Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Samenvatting

Proteomic profilering van tyrosine-nitraat eiwitten is een uitdagende techniek vanwege de geringe overvloed van de 3-nitrotyrosine modificatie. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak voor nitropeptide verrijking en profilering met behulp van angiotensine II als model. Deze methode kan worden uitgebreid voor andere in vitro -of in vivo -systemen.

Samenvatting

Eiwit nitraat is een van de belangrijkste post-translationele modificaties (PTM) op tyrosine residuen en kan worden geïnduceerd door chemische acties van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en reactieve stikstof soorten (RNS) in eukaryote cellen. Nauwkeurige identificatie van nitratie plaatsen op proteïnen is essentieel voor het begrip van de fysiologische en pathologische processen met betrekking tot eiwit nitraat, zoals ontsteking, het verouderen, en kanker. Aangezien de nitraat proteïnen van lage overvloed in cellen zelfs onder veroorzaakte voorwaarden zijn, zijn geen universele en efficiënte methodes ontwikkeld voor het profileren en de identificatie van eiwit nitraat plaatsen. Hier beschrijven we een protocol voor nitropeptide verrijking met behulp van een chemische reductie reactie en biotine etikettering, gevolgd door een hoge resolutie massaspectrometrie. In onze methode, nitropeptide derivaten kunnen worden geïdentificeerd met een hoge nauwkeurigheid. Onze methode vertoont twee voordelen ten opzichte van de eerder gerapporteerde methoden. Eerst wordt dimethyl labeling gebruikt om de primaire amine op nitropeptides te blokkeren, wat gebruikt kan worden om kwantitatieve resultaten te genereren. Ten tweede, wordt een disulfide band die NHS-Biotine reagens bevat gebruikt voor de verrijking, die verder kan worden verminderd en Gealkyleerde om het opsporings signaal op een massaspectrometer te verbeteren. Dit protocol is met succes toegepast op het model peptide angiotensine II in het huidige papier.

Inleiding

De nitraat van tyrosine residuen in proteïnen aan vorm 3-nitrotyrosine regelt vele biologische processen. Wegens de verschillende chemische eigenschappen tussen tyrosine en 3-nitrotyrosine, kan een nitraat proteïne verstoord signalerende activiteit^1,2hebben. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen die nitraat sites op eiwitten efficiënt kunnen verrijken en identificeren. Als 3-nitrotyrosine is een lage overvloed modificatie op eiwitten in vergelijking met andere vormen van PTM, zoals phosphorylation en acetylatie, is het een uitdaging om endogene nitratie plaatsen direct te identificeren van de cel lijnen of weefselmonsters. Toch is de methodologie van het gebruik van massaspectrometrie (MS) om het fragmentatie patroon van nitrotpeptide te karakteriseren is ontwikkeld (bijvoorbeeld, & inde richting van de van de nitroproteomics.

Momenteel is een verrijking stap gevolgd door MS is de meest krachtige strategie voor nitropeptide profilering^4,5. De verrijkings methodes kunnen in twee klassen worden geclassificeerd. Een klasse is gebaseerd op antilichamen die kunnen herkennen 3-nitrotyrosine specifiek, terwijl de andere klasse is gebaseerd op de chemische afleiding die een Nitro groep vermindert tot een aminegroep^4,5. Voor de antilichaam-gebaseerde methode, nitrotyrosine affiniteit kolom wordt gebruikt voor de verrijking, waaruit de geëlueerd materiaal wordt verder opgelost en geanalyseerd door hoge resolutie MS^6,7. Voor de chemische afleiding-gebaseerde methode, de amine groepen op de N-Terminus van de peptide of lysine moet worden geblokkeerd in de eerste stap, hetzij door acetylatie, isobaar Tags voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ), of tandem massa Tags () reagentia. Vervolgens wordt een reducer gebruikt om nitrotyrosine te verminderen tot aminotyrosine gevolgd door het wijzigen van de nieuw gevormde aminegroep, die biotine afbinding, sulphydryl peptide conversie, of andere vormen van tagging systemen omvat^{8,9, 10,11}. De meeste van de tot nu toe vastgestelde protocollen zijn gebaseerd op in vitro over-nitrated eiwitten, in plaats van endogene nitraat eiwitten.

In de huidige studie, een gewijzigde procedure van de chemische afleiding van nitrotyrosine is ontwikkeld voor de nitropeptide verrijking en identificatie, waaruit blijkt verbeterde gevoeligheid tijdens MS detectie en is geschikt voor kwantificering doel. Onze recente studie in dienst van deze methode in biologische systemen vastgesteld dat de nitraat van lymfocyten-specifieke eiwit tyrosine kinase (LCK) op Tyr394 door RNS geproduceerd uit myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) speelt een belangrijke rol in de immunosuppressie van de tumor microenvironment¹². Daarom kan onze methode van nitropeptide identificatie ook worden toegepast op complexe biologische monsters. Hier beschrijven we ons protocol met behulp van het model peptide angiotensine II, waarvan de versnippering patroon is bekend en op grote schaal gebruikt in nitroproteomic studies^8,9,10,11, als een voorbeeld.

Protocol

1. nitraat van angiotensine II

1. Voor het genereren van nitraat peptide, Verdun 10 l van angiotensine II (DRVYIHPF) ouder oplossing (2 mM in water) in 390 l PBS oplossing (10 mM NaH₂po₄, 150 mM NaCl, pH 7,4) bij de uiteindelijke concentratie van 50 μM.
2. Voeg 10 l van peroxynitriet (200 mM in 4,7% NaOH) toe aan de angiotensine II-oplossing om de uiteindelijke concentratie van peroxynitriet 5 mM te maken.
   Nota: peroxynitriet is onstabiel en gemakkelijk op te lossen wanneer het in zure vorm is, zodat wordt de ouder oplossing van peroxynitriet gehouden in basisoplossing en in-80 °C opgeslagen.
3. Stel de pH-waarde van de oplossing in op 7-8 met 1 M HCl. Voor het initiëren van de nitraat reactie, schud de buis op 400 rpm voor 5 min.
4. Gebruik een commercieel beschikbare omgekeerde fase SPE kolom (Zie de lijst van materialen) voor het ontzouten.
   1. Bereid 2 oplossingen voor het ontzouten, 5% methanol in water voor het wassen en 80% methanol in water voor de elutie.
   2. Voeg 500 l van methanol toe, gevolgd door 500 l van water om de kolom voor te bereiden, zet 1 mL pipetter met de tip boven in de kolom, druk op de pipetten om de stroom te versnellen.
   3. Laad 410 l van het monster in stap 1,3 op de kolom, gooi de stroom door.
   4. Gebruik na het wassen met 500 l van 5% methanol 300 l van 80% methanol om de nitropeptide te Elueer, die vervolgens volledig gedroogd wordt door Speed-VAC in de standaardinstelling bij kamertemperatuur.
      Nota: het ontzouten is zeer belangrijk voor de reacties, aangezien het oplosmiddel dat in de vorige stap wordt verlaten een negatief effect op de volgende stappen kan hebben.

2. alkylering van primaire aminen door dimethyl etikettering

1. Hervormen de poedervormige Nitro-angiotensine II in 100 l van 100 mM triethylammoniumchloride bicarbonaat (TEAB) oplossing.
   Opmerking: de pH-waarde van de oplossing moet tussen 7 en 9 liggen en ervoor zorgen dat er geen primaire amine in de oplossing wordt toegevoegd.
2. Voeg 4 l van 4% formaldehyde aan de oplossing toe, meng kort.
   Let op: formaldehyde dampen zijn giftig; Voer de experimenten uit in een rook kap.
3. Voeg 4 l van 0,6 M Nicky₃CN toe aan de oplossing, schud de tube bij 400 rpm voor 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Blus de label reactie door 16 l van 1% ammoniakoplossing toe te voegen, Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
5. Voeg 8 l van het vorm zuur toe om de oplossing te Breng en ontzouten uit te voeren met behulp van een omgekeerde fase SPE-kolom zoals beschreven in stap 1,4.

3. reductie van nitrotyrosine tot aminotyrosine

1. Hervormen de dimethyl het label Nitro-angiotensine II in 500 l van PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mM NaCl, pH 7,4).
2. Voeg 10 l van 1 M natrium dithionate toe aan de oplossing en broed op kamertemperatuur voor 1 uur. Na de reductie reactie wordt de gele kleur van de oplossing duidelijk.
   Opmerking: Weeg 174,1 mg natrium dithionate en los het op in water om het uiteindelijke volume te maken is 1 mL. Deze oplossing kan worden opgeslagen bij-20 °C niet langer dan een week.
3. Gebruik de kolom reverse Phase SPE voor het ontzouten zoals beschreven in stap 1,4.

4. Biotinylation, verrijking en opsporing

1. Hervormen de dimethyl met het label amino angiotensine II in 500 l van PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mM NaCl, pH 7,4).
2. Voeg 5 l van 40 nM NHS-S-S-biotine, opgelost in DMSO, aan de oplossing toe, na 2 h incubatie bij kamertemperatuur, gebruik 1 l van 5% hydroxylamine om de reactie te doven.
3. In de tussentijd, equilibrate streptavidin agarose kralen door toevoeging van 500 l van PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mM NaCl, pH 7,4), centrifugeren bij 580 x g voor 5 min bij kamertemperatuur en de teruggooi van de bovendrijvende. Voer de evenwicht 3 keer.
4. Voeg 100 l streptavidin agarose kralen toe aan het reactiesysteem, Incubeer 1 h op een roterende Shaker bij kamertemperatuur. Was 4 keer met PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mM NaCl, pH 7,4). Voor elke wassen stap, voeg 500 l van PBS aan de kralen, meng goed, dan centrifuge op 580 x g voor 5 min bij kamertemperatuur en gooi de bovendrijvende.
5. Gebruik 400 l van 10 mM dithiothreitol (DTT) om te broeden met agarose kralen bij 50 °C voor 45 min, spin neer op 580 x g voor 5 min bij kamertemperatuur en gooi de kralen, Voeg 20 l van 0,5 M IDOACETAMIDE (IAM) aan de bovendrijvende voor 20 min in de duisternis.
   Nota: DTT wordt gebruikt om de disulfide band tussen de verbinding van biotine en peptide te breken, wordt de laatstgenoemde vrijgegeven van parels en verdere Gealkyleerde door IAM.
6. Gebruik omgekeerde fase SPE kolom voor de ontzouten weergegeven in stap 1,4.
7. Na het oplossen van de droge peptiden in 20 l van 0,1% vorm zuur (FA), onder voorbehoud van het product van elke sectie aan vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) analyse.
   1. Scheid de gemodificeerde ang II peptiden door een 60 min gradiënt elutie (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) aan een debiet 0,300 l/min met nano-HPLC systeem dat is direct geinterfaced met de hoge resolutie massaspectrometer.
      Opmerking: de analytische kolom is in 75 μm ID, 150 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% vormend zuur, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% vormend zuur.
   2. Bedien de massaspectrometer in de data-afhankelijke acquisitie modus, stel een enkele Full-scan massaspectrum (300-1800 m/z, 60 000 resolutie), gevolgd door 20 data-afhankelijke MS/MS scans op 28% genormaliseerd botsing energie.
   3. Open massaspectra gegevens en Identificeer de pieken van het product in elke stap om de chemische reactie te bevestigen is met succes uitgevoerd.

5. kwantificering van nitropeptide

1. Bereid 3 sets van Nitro-angiotensine II oplossingen van stap 1,4, elke set met 2 concentraties van Nitro-angiotensine II: set #1, 20 nmol in tube A en 20 nmol in tube B, elk in 100 l TEAB oplossing; Stel #2, 10 nmol in tube C en 20 nmol in tube D, elk in 100 l TEAB oplossing; Stel #3, 40 nmol in tube E en 10 nmol in tube F, elk in 100 l TEAB oplossing.
   Opmerking: de twee concentraties van Nitro-angiotensine II in elke set worden gebruikt voor dimethyl etikettering, om te reageren met formaldehyde (licht) en formaldehyde-D2 (heavy), respectievelijk.
2. Voeg voor elke set 4 l van 4% formaldehyde en formaldehyde-D2 toe aan het monster als licht en zwaar, respectievelijk. Volg de stappen 2,3 tot en met 2,5 om de dimethyl labeling te voltooien.
3. Meng de lichte en zware gelabelde monsters.
4. Volg de stappen van 3,1 tot 4,6 voor de vermindering, biotinylation, verrijking, en opsporing.

Resultaten

Het stroomdiagram voor nitropeptide profilering in dit manuscript is te zien in Figuur 1. Figuur 2, 3, 4 en 5 tonen de massaspectra van angiotensine II, Nitro-angiotensine II, dimethyl met het label Nitro-angiotensine II en dimethyl met het label amino angiotensine II, respectievelijk. Het molecuulgewicht van de verbinding kan worden weerspiegeld door de m/z-waarden van de mono-isotoop piek in elk cijfer, met ve...

Discussie

Het protocol beschrijft hier de nitropeptide verrijking en profilering. Met behulp van angiotensine II als het model peptide, illustreerden we de procedure weergegeven in Figuur 1. Na het verkrijgen van de Nitro-angiotensine II, moet de primaire amine op het peptide worden geblokkeerd om de verdere amine vervoeging te voorkomen, dat is een van de meest kritieke stappen binnen het protocol. In het huidige protocol wordt dimethyl labeling gebruikt om de primaire aminen om twee redenen te blokk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo