Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59385

⸱

25 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

Samenvatting

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen in verschillende signalering trajecten speelt en is met name betrokken bij de coördinatie van de chromatine functie en DNA-geassocieerde processen. Deze modificatie omvat een sequentiële werking van verschillende enzymen, waaronder E1 ubiquitin-activatie, E2 ubiquitin-conjugating en E3 ubiquitin-ligase en wordt omgekeerd door deubiquitinases (DUBs). Alomtegenwoordige werking induceert afbraak van eiwitten of wijziging van de eiwit functie, inclusief modulatie van enzymatische activiteit, eiwit-eiwit interactie en subcellulaire lokalisatie. Een kritieke stap bij het aantonen van de eiwit alomtegenwoordige of deubiquitatie is het uitvoeren van in vitro reacties met gezuiverde componenten. Effectieve Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties kunnen sterk worden beïnvloed door de verschillende gebruikte componenten, enzym co-factoren, buffer condities en de aard van het substraat.  Hier bieden we stap-voor-stap protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties. We illustreren deze reacties met behulp van minimale componenten van de muis Polycomb repressieve complex 1 (PRC1), BMI1, en RING1B, een E3 ubiquitine ligase dat monoubiquitinates Histon H2A op lysine 119. Deubiquitisatie van nucleosomale H2A wordt uitgevoerd met behulp van een minimale Polycomb repressief Deubiquitinase (PR-DUB) complex gevormd door de humane deubiquitinase BAP1 en het DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domein van zijn co-factor ASXL2. Deze assays van alomtegenwoordige/deubiquitatie kunnen worden uitgevoerd in de context van recombinant nucleosomes die zijn gereconstitueerd met bacteriën gezuiverde eiwitten of inheemse nucleosomes die worden gezuiverd uit zoogdiercellen. We belichten de fijne kneepjes die een aanzienlijke impact kunnen hebben op deze reacties en we stellen voor dat de algemene principes van deze protocollen snel kunnen worden aangepast aan andere E3 ubiquitine ligasen en deubiquitinases.

Inleiding

Ubiquitination is een van de meest geconcongeerde post-translationele modificaties en is van cruciaal belang voor een breed scala aan organismen, waaronder gist, planten en gewervelde dieren. Ubiquitination bestaat uit de covalente gehechtheid van ubiquitin, een zeer geconconeerd 76 aminozuur polypeptide, om eiwitten te richten en treedt op in drie opeenvolgende stappen waarbij drie enzymen zijn betrokken, d.w.z. E1-activerende, E2-conjugating en E3 ligase1, 2,3. Deze post-translationele modificatie speelt centrale rollen in een breed spectrum van biologische processen. Inderdaad, de E3 ligases, die de specificiteit van de reactie bieden, vormen een grote superfamilie van enzymen en zijn de meest voorkomende enzymen van het ubiquitine-systeem4,5,6. De downstream effecten van het ubiquitineren van eiwitten zijn afhankelijk van de aard van de modificatie: monoubiquitination, multi-monoubiquitinatie, en lineaire of vertakte polyubiquitination. Monoubiquitination wordt zelden geassocieerd met proteasomale afbraak, maar in plaats daarvan is deze modificatie betrokken bij het bemedieren van verschillende signalering van gebeurtenissen. Polyubiquitination omvat de N-terminal of de lysine residuen in de ubiquitine-molecule zelf, en de bestemming van een polyubiquitineerd eiwit hangt af van welk residu betrokken is bij ubiquitine Chain extension. Het is al lang bekend dat polyubiquitination gemedieerd door lysine 48 van ubiquitine induceert proteasomale afbraak. Integendeel, polyubiquitination via lysine 63 van ubiquitine wordt vaak geassocieerd met eiwit activatie7,8,9. Net als bij andere belangrijke post-translationele modificaties, is ubiquitisatie omkeerbaar en wordt ubiquitine verwijdering van eiwitten verzekerd door specifieke proteasen die deubiquitinases (DUBs) worden genoemd, die zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van cellulaire processen 2 , 10. belangrijk, veel Dubs zijn zeer gespecialiseerd, en reguleren, door deubiquitination, specifieke substraten, wat aangeeft dat een fijne balans tussen Ubiquitination en deubiquitination essentieel is voor de eiwit functie. E3s en Dubs vormen samen met de proteasoom degradatie machines en accessoire factoren het ubiquitin proteasoom systeem (UPS, met > 1200 genen) die de belangrijkste signalerings trajecten reguleert, waarvan er verscheidene geassocieerd worden met celgroei en proliferatie, bepaling van het lot van cellen, differentiatie, Celmigratie en celdood. Belangrijker is dat deregulering van verschillende signalering van Cascades met alomtegenwoordige ziekten tumorigenese en neurodegeneratie aandoeningen5,11,12,13, 14.

Ubiquitination speelt pervasieve rollen in de chromatide biologie en DNA-afhankelijke processen15,16,17. Bijvoorbeeld, monoubiquitination van Histon H2A op lysine 119 (hierna H2A K119ub) is een kritische post-translationele modificatie die betrokken is bij transcriptionele repressie en DNA-reparatie18,19,20, 21,22. H2A K119ub wordt gekatalyseerd door het repressieve complex van Polycomb 1 (PRC1), dat een sleutelrol speelt bij het onderhoud van epigenetische informatie en zeer goed wordt bewaard van Drosophila tot mens. Canonical PRC1 wordt met name gevormd door de RING1B en BMI1, die het kern-E3 ubiquitine ligase-complex zijn dat verantwoordelijk is voor de bovengenoemde Ubiquitination-gebeurtenis22,23. In Drosophilawordt H2A monoubiquitination (H2A K118ub dat overeenkomt met H2A K119ub in zoogdieren) omgekeerd door de Dub Calypso, die samenwerkt met extra Sex Comb (ASX) die de Polycomb-repressieve Dub (PR-Dub) complex24vormt. Het zoogdier ortholog van Calypso, BAP1, is een tumor suppressor verwijderd of geïnactiveerd in verschillende menselijke maligniteiten25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguleert DNA-afhankelijke processen in de Nucleus en de door calcium-signalering gemedieerde apoptosis bij het endoplasmisch reticulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 assembleert multi-subunit eiwitcomplexen met transcriptie regelaars, met name ASXL1, ASXL2 en ASXL3 (asxls), drie orthologues van ASX38,43. Asxls gebruikt het domein deubiquitinase adapter (deubad), ook wel asxm Domain genoemd, om BAP1 Dub-activiteit te stimuleren35,36,44. Daarom speelt ASXLs belangrijke rollen bij het coördineren van BAP1 DUB-activiteit bij chromatine en meer in het algemeen zijn tumor suppressor-functie.

Er bestaan verschillende methoden om de processen van Ubiquitination en deubiquitination te bestuderen. Met name biochemische testen met behulp van eiwitten gezuiverd van bacteriën blijven zeer krachtig in het aantonen van directe alomtegenwoordige van, of verwijdering van ubiquitine van, specifieke substraten. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd om een reeks parameters te onderzoeken, zoals het bepalen van de eis van minimale complexen, het bepalen van reacties kinetiek, het definiëren van structuur/functie relaties en het begrijpen van de impact van pathologische gen mutaties. Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties op chromatine substraten met gezuiverde componenten. Als modelsysteem wordt in vitro Ubiquitination en deubiquitination van nucleosomale H2A eiwit gepresenteerd. Bacteriën-gezuiverde eiwitten geassembleerd in minimale complexen van RING1B/BMI1 en BAP1/DEUBAD worden gebruikt voor Ubiquitination of deubiquitinisatie van nucleosomale H2A, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. GSH-agarose Affiniteits zuivering van de GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin ligase complex

  1. Gebruik de pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) bacterie expressie construct om BL21 (DE3) bacteriën te transformeren (Zie tabel met materialen)23. Deze constructie kan de expressie van Murine RING1B domein 1-159 gefuseerde met BMI1 domein 1-109 met GST-tag in pGEX-6P-2 backbone.
  2. Voer een overnight starter cultuur door het inoculeren van RIL-bacteriën uitdrukken gst-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) in 20 ml lb Bouillon medium in aanwezigheid van 100 μg/ml ampicilline en 50 μg/ml chlooramfenicol. Incuberen door te schudden bij 37 °C 's nachts. Voeg de start cultuur op de volgende dag toe aan een 1 L kolf met 500 mL vers LB Bouillon medium (1/26 verdunning) met ampicilinaat en inbroed de kweek in de shaker bij 37 °C gedurende 2 tot 4 uur.
  3. Meet tijdens de incubatietijd de OD bij 600 nm met een spectrofotometer. Wanneer de bacteriecultuur 0,6 OD-eenheden bij 600 nm bereikt, neem dan een aliquot van 1 mL in een buisje van 1,5 mL als het niet-geïnduceerde monster. Voeg 400 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan de 1 L-cultuur om eiwit expressie te induceren. Incuberen bacteriën bij 25 °C gedurende 6 uur tot 's nachts.
    1. Centrifuge de 1 mL aliquots bij 14.000 x g gedurende 30 sec., gooi het supernatant weg, regeer de pellet in 200 ΜL Laemmli sample buffer en bewaar voor SDS-page en Coomassie Blue analyse van eiwit inductie.
  4. Breng de geïnduceerde bacteriecultuur uit de kolf in een schone centrifugatie fles en spin tot 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet met 40 mL koude PBS en spin neer bij 3.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
  5. Gooi de supernatant weg en Vries de pellet bij-80 °C of ga verder naar de volgende stap. Als de eiwitten worden geïnduceerd op het verwachte molecuulgewicht, gaat u verder met de volgende stap.
  6. Respendeer de bacterie pellet in 25 mL ijskoude lysisbuffer a (50 mm tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm PMSF, 0,5 mm dtt en 1/100 anti-protease cocktail met AEBSF, Aprotinine, Bestatin, E-64, Leupeptine en Pepstatin A). Zorg ervoor dat alle bacteriën pellet wordt geresuspendeerd. PMSF en anti-protease cocktail moeten vers worden toegevoegd aan de lysisbuffer, alleen ten tijde van de bacterie lysis.
    Let op: Houd het monster altijd op ijs.
    Opmerking: Lysozyme bij 100 μg/mL kan worden toegevoegd om de lysis van bacteriën te verbeteren.
  7. Inbroed de bacteriën lysaat op ijs voor 15 min. gebruik een probe-sonicator en sonificeren bij 70% uitgangs amplitude voor 30 s (4 – 5x) en centrifugeer vervolgens bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
    Let op: Tijdens sonicatie, houd altijd de monsters op ijs.
  8. Neem tijdens het centrifugeren 500 μL verpakte GSH-agarose kralen (50% slurry) in een buis van 15 mL en voeg 10 mL buffer a toe zonder PMSF en anti-proteasen. Meng kort en spin bij 2.500 g gedurende 3 minuten bij 4 °C, herhaal deze Wash stap nog twee keer en houd de parels op ijs.
  9. Na bacteriële lysaat centrifugeren, verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 50 mL. Neem een aliquot van 100 μL als totaal lysaat en voeg 100 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.
  10. Filtreer het lysaat door het filter van de porie spuit van 0,45 μm en meng het met de GSH kralen. Inbroed bij 4 °C met schudden gedurende 5 uur. Draai de parels op 2.500 x g gedurende 3 minuten, verwijder en sla het supernatant op als de doorstroming. Was de eiwitten-GSH gebonden kralen 6 keer (5 mL elk) met buffer A met anti-protease cocktail en PMSF.
  11. Na de laatste spoeling, breng de parels samen met 10 mL buffer in een lege chromatografie kolom, voeg 1,5 mL buffer A bevattende 25 mm glutathion, en verzamel de elutie door zwaartekracht in 1,5 ml microbuisjes. Herhaal de elutie procedure 4 keer.
    Opmerking: Glutathion stamoplossing wordt bereid op 200 mM concentratie in 50 mM tris-HCl, pH 7,5
  12. Neem een aliquot van 10 μL van elk van de 4 eluties en voeg 10 μL 2x Laemmli-monster buffer toe. Deze monsters zullen worden gebruikt voor SDS-PAGE en Coomassie Blue-analyse om de aanwezigheid en de zuiverheid van de gezuiverde eiwitten te bepalen.
    Opmerking: Houd na de laatste elutie de parels in buffer bij 4 °C voor recycling en toekomstig gebruik.
  13. Kies de eluteerde fracties die redelijke hoeveelheden gezuiverde eiwitten tonen voor verdere analyse. Maak kleine aliquots van het preparaat. Bewaar de gezuiverde eiwitten in-80 °C. Gewoonlijk zal de eiwitconcentratie variëren van 0,5 μg tot 2 μg per μL en kunnen monsters in deze toestand worden opgeslagen.
  14. Optioneel: Concentreer het monster of verander buffer met een 10K centrifugale filter unit

2. zuivering van het complex BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase

  1. Gebruik pET30a +-his-BAP138 en PDEST-MBP-deubad (ASXL2)35 bacteriële expressie constructies te transformeren BL21 (DE3) RIL bacteriën voor de productie van zijn-BAP1 en MBP-deubad respectievelijk.
  2. Voer twee afzonderlijke starters culturen van 's nachts uit door zijn-BAP1 en MBP-DEUBAD (ASXL2) uit te drukken in 20 ml lb Bouillon van ampicillaire medium met 50 μg/ml chlooramfenicol en het overeenkomstige antibioticum voor elk plasmide, 100 μg/ respectievelijk mL kanamycine of 100 μg/mL ampicillaire. Plaats op Shaker bij 37 °C.
  3. Voer stappen 1.3 – 1.6 uit.
  4. Respendeer de bacteriën pellets in 25 mL ijskoude lysisbuffer B (50 mM tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF en 1/100 anti-protease cocktail). Meng gelijke volumes van de his-BAP1 met de MBP-DEUBAD lysaten en inincuberen op ijs gedurende 15 min. Sonicaat en vervolgens Centrifugeer het lysaat zoals aangegeven in Protocol 1 (stap 9).
    1. Bereid tijdens de centrifugeren 500 μL verpakte ni-NTA agarose kralen (50% slurry) voor door ze driemaal te wassen met buffer B zonder PMSF en anti-protease cocktail.
  5. Na bacteriële lysaat centrifugeren, verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 50 mL. Neem een aliquot van 100 μL als totaal lysaat en voeg 100 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.
  6. Filtreer het lysaat door het filter van de porie spuit van 0,45 μm en meng het met de ni-NTA kralen. Inbroed bij 4 °C met schudden gedurende 5 uur. Draai de parels op 2.500 x g gedurende 3 minuten, verwijder en sla het supernatant op als de doorstroming.
    1. Was de kralen 6 keer (5 mL elk) met buffer B met 20 mm 1,3-diaza-2, 4-cyclopentadiene (imidazol).
      Opmerking: Maak een stamoplossing van 2 M imidazol bij pH 7,3.
  7. Breng na de laatste spoeling de parels met 10 mL buffer in een lege chromatografie kolom, voeg 1 mL buffer B met 200 mm imidazol toe en verzamel de elutie met de zwaartekracht in 1,5 ml microbuisjes met 10 ΜL dtt (500 mm) en 2 ΜL edta (500 mm , pH: 8). Herhaal de elutie procedure 4 keer. Neem 10 μL van elke elutie Fractie en voeg 10 μL 2x Laemmli-monster buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue-analyse. De gewenste fracties in het zwembad.
    Opmerking: Houd de kralen in buffer bij 4 °C voor recycling en toekomstig gebruik.
  8. Verdun het geeleerde complex 3 keer met buffer C (50 mM tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF en 1/100 cocktail van proteaseremmers) voorafgaand aan incubatie met de amylose agarose kralen.
    1. Bereid amylose agarose kralen (500 μL verpakt) door ze 2 keer te wassen met de buffer C zonder toevoeging van PMSF en anti-protease cocktail. Voeg de kralen toe aan de verdunde elutie en inbroed 's nachts bij 4 °C.
  9. Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 3 minuten en houd de stroom door. Was de eiwitten-grenzen kralen met 5 mL buffer C (5 – 6x).
  10. Houd het gezuiverde his-BAP1/MBP-DEUBAD complex op de amylose agarose kralen in buffer D (50 mm Hepes pH 8,0, 50 mm NaCl, 10% glycerol en 1 mm DTT) en bewaar bij-80 °c. Neem 20 μL van de kralen fractie (50% kralen oplossing) en Voeg 20 μL 2x Laemmli sample buffer toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue analyse.

3. zuivering van de Nucleosomes uit HEK293T cellen

  1. Cultuur HEK293T cellen in compleet Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% pasgeboren kalf serum (NBS), 2 mM L-glutamine, en 1% penicillaire/streptomycine.
  2. Plaat rond 12 x 106 HEK293T cellen in 20 ml complete media per 15 cm kweek schotel één dag voor de transfectie (10 gerechten werden gebruikt). Vóór de transfectie, verander het medium van de cel naar 12 mL serumvrij medium en transfect de cellen met 21 μg pCDNA-Flag-H2A met 63 μl polyethylenimine (PEI) op 1 mg/mL36. Wijzigen in volledig medium 12 uur later.
  3. Drie dagen na transfectie, was de cellen met 15 mL ijskoude PBS (tweemaal) en oogst ze in 3 mL ijskoude PBS met behulp van een celscraper. Centrifugeer bij 2.100 x g gedurende 8 minuten bij 4 °c. Gooi de PBS weg en ga verder naar de lysisstap of Vries de celpellet bij-80 °C.
  4. Respendeer de celpellet in ongeveer 10 volumes buffer E (50 mm tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm pmsf, 1/100 protease inhibitor cocktail en 20 mm N-methylmaleimide (NEM)) en incuberen op ijs gedurende 20 min. toevoegen N-methylmaleimide (NEM) is van cruciaal belang voor de remming van DUBs die samengaan met nucleosomes.
  5. Na centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en regeer de chromatide pellet in 10 volumes buffer E. mix door inversie en centrifuge bij 3.000 x g gedurende 5 minuten.
    1. Herhaal de wasstap nog een keer met behulp van buffer E en twee keer met behulp van buffer F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm CACL2, 0,3 M sucrose, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, en 1/100 protease inhibitor cocktail).
      VOORZICHTIG: pellet zal zweven tijdens het wassen en centrifugeren.
  6. Rebreng de chromatine in 5 mL buffer F en behandel de pellet met micrococcal Nuclease (mnase) (3 U/ml gedurende 10 min bij kamertemperatuur).
    Opmerking: De reactie kan worden geholpen door het mengen met behulp van een Dounce homogenisator.
  7. Neem na incubatie een aliquot van 40 μL van het mengsel voor analyse van nucleosomale DNA-fragmenten. Meng dit aliquot met 40 μL fenol/chloroform en 20 μL 6x DNA-laad buffer, Vortex, spin bij 18.000 x g gedurende 2 minuten en laad het DNA op een 2% agarose gel.
    1. Wanneer het DNA overwegend een 147 BP fragment is dat overeenkomt met mononucleosomes, stop dan de reactie door toevoeging van 5 mM EDTA in de uiteindelijke concentratie.
  8. Na centrifugeren bij 21.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c, incuberen de oplosbare chromatide fractie met Anti-Flag hars 's nachts bij 4 °c. Was de kralen met 6x buffer G (50 mm tris-HCl, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 proteaseremmers cocktail).
  9. Breng de parels met 5 mL buffer G over in een lege chromatografie kolom. Elute de met parels gebonden nucleosomes met 200 μg/ml vlag elutie peptide. Gebruik een elutie buffer die bestaat uit buffer G met 200 μg/ml vlag elutie peptiden (Zie tabel met materialen) en 1/5 (vol: vol) 1 M Tris, pH 8,0. Elute de nucleosomes 3x met 260 μL vlag elutie buffer (2 h elke elutie).
  10. Test de 3 eluties door een aliquot voor fenol-chloroform extractie te nemen en het DNA in een 2% agarose gel te laden. Neem 10 μL van elke elutie Fractie en voeg 10 μL Laemmli sample buffer 2x toe voor SDS-PAGE en Coomassie Blue Analysis en laad elke elutie voor de opsporing van de Western Blot van alomtegenwoordige H2A. Bewaar de elutie op-80 °C. In het algemeen levert zuivering van menselijke cellen minder eiwitten op dan die van bacteriën, met concentraties variërend van 0,1 tot 0,5 μg/μL.

4. nucleosome Ubiquitinatie assay met behulp van BMI1/RING1B E3 Ubiquitin ligase complex

  1. Centrifuge de nucleosomes door middel van 10K porie 0,5 mL centrifugale filters om het substraat van de elutie buffer te veranderen in de reactie buffer H (25 mm tris, pH 7,5; 10 mm MgCl2en 5 mm ATP). Als alternatief kunnen in de handel verkrijgbare nucleosomes worden gebruikt voor de test.
    Opmerking: Veranderende substraat suspensie oplossing voor reactiebuffer zorgt voor reproduceerbaarheid en voorkomt potentiële E3 ligase remming door verbindingen aanwezig in de vlag elutie mengsel.
  2. Incuberen 1 μg van de nucleosomes in 40 μL totaal volume van de buffer H. Voeg UB activerende enzym (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) en E2 UB-conjugerende enzymen (672 ng) en 1 μg BMI1/RING1B E3 ubiquitine ligase complex toe. Inincuberen de reactie voor 3 uur bij 37 °C met occasioneel schudden.
    Opmerking: Meerdere besturingselementen kunnen parallel worden uitgevoerd, inclusief weglaten, E1, E2, E3, ATP en ubiquitin. Dit zorgt voor de specificiteit van de ubiquitinatie reactie.
  3. Stop de reactie door 40 μL van 2x laemmli sample buffer toe te voegen en Histon H2A K119 Ubiquitination te analyseren door SDS-page en Western blotting, volgens standaardprocedures. Gebruik anti-H2A of anti-H2A K119ub antilichamen (Zie tabel met materialen).

5. in vitro Nucleosomale H2A DUB assay met behulp van BAP1/DEUBAD

  1. Gebruik de gezuiverde nucleosomes voor de in vitro deubiquitinatie test. Respendeer 100 – 500 ng van nucleosomes in 40 μL buffer I (50 mm tris-HCl, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL en 1 mm DTT). Voeg 1 μg BAP1 bacteriën toe-gezuiverd zijn-BAP1 en MBP-DEUBAD. Voer de deubiquitinatie-reactie gedurende 3 uur bij 37 °C af met occasioneel schudden.
  2. Stop de in-vitro reactie door 40 μL van 2x Laemmli-buffer toe te voegen en te analyseren door immunoblotting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

GST-BMI1 en RING1B eiwitten zijn goed geproduceerd in bacteriën en kunnen gemakkelijk worden geëxtraheerd in de oplosbare fractie. Afbeelding 1a toont een Coomassie blauwe kleuring voor een typische zuivering van het gst-BMI1-RING1B complex. De GST-BMI1-en RING1B-bands migreren naar het verwachte molecuulgewicht, respectievelijk ~ 45 kDa en ~ 13 kDa. Met name de E3 ligase complex is zeer homogeen met zeer lage niveaus van bacteriën eiwitten contaminanten en/o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende voordelen van het opzetten van robuuste in vitro Ubiquitination en deubiquitinisatie assays voor eiwitten van belang. Deze testen kunnen worden gebruikt om: (i) optimale omstandigheden vast te stellen en minimale vereiste voor deze reacties te definiëren, (II) enzymatische kinetische en biochemische constanten te bepalen, (III) de rollen te definiëren van cofactoren of remmers die deze reacties kunnen beïnvloeden, (IV) Identificeer interactie-interfaces, (v) test de impact van kunstmatige of ziekteb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

We danken Diana Adjaoud voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoeksraad van Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) en Genome Canada (2016-2019) tot E.B.A. E.B.A. is een senior geleerde van het Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L. M en N.S.K. hebben een doctoraats beurs van de FRQ-S. H. B had een doctoraats beurs van het ministerie van hoger onderwijs en van wetenschappelijk onderzoek van Tunesië en de Cole Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amylose agarose beadsNew England Biolabs#E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10KSigma-Aldrich#UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub)Cell Signaling Technology#8240
Anti-Flag-agarose beadsSigma-Aldrich#A4596
Anti-protease cocktailSigma-Aldrich#P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteriaAgilent technologies#230240
DMEMWisent#319-005-CL
Empty chromatography columnBiorad#731-1550
Flag peptideSigma-Aldrich#F3290
GSH-agarose beadsSigma-Aldrich#G4510
HEK293TATCC#CRL-3216
ImidazoleSigma-Aldrich#I5513
Micrococcal nuclease (MNase)Sigma-Aldrich#N3755
Ni-NTA agarose beadsThermoFisher Scientific#88221
N-methylmaleimide (NEM)Bioshop#ETM222
Pore syringe filter 0.45 μmSarstedt#83.1826
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc#23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)Addgene#63139
Ub Activating Enzyme (UBE1)Boston Biochem#E-305
UBCH5C (UBE2D3)Boston Biochem#E2-627
```

Referenties

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385(2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ubiquitinatie assaydeubiquitinatie assayE3 ubiquitine ligasedeubiquitinasecomplexeiwitzuiveringWestern blottinghiston H2ABMI1 RING1BBAP1 DEUBAD
In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.