Methodenartikel

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

DOI:

10.3791/59398

⸱

2 mei 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitophagy is een essentieel mitochondriale kwaliteitscontrole traject, dat van cruciaal belang is voor beta-cel Bioenergetica van de alvleesklier om glucose-gestimuleerde insuline vrij te maken. De beoordeling van mitophagie is uitdagend en vereist vaak genetische verslaggevers of meerdere complementaire technieken die niet gemakkelijk worden gebruikt in weefselmonsters, zoals primaire menselijke alvleesklier eilandjes. Hier demonstreren we een robuuste aanpak om de vorming van belangrijke endogene mitophagie complexen in primaire menselijke pancreas eilandjes te visualiseren en kwantificeren. Met behulp van de gevoelige nabijheid ligatie assay techniek om interactie van de mitophagy regelgevers NRDP1 en USP8 te detecteren, zijn we in staat om specifiek de vorming van essentiële mitophagy complexen in situ kwantificeren. Door deze benadering van contra kleuring voor de transcriptiefactor PDX1 te koppelen, kunnen we mitophagische complexen kwantificeren, en de factoren die mitophagie kunnen aantasten, met name binnen bètacellen. De methodologie die we beschrijven, overkomt de noodzaak voor grote hoeveelheden cellulaire extracten die nodig zijn voor andere eiwit-eiwit interactiestudies, zoals immunoprecipitatie (IP) of massaspectrometrie, en is ideaal voor kostbare menselijke eilandje monsters die over het algemeen niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar zijn voor deze benaderingen. Verder wordt met deze methodologie de noodzaak van flow Sorteer technieken voor het zuiveren van bètacellen van een heterogene eilandje populatie voor downstream eiwit toepassingen overbodig. Zo beschrijven we een waardevol protocol voor visualisatie van mitophagy dat zeer geschikt is voor gebruik in heterogene en beperkte celpopulaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pancreas bètacellen produceren de insuline die nodig is om normale glucose homeostase te handhaven, en hun falen resulteert in de ontwikkeling van alle vormen van diabetes. Bètacellen behouden een robuuste mitochondriale capaciteit om de energie te genereren die nodig is om het glucose metabolisme te koppel met insulineafgifte. Onlangs, het is duidelijk geworden dat het onderhoud van de functionele mitochondriale massa is van cruciaal belang voor optimale beta-cel functie1,2,3. Om functionele mitochondriale massa te ondersteunen, bètacellen vertrouwen op kwaliteitscontrolemec....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van de geïdentificeerde donor humane pancreas eilandjes is via een vrijstelling van de institutionele Review Board (IRB) en in overeenstemming met het IRB-beleid van de Universiteit van Michigan. Menselijke pancreas eilandjes werden geleverd door het NIH/NIDDK-gesponsord geïntegreerd Islet-distributieprogramma (IIDP).

1. monstervoorbereiding voor menselijke eilandje

  1. Dissociatie van één cel
    1. Cultuur menselijke eilandje monsters (4000 – 6000 eilandje equivalenten/10 ml media) gedurende ten minste 1 dag bij 37 °c in de alvleesklier Islet media (PIM (S)) media aangevuld met 1 mm glutamine (PIM (G....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We voerden eerste experimenten uit in de MIN6 alvleesklier Beta cellijn en de sh-SY5Y neuroblastoom cellijn sh-SY5Y, om zowel de specificiteit van de antilichamen als de gevisualiseerde eiwit interacties te optimaliseren en te bevestigen. MIN6 cellen werden verguld op de dekstroken bij 30.000 cellen/mL en links om te hechten 48 h, SH-SY5Y cellen werden verguld op de dekstroken op 15.000 cellen/mL en links om te hechten voor 24 h. Het PLA-protocol werd vervolgens gevolgd zoals hierboven, b.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudige en efficiënte aanpak om NRDP1 te gebruiken: USP8 PLA in weefsels/cellen die van belang zijn om de vorming van stroomopwaartse mitophagy-complexen te kwantificeren. We hebben eerder de vorming van het CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy-complex in pancreas bètacellen bevestigd door verschillende methodologieën, waaronder Co-Immunoprecipitation-experimenten, cel-vrije interactiestudies, en in vitro evenals cel-gebaseerde alomtegenwoordige assays, en toonde aan hoe dit complexe aandrijvingen gere.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen financieringssteun van JDRF (CDA-2016-189 en SRA-2018-539), het Nationaal Instituut voor diabetes en spijsverterings-en nierziekten, National Institutes of Health (R01-DK-108921), de familie Brehm en de familie Anthony. De JDRF Career Development Award aan S.A.S. wordt deels ondersteund door de Deense diabetes Academie, die wordt gesteund door de Novo Nordisk Foundation.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Block solutionHomemadeGebruik 1X PBS, voeg 10% donkey serum en 0.3% Triton X-100-detergens toe.
Buffer AHomemadeOm 1L te maken: Meng 8.8g NaCl, 1.2g Tris-base, 500ul Tween-20, met 750mL ddH20. pH tot 7.5 met HCl, en vul tot 1L. Filter de oplossing en bewaar bij 4C. Breng naar RT voor experimenteel gebruik
Buffer BHomemadeOm 1L te maken: Meng 5.84g NaCl, 4.24g Tris-base, 26g Tris-HCl met 500mL ddH20. pH tot 7.5, en vul tot 1L. Filter de oplossing en bewaar bij 4C. Breng naar RT voor experimenteel gebruik
Cy5-geconjugeerd AffiniPure donkey anti-geitJackson Labs705-175-147
Detection Reagents RedSigma- AldrichDU092008-100RXNKit met: ligatie-oplossing stock (5X), ligase, amplificatie-oplossing stock (5X) en polymerase.
DuoLink PLA-sonde anti-muis MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA-sonde anti-konijn PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Foetaal bovien serum
Geit polyklonaal anti-PDX1 (kloon A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MIN6 pancreatische cellijnGift van D. StoffersMuis insulinoomcellijn, gebruikt voor cel-gebaseerde assays.
Muis monoklonaal anti-USP8 antilichaam (kloon US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmGebruik om antilichaam- en sonde-oplossingen op uw cellen te verzegelen om verdamping te voorkomen bij gebruik van kleine oplossingsvolumes.
PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met triton)HomemadeOm 50mL te maken: 43.5mL ddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA (100mg/mL oplossing), 1mL 10% triton X-100 oplossing in ddH20)
Penicilline-Streptomycine (100X)Life Technologies15140-122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Humaan AB-serumProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold antifade reagens met DAPILife Technologies (Molecular Probes)P36935
Konijn polyklonaal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
SH-SY5Y-cellenGift van L. SatinMenselijke neuroblastoomcellijn, gebruikt voor cel-gebaseerde assays.
Natrium Pyruvaat (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Water voor RNA-werk (DEPC-water)Fisher ScientificBP361-1L

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mi....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interactie tussen NRDP1 en USP8PDX1 tegenkleuringisolatie van eilandcellencytospin fixatieImageJ partikelanalysekwantificering van mitofagiediabetesonderzoek

Gerelateerde artikelen