencellige in een bevolking opgroeit, breng de helft van de cellen in 24-Wells-platen voor verdere cultuur onder selectie van puromycin en controleer of deze klonen in de volgende stap. Houd de rest van de cellen.

7. de screening van de gebundelde CRISPR-Cas9 KO bibliotheek met One-step RT-qPCR

  1. Om de effectiviteit van de sgRNA geïntegreerde kloon toetsing door het evalueren van de expressie van de marker-gen HOXA9 met één stap reverse-transcriptase polymerasekettingreactie (RT-qPCR one-step) bepalen.
    Opmerking: HOXA9 zijn zeer uitgedrukt in MOLM13 AML cellen in leukemogenesis22,23.
  2. Graaf de sgRNA geïntegreerd MOLM13 cel en overdracht 1 x 104 cellen per putje aan een 96-Wells PCR plaat.
  3. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min, en vervolgens grondig verwijderen en verwijder het supernatant met een pipet zonder verstoring van de cel-pellet.
  4. Cellen met 125 µL van PBS buffer wassen en centrifugeren van de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min. Vervolgens verwijdert u 120 µL van het supernatans dat met behulp van een precisiepipet en behouden van ongeveer 5 µL van PBS in elk putje.
  5. Voeg 50 µL van de cellysis master mix met 48 µL van lysis van de cel buffer, 1 µL van proteïnase K-oplossing (10 mg/mL) en 1 µL van DNase oplossing (1 mg/mL) toe aan elk putje. Daarna Pipetteer op en neer 5 keer naar resuspendeer de pellet cel.
  6. Incubeer de mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 5 minuten bij 37 ° C, en vervolgens 75 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Bewaar de cel lysate aan-80 ° C vriezer.
  8. De voorbereiding van one-step RT-qPCR reactie: ontdooien de one-step-mix en andere onderdelen van de reactie tot 4 ° C. Draai vervolgens neer kort voor het verzamelen van oplossingen bij de bodem van de buizen en plaatsen op het ijs zonder licht. Meng en voorzichtig draaien.
  9. Voeg 1 µL van cel lysate de PCR putjes met de RT-qPCR-mix, met inbegrip van 1 µL van het marker-gen voorwaartse primer (300 nM) en reverse primer (300 nM), 0,125 µL van reverse-transcriptase (10 U/µL), en 5 µL van one-step reactie mix (2 x).
  10. Zegel van putjes met optisch transparante film, en zachtjes vortex en mengen van de componenten van de reactie.
  11. Plaats de 96-Wells-PCR-plaat op een real-time PCR-instrument.
  12. De reactie van de omgekeerde transcriptie voor 10 min lopen bij 50 ° C, gevolgd door polymerase inactivering en denaturatie van de DNA voor 1 min bij 95 ° C.
  13. RT-PCR met 40 cycli van PCR reactie uitvoeren: denaturatie voor 15 s bij 95 ° C, gloeien/uitbreiding en plaat fluorescentie lezen voor 20 s bij 60 ° C, waarna smelt de analyse van de curve bij 65-95 ° C via de stappen van 0,5 ° C bij 2-5 s/stap.
  14. Upregulated, werden en geen verandering groepen volgens de niveaus van de expressie van HOXA9 -gen in vergelijking naar het besturingselement, afzonderlijk instellen. Β-actine -gen als een huishouding gene besturingselement gebruiken.

8. controle van geïntegreerde sgRNAs positieve klonen door middel van genotypering en Sanger volgorde

  1. Controleer of de HOXA9 daalden expressie klonen door middel van Sanger sequencing en het uitvoeren van PCR met 50-100 ng MOLM13 genoom DNA, 5 µL polymerase reactie buffer (10 x), 1 µL voorste primer (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) en 1 µL omgekeerde primer (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 eenheid polymerase (5 U /µL). Uitvoeren van de PCR-reactie met de eerste denaturatie bij 94 ° C voor 30 s, en vervolgens meer denaturatie bij 94 ° C gedurende 20 s, gloeien bij 56 ° C gedurende 20 s, uitbreiding bij 68 ° C gedurende 20 s (totaal 30 cycli), de laatste uitbreiding bij 68 ° C gedurende 10 minuten , en vervolgens houden bij 4 ° C.
  2. Extraheren en te zuiveren van de PCR producten (grootte 285 bp) met een PCR zuivering Kit.
  3. Het afbinden van de gezuiverde PCR producten in de T-vector met 2 µL T4 afbinding buffer (10 x), 50 ng T vector DNA (50 ng/µL), 25 ng gezuiverd PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligase (3 eenheden/µL), en plaats de afbinding mengen in een incubator bij 16 ° C's nachts.
  4. Breng de afbinding mix in DH5α bevoegde cel, groeien op een antibioticum agarplaat voor LB-ampicilline en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  5. Kies de interne klonen van de LB-plaat en deze wilt controleren door genotypering en Sanger sequencing.

9. opsporing van sgRNAs ingegeven Indel mutatie door Nuclease spijsvertering Assay

  1. Detecteren dat de geïntegreerde één kloon sgRNA geïnduceerde Indel tarieven door een nuclease test test.
  2. PCR waarbij afzonderlijk te bereiden met 50-100 ng Indel mutant (test) en wild-type (WT, verwijzing) DNA als PCR sjabloon, 5 µL polymerase reactie buffer (10 x) 1 µL dNTP (10mM), 1 eenheid polymerase (5 U/µL), 1 µL voorste primer (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3'), en 1 µ L reverse primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). De PCR reactie werd uitgevoerd met de oorspronkelijke denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s, waarna denaturatie bij 98 ° C gedurende 20 s, gloeien bij 56 ° C gedurende 20 s, uitbreiding bij 72 ° C gedurende 30 s (totaal 30 cycli), en laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 10 minuten , en het bedrijf bij 4 ° C.
  3. Instellen van de heteroduplex mengsel groep met 200 ng van de "verwijzing" (20 ng/µL) en 200 ng van "test" (20 ng/µL) PCR waarbij in 0,2 mL PCR buis, en de homoduplex mengsel groep met slechts 400 ng van 'referentie' PCR waarbij als een besturingselement.
  4. Afzonderlijk Incubeer het mengsel van het heteroduplex en homoduplex bij 95 ° C gedurende 5 minuten in een 1 liter bekerglas gevuld met 800 mL water en vervolgens afkoelen geleidelijk tot kamertemperatuur te gloeien en vormen van heteroduplex of homoduplexes.
  5. Afzonderlijk digest 400 ng van de ontharde mengsel van heteroduplex en homoduplex met 1 µL indel mutatie detectie nuclease (2.5 U/µL) en 2 µL nuclease reactie buffer (10 x) bij 42 ° C gedurende 60 min.
  6. Analyseren van de verteerd monsters met agarose gelelektroforese, het heteroduplex mengsel DNA moet worden gesneden in kleine fragmenten (70-250 bp), en de homoduplex van DNA (320 bp) niet moet worden gesneden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CRISPR-Cas9-technologie is een krachtig onderzoekhulpmiddel voor functioneel genomisch studies. Het is snel ter vervanging van conventionele gene bewerken technieken en heeft hoge nut voor genoom-brede zowel individuele gene gerichte toepassingen. Hier, bevat de eerste individueel gekloonde loci-specifieke CRISPR-Cas9-gekleed sgRNA bibliotheek 1,070 sgRNAs bestaande uit sgRNAs dat targeting 303 willekeurige targeting genen, 60 positieve controles, 500 niet-mens-targeting besturingselement...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eiwit-codeert genen gerelateerde sgRNA bibliotheken zijn toegepast in een functionele screening systeem op identificatie van genen en netwerken regulering van de specifieke cellulaire functies via sgRNA verrijking24,25,26 ,27,28. Verschillende niet-coderende regio gerelateerde sgRNA bibliotheken werden ook getoond in gen-specifieke functionele screens voor di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben geen conflicten van belang aan dit verslag gerelateerde.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken ook Nicholas Cesari voor het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lipofectamine 3000 reagentThermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 cells Life Technologies C737303
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extract kitQIAGEN28706
QIAuick PCR purification kitQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step KitBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965084
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
Lenti-X Concentrator Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
Surveyor® Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Ultra-Low FreezersThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 IncubatorsThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water BathsThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
MiniAmp™ Thermal CyclerApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power SupplyThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Tube Rotator and RotisseriesVWR International10136-084
VWR® Incubating Mini ShakerVWR International12620-942
Analytical Balance MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ SpectrophotometerDeNovix Inc.DS-11 FX

Referenties

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR screeningCTCF bindingsplaatsenHOX genregulatielentivirale transductieRT qPCR analyseSanger sequencingnucleaseverteringsassayheteroduplexvormingMOLM13 cellen
HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.