Methodenartikel

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

DOI:

10.3791/59398

⸱

2 mei 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitophagy is een essentieel mitochondriale kwaliteitscontrole traject, dat van cruciaal belang is voor beta-cel Bioenergetica van de alvleesklier om glucose-gestimuleerde insuline vrij te maken. De beoordeling van mitophagie is uitdagend en vereist vaak genetische verslaggevers of meerdere complementaire technieken die niet gemakkelijk worden gebruikt in weefselmonsters, zoals primaire menselijke alvleesklier eilandjes. Hier demonstreren we een robuuste aanpak om de vorming van belangrijke endogene mitophagie complexen in primaire menselijke pancreas eilandjes te visualiseren en kwantificeren. Met behulp van de gevoelige nabijheid ligatie assay techniek om interactie van de mitophagy regelgevers NRDP1 en USP8 te detecteren, zijn we in staat om specifiek de vorming van essentiële mitophagy complexen in situ kwantificeren. Door deze benadering van contra kleuring voor de transcriptiefactor PDX1 te koppelen, kunnen we mitophagische complexen kwantificeren, en de factoren die mitophagie kunnen aantasten, met name binnen bètacellen. De methodologie die we beschrijven, overkomt de noodzaak voor grote hoeveelheden cellulaire extracten die nodig zijn voor andere eiwit-eiwit interactiestudies, zoals immunoprecipitatie (IP) of massaspectrometrie, en is ideaal voor kostbare menselijke eilandje monsters die over het algemeen niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar zijn voor deze benaderingen. Verder wordt met deze methodologie de noodzaak van flow Sorteer technieken voor het zuiveren van bètacellen van een heterogene eilandje populatie voor downstream eiwit toepassingen overbodig. Zo beschrijven we een waardevol protocol voor visualisatie van mitophagy dat zeer geschikt is voor gebruik in heterogene en beperkte celpopulaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pancreas bètacellen produceren de insuline die nodig is om normale glucose homeostase te handhaven, en hun falen resulteert in de ontwikkeling van alle vormen van diabetes. Bètacellen behouden een robuuste mitochondriale capaciteit om de energie te genereren die nodig is om het glucose metabolisme te koppel met insulineafgifte. Onlangs, het is duidelijk geworden dat het onderhoud van de functionele mitochondriale massa is van cruciaal belang voor optimale beta-cel functie1,2,3. Om functionele mitochondriale massa te ondersteunen, bètacellen vertrouwen op kwaliteitscontrolemechanismen te verwijderen disfunctionele, beschadigde, of veroudering mitochondriën4. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat bètacellen afhankelijk zijn van een gespecialiseerde vorm van mitochondriale omzet, genaamd mitochondriale autophagy (of mitophagy), om de mitochondriale kwaliteitscontrole in zowel knaagdieren als menselijke eilandjes1te behouden, 2,5. Helaas was er echter geen eenvoudige methode om mitophagie te detecteren, of endogeen uitgedrukt mitophagy componenten, in menselijke pancreas bètacellen.

We hebben onlangs aangetoond dat de upstream regulatie van mitophagie in bètacellen berust op de vorming van een eiwit complex bestaande uit de E3 ligasen CLEC16A en NRDP1 en de deubiquitinase USP81. NRDP1 en USP8 zijn onafhankelijk aangetoond dat ze de mitophagie beïnvloeden door middel van actie op de sleutel mitophagy initiator Parkin6,7. NRDP1 richt PARKIN op voor alomtegenwoordige en afbraak om mitophagy6uit te schakelen, en USP8 specifiek deubiquitinates K6-gebonden Parkin om de translocatie te bevorderen naar mitochondriën7. Proximity ligatie assay (PLA) technologie is een recente voorschot op het gebied van eiwit interactie biologie8, waardoor visualisatie van endogene eiwit interacties in situ in enkele cellen, en is niet beperkt door schaars monster materiaal. Deze methodologie is vooral aantrekkelijk voor menselijke eilandje/Beta celbiologie, als gevolg van de spaardheid van sample beschikbaarheid, gekoppeld aan de noodzaak voor het begrijpen van fysiologisch relevante eiwitcomplexen binnen heterogene celtypen.

Met behulp van de PLA-aanpak, zijn we in staat om belangrijke endogene mitophagy complexen in primaire menselijke pancreas bètacellen en neuronale cellijnen te observeren, en tonen de effecten van een diabetogenic omgeving op de mitophagy pathway1. Samenvattend, het overkoepelende doel van dit protocol is om specifieke mitophagy eiwitcomplexen te analyseren in weefsels die overvloedig materiaal missen, of waar conventionele eiwit-interactiestudies niet mogelijk zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van de geïdentificeerde donor humane pancreas eilandjes is via een vrijstelling van de institutionele Review Board (IRB) en in overeenstemming met het IRB-beleid van de Universiteit van Michigan. Menselijke pancreas eilandjes werden geleverd door het NIH/NIDDK-gesponsord geïntegreerd Islet-distributieprogramma (IIDP).

1. monstervoorbereiding voor menselijke eilandje

  1. Dissociatie van één cel
    1. Cultuur menselijke eilandje monsters (4000 – 6000 eilandje equivalenten/10 ml media) gedurende ten minste 1 dag bij 37 °c in de alvleesklier Islet media (PIM (S)) media aangevuld met 1 mm glutamine (PIM (G)), 100 eenheden/ml antimycotic-antibioticum, 1 mm natrium pyruvaat en 10% foetale runderen serum (FBS) of humaan AB-serum.
    2. Gebruik een dissectie lichtmicroscoop bij 3x vergroting om individuele menselijke eilandjes uit de cultuur te tellen. Kies 40 eilandjes per behandeling/staat van belang (zoals glucolipotoxiciteit) in 1,5 mL Tubes in Islet media.
    3. Centrifuge-eilandjes bij 400 x g gedurende 1 minuut bij 10 °c tot sediment.
    4. Was monsters, met een korte inversie van buisjes bij kamertemperatuur, tweemaal met 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 50 μM PR619 (een deubiquitinase-remmer; om ubiquitine-afhankelijke eiwit interacties te behouden), met centrifugeren tussen elke Wash op 400 x g gedurende 1 minuut bij 10 °c.
    5. Dissociate eilandjes in enkele cellen met 125 μL van 0,25% trypsine met 50 μM PR619 door inwarmed trypsine (37 °c) gedurende 3 minuten met pellets van Islet te bebroed. Tijdens deze periode u de eilandjes voorzichtig dispergeren met behulp van een pipet met een 200 μL.
    6. Quench de trypsine met 1 ml opgewarmd (37 °c) PIM (S) media met 50 μM PR619, vervolgens sediment cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 1 minuut.
    7. Spoel cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 1 minuut, tweemaal, met PBS + 50 μM PR619.
    8. Tot slot, respendeer cellen in 150 μL PBS met 50 μM PR619.
  2. Hechting en fixatie van enkelvoudige cellen
    1. Na resuspensie draait u de celoplossing op matte, geladen Microscoop-dia's met een cytocentrifuge bij 28 x g gedurende 10 minuten.
    2. Volg na cytocentrifugeren het cellulaire gebied op met een hydrofobe pen (Zie de tabel met materialen) om de benodigde hoeveelheid antilichamen/Pla-oplossingen te minimaliseren. Repareer cellen met 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      Let op: PFA is gevaarlijk en moet voorzichtig behandeld worden.
    3. Voor de beste resultaten voert u vlekken/PLA onmiddellijk uit of binnen 24 uur. Indien nodig, bewaar de monsters in PBS bij 4 °C tot de kleuring niet langer dan 48 uur.

2. immunohistochemie

  1. Blokkeren
    1. Was de cellen tweemaal met 1x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Blok cel oplossing, om achtergrondkleuring te elimineren, met 10% Donkey serum in PBS met 0,3% afwasmiddel (Zie de tabel met materialen) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Kleuring
    1. Inbroed cellen met primaire muizen of konijnen antilichamen tegen respectievelijk USP8 (1:250) en NRDP1 (1:250) (Zie de tabel met materialen) verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing met afwasmiddel (PBT, Zie tabel van materialen), bij 4 °c 's nachts, om Detecteer mitophagy complexe signalering via PLA.
    2. Voeg cellen samen met een marker die specifiek is voor bèta-celidentificatie die niet in de muis of het konijn is gerezen om het PLA-signaal niet te verstoren. In dit geval incuberen cellen met anti-geit PDX1 (1:500) in PBT. Inincuberen alle primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° c, met behulp van plastic folie bovenop de oplossing om verdamping te voorkomen.

3. ligatie test bij de nabijheid

  1. PLA-sonde en contra vlek
    1. Bereid de PLA-sonde oplossing volgens de instructies van de fabrikant, d.w.z. Maak 20 μL sonde oplossing per monster door een eindconcentratie van 1:5 oplossing van zowel anti-muis-als anti-konijnen sonde in PBT te bereiden en gedurende 20 minuten in de kamer te incuberen Temperatuur.
    2. Na een nachtelijke incubatie, spoel de cellen tweemaal met 1x PBS gedurende 5 minuten per stuk, op een rocker.
    3. Net voor incubatie met sonde oplossing, Voeg anti-geit Cy5 secundair bij een eindconcentratie van 1:600 aan de sonde oplossing (voor detectie van endogene PDX1). Voeg 20 μL sonde oplossing toe aan elke celaandoening, bedek zachtjes met plastic folie en inincuberen bij 37 °C gedurende 1 uur.
  2. Afbinding
    1. Was cellen tweemaal, bij kamertemperatuur, met buffer A (Zie de tabel van de materialen voor het recept) voor 5 min elk, op een rocker.
    2. Bereid ligatie oplossing (een deel van de detectie reagentia, Zie tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Voor dit, verdund ligatie bestand (5x) 1:5 in diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water. Voeg onmiddellijk vóór incubatie 0,025 U/mL ligase toe. Voeg 20 μL ligatie oplossing toe aan cellen. Bedek met plastic folie en inbroed bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  3. Versterking
    1. Was de cellen tweemaal bij kamertemperatuur met buffer A gedurende 2 min elk.
    2. Maak een versterkings oplossing (een deel van de detectie reagentia, Zie tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Verdun de versterkings buffer (5x) 1:5 in DEPC-behandeld water en blijf in het donker tot het gebruik. Voeg een 1:80 verdunning van de polymerase (een deel van de detectie reagentia, Zie tabel van de materialen) toe aan de oplossing onmiddellijk voorafgaand aan het toevoegen van de oplossing aan de cellen.
    3. Voeg 20 μL versterkings oplossing toe aan de cellen. Afdekking met plastic folie en plaats in het donker bij 37 °C voor tussen 1 h 40 min tot 2 h voor maximaal signaal.
  4. Voorbereiding voorbeeld vorming
    1. Was de cellen tweemaal met buffer B (Zie de tabel van de materialen voor het recept) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, op een rocker.
    2. Tot slot, spoel de cellen eenmaal in 0,01 x buffer B, gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op een rocker.
    3. Monteer samples door een druppel bevestigings medium met 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) toe te voegen en zorgvuldig een dekslip over de monsters te plaatsen met behulp van een scalpel-blad om eventuele bubbels te persen. Seal covers met transparante nagellak rond de randen.
    4. Beeld monsters op een microscoop die meerdere focal vlakken kan vastleggen, zoals een laser scanning confocale Microscoop, of een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met deconvolutie capaciteiten, waarbij ten minste 9 verschillende focale vlak beelden worden genomen.
      1. Leg beelden vast met een vergroting van 100x, met ongeveer 0,45 mm z-stack hoogte. Capture PLA bij 550 nm excitatie, 570 nm-emissie; contra vlek bij 650 nm excitatie, 670 nm emissie; en DAPI bij 405 nm excitatie, 450 nm-emissie.
    5. Om ervoor te zorgen fluorescentie beeld achtergrond signalen en strooilicht worden geminimaliseerd voor downstream analyse van Pla-gebeurtenissen (met name op Widefield microscopen), proces beelden met behulp van een tweedimensionale deconvolutie (naaste buur) algoritme door middel van een standaard beeldverwerkingssoftware naar keuze.
      Opmerking: voor Olympus gebruik CellSens, Nikon gebruiken NIS-elementen, Leica gebruik LAS X, Zeiss – ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens software, evenals verschillende plugins beschikbaar via image-J. Voor analyse moet het totale aantal interacties over alle z-stacks worden geanalyseerd met behulp van image-J-software, zodat alleen pdx-1-positieve cellen worden geanalyseerd (paragraaf 3,5).
  5. Kwantificering van PLA-interacties
    1. Open de gratis image-J-softwaretoepassing en open de PLA-afbeelding. Begin met de eerste scherp in-focus PLA-afbeelding.
    2. Klik op het tabblad afbeelding en selecteer aanpassenen vervolgens drempelwaarde (afbeelding 1a). Pas de drempel aan om alle niet-specifieke PLA-signalen te verwijderen, noteer de drempel aanpassing en probeer deze consistent te houden tijdens de analyse.
    3. Klik op het tabblad proces en selecteer binairen vervolgens binair maken (afbeelding 1B). Gebruik de binaire afbeelding om deeltjes te meten door op het tabblad "analyseren" te klikken en op deeltjes analyseren te drukken (figuur 1c).
    4. Voor analyse zorg ervoor dat de instellingen als volgt zijn : grootte = 0 – oneindig, circulariteit = 0 – 1.0, show = contouren, selectievakjes voor weergaveresultatenen duidelijke resultaten (afbeelding 1d). Klik op OK. Noteer het aantal deeltjes dat is geanalyseerd in een werkblad dat het monster aangeeft en de z-stack positie.
    5. Herhaal stap 3.5.2 – 3.5.4 totdat alle in-focus z-stacks voor het voorbeeld zijn geanalyseerd. Som het totale aantal deeltjes voor het monster in het werkblad op om het totale aantal interacties te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We voerden eerste experimenten uit in de MIN6 alvleesklier Beta cellijn en de sh-SY5Y neuroblastoom cellijn sh-SY5Y, om zowel de specificiteit van de antilichamen als de gevisualiseerde eiwit interacties te optimaliseren en te bevestigen. MIN6 cellen werden verguld op de dekstroken bij 30.000 cellen/mL en links om te hechten 48 h, SH-SY5Y cellen werden verguld op de dekstroken op 15.000 cellen/mL en links om te hechten voor 24 h. Het PLA-protocol werd vervolgens gevolgd zoals hierboven, b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudige en efficiënte aanpak om NRDP1 te gebruiken: USP8 PLA in weefsels/cellen die van belang zijn om de vorming van stroomopwaartse mitophagy-complexen te kwantificeren. We hebben eerder de vorming van het CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy-complex in pancreas bètacellen bevestigd door verschillende methodologieën, waaronder Co-Immunoprecipitation-experimenten, cel-vrije interactiestudies, en in vitro evenals cel-gebaseerde alomtegenwoordige assays, en toonde aan hoe dit complexe aandrijvingen gere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen financieringssteun van JDRF (CDA-2016-189 en SRA-2018-539), het Nationaal Instituut voor diabetes en spijsverterings-en nierziekten, National Institutes of Health (R01-DK-108921), de familie Brehm en de familie Anthony. De JDRF Career Development Award aan S.A.S. wordt deels ondersteund door de Deense diabetes Academie, die wordt gesteund door de Novo Nordisk Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Block solutionHomemadeGebruik 1X PBS, voeg 10% donkey serum en 0.3% Triton X-100-detergens toe.
Buffer AHomemadeOm 1L te maken: Meng 8.8g NaCl, 1.2g Tris-base, 500ul Tween-20, met 750mL ddH20. pH tot 7.5 met HCl, en vul tot 1L. Filter de oplossing en bewaar bij 4C. Breng naar RT voor experimenteel gebruik
Buffer BHomemadeOm 1L te maken: Meng 5.84g NaCl, 4.24g Tris-base, 26g Tris-HCl met 500mL ddH20. pH tot 7.5, en vul tot 1L. Filter de oplossing en bewaar bij 4C. Breng naar RT voor experimenteel gebruik
Cy5-geconjugeerd AffiniPure donkey anti-geitJackson Labs705-175-147
Detection Reagents RedSigma- AldrichDU092008-100RXNKit met: ligatie-oplossing stock (5X), ligase, amplificatie-oplossing stock (5X) en polymerase.
DuoLink PLA-sonde anti-muis MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA-sonde anti-konijn PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Foetaal bovien serum
Geit polyklonaal anti-PDX1 (kloon A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MIN6 pancreatische cellijnGift van D. StoffersMuis insulinoomcellijn, gebruikt voor cel-gebaseerde assays.
Muis monoklonaal anti-USP8 antilichaam (kloon US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmGebruik om antilichaam- en sonde-oplossingen op uw cellen te verzegelen om verdamping te voorkomen bij gebruik van kleine oplossingsvolumes.
PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met triton)HomemadeOm 50mL te maken: 43.5mL ddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA (100mg/mL oplossing), 1mL 10% triton X-100 oplossing in ddH20)
Penicilline-Streptomycine (100X)Life Technologies15140-122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Humaan AB-serumProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold antifade reagens met DAPILife Technologies (Molecular Probes)P36935
Konijn polyklonaal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
SH-SY5Y-cellenGift van L. SatinMenselijke neuroblastoomcellijn, gebruikt voor cel-gebaseerde assays.
Natrium Pyruvaat (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Water voor RNA-werk (DEPC-water)Fisher ScientificBP361-1L

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interactie tussen NRDP1 en USP8PDX1 tegenkleuringisolatie van eilandcellencytospin fixatieImageJ partikelanalysekwantificering van mitofagiediabetesonderzoek

Gerelateerde artikelen