Methodenartikel

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

DOI:

10.3791/59433

⸱

23 mei 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afwijkende aggregatie van het eiwit tau is pathogeen betrokken bij een aantal neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD). Hoewel de Muismodellen van tauopathy hebben een waardevolle bron voor het onderzoek van de neurotoxiciteit mechanismen van geaggregeerde tau, is het steeds duidelijker dat, als gevolg van interspecies verschillen in fysiologie, de muis hersenen is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke conditie. Vooruitgang in de cel cultuur methoden hebben gemaakt menselijke neuronale culturen toegankelijk voor experimenteel gebruik in vitro en hebben geholpen bij de ontwikkeling van neurotherapeutics. Echter, ondanks de aanpassing van de menselijke neuronale cel culturen, in vitro modellen van de menselijke tauopathy zijn nog niet op grote schaal beschikbaar. Dit protocol beschrijft een cellulair model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen zijn transduced met lentiviral-afgeleide vectoren die code voor pathogene gemuteerde tau gesmolten tot een gele fluorescerende eiwit (YFP) verslaggever. Transduced culturen produceren tau aggregaten die positief vlek voor thioflavin en display markers van neurotoxiciteit, zoals verminderde axonale lengte en verhoogde lysosomale volume. Deze procedure kan een nuttig en kostenbesparend model zijn voor het bestuderen van menselijke therapeutische.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pathologische aggregatie van de microtubule-geassocieerde proteïne Tau is een bepalend kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD, Frontotemporale dementie (FTD), de ziekte van pick, en Progressieve supranucleaire parese (PSP)1. In een niet-zieke staat, tau bindt aan en stabiliseert microtubule filamenten in neuronale axonen2. Echter, ziekte-geassocieerde hyperphosphorylation van Tau bevordert tau aggregatie, dissociatie van microtubuli, en neuronale toxiciteit3. De toxische effecten van geaggregeerde tau kan leiden tot afwijkende activering van cholinerge4 en glutamaterge receptoren5 resulteert in de ontregeling van intracellulaire calcium en, uiteindelijk, celdood. In diermodellen, de vermindering van de hersenen tau verbetert de pathologie in AD muizen6 en in muismodellen van repetitieve mild traumatisch hersenletsel7.

Montage bewijs toont aan dat de structuur en bindende affiniteit van muis-afgeleide tau zijn verschillend van de mens afgeleide tau en dat de muis Tau is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke therapeutische8. Echter, menselijke cel tauopathy modellen zijn niet op grote schaal commercieel beschikbaar. Het algemene doel van dit werk is het beschrijven van een in vitro model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen worden transduced met lentiviral-afgeleide vectoren met Mutant menselijke tau constructen9. Tau aggregaat waardoor lentiviral constructen codeert voor de tau te herhalen domein harboring P301L en V337M mutaties gesmolten tot een YFP Reporter (tau-RDLM-YFP), terwijl de controle construeert code voor de wild-type (WT) tau herhalen domein gesmolten tot een YFP Reporter (tau-WT-YFP). Neuronale culturen transduced met behulp van deze methode Express ongeveer negen keer meer tau dan nontransduced culturen. Hoewel het bedrag van de tau-expressie overexpresse is ruwweg gelijk tussen tau-RDLM-YFP-en tau-WT-YFP-transduced cellen, alleen neuronen transduced met tau-RDLM-YFP display aggregaten. Culturen transduced met tau-RDLM-YFP vlek positief voor thioflavin en display reducties in axonale lengte en synaptische dichtheid. Daarom is dit cellulaire model kan een nuttig instrument voor het bestuderen van Tau aggregatie in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van media en reagentia

  1. Ontdooi de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op 4 ° c (niet toestaan dat de kelder membraan matrix op te warmen of het zal stollen). Maak 1 mL hoeveelheid en bewaar ze bij-20 °C of-70 °C.
  2. Reconstrueren fundamentele fibroblastgroei factor (bFGF) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op 10 µ g/mL en maak 10 µ L-hoeveelheid. Bewaar ze bij 4 °C.
  3. Om een nieuwe, ongeopende, 500 mL fles DMEM/F12 met glutamine, voeg B27 (10 mL), N2 (5 mL), en penicilline-streptomycine (5 mL). Plaats 50 mL van deze neurale stamcel (NSC) media in een conische buis en voeg 10 µ L van 10 µ g/µ L (2 µ g/mL Final) bFGF. Bewaar de NSC (+) bFGF media bij 4 °C.
  4. Om (-) bFGF media te maken, gebruik hetzelfde recept als beschreven in stap 1,3 maar Voeg geen bFGF toe. Deze media zullen worden gebruikt om NSCs te differentiëren tot neuronen en om neuronale culturen te handhaven na differentiatie.

2. Lentiviral constructen

Opmerking: Voor het begin van het werk met lentiviral constructen, ervoor te zorgen dat het lab is goedgekeurd om bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) agenten te gebruiken. Bovendien, BSL-2 cultuur kappen, persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE), en verwijdering methoden moeten worden gebruikt bij het werken met lentiviral vectoren.

  1. Verkrijg tau constructies verpakt in lentivirus van een voorkeurs bron (Zie Sanders et al.10 voor construct informatie).

3. kweken menselijke neurale stamcellen

Opmerking: NSCs worden meestal gezaaid op 100000-150000 cellen/cm2 en de meeste commercieel beschikbare NSCs worden verkocht als 1 x 106 cellen/flacon. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 10 cm cel cultuur gerechten (hoewel andere maten van de gerechten kunnen worden gebruikt); Daarom, indien commercieel beschikbare NSCs worden gebruikt, de NSCs kan nodig zijn om te worden uitgebreid door eerst wordt gekweekt in zes-well gerechten om te resulteren in voldoende cellen om zaad 10 cm gerechten. Dit protocol kan ook worden aangepast voor een verscheidenheid van de cel cultuur schotel maten (maar het bevat geen instructies voor passaging NSCs als deze protocollen beschikbaar zijn elders11,12).

  1. Voor de bereiding van de cellen van de cultuur van de cel, Verwijder één hoeveelheid bevroren kelder membraan matrijs deklaag voor de platen van de cel cultuur en laat het aan dooi bij 4 °C (de fracties kunnen bij 4 °C 's nachts worden geplaatst de dag alvorens de cellen moeten worden gezaaid). Voeg 385 µ L van kelder membraan matrix coating tot 5 mL van DMEM/F12 media + penicilline-streptomycine.
    Opmerking:     5 ml van DMEM/F12 media + penicilline-streptomycine is genoeg om een jas een enkele 10 cm schotel (1 ml van deze kelder membraan matrix coating oplossing is voldoende om een jas goed van een zes-well schotel). Als alternatief, als de cellen worden vastgesteld en immunostained, of gekleurd voor thioflavin, cultuur cellen op glas-dekglaasjes in 24-Well cultuur gerechten.
    1. Houd de media en de matrix coating koud voor en terwijl ze toe te voegen aan cultuur gerechten. Voeg de kelder membraan matrix coating aan cultuur gerechten en plaats de gerechten in een incubator (bij 37 ° c) voor 1 uur. Voor een optimale coating, niet incuberen de kelder membraan matrix voor meer dan of minder dan 1 uur. Na 1 uur, aspireren de kelder membraan matrix coating van de cel culturen gerechten. Zorg ervoor dat dit samenvalt met de NSCs klaar om te worden geplateerd.
      Opmerking: Als de cellen niet worden ontdooid van bevroren voorraden, Skip stap 3,2 en ga verder met stap 3,3.
  2. Als cellen worden ontdooid uit bevroren NSC voorraden, neem een flacon van bevroren cellen en verwarm het in een waterbad verwarmd tot 37 ° c door het bewegen van de flacon heen en weer in het water. Eenmaal ontdooid, spuit de flacon met 70% ethanol en plaats deze in een cel cultuur kap. Breng de cellen naar ~ 10 mL van DMEM/F12 + penicilline-streptomycine media en centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1.000 x g voor 5 min. aspireren de media en de cellen opnieuw op te schorten in NSC media.
  3. Verdun de cellen in de NSC media om de juiste zaai dichtheid voor de cel cultuur vaartuig dat wordt gebruikt te verkrijgen.
    Opmerking: Bijvoorbeeld, als NSCs worden geplateerd op een zes-well plaat-een goed op een zes-well cultuur schotel heeft een oppervlakte van 9 cm2-900.000 tot 1.350.000 cellen nodig zijn om zaad. Dus, een flacon met 1.000.000 cellen kunnen worden opgehangen in 2 mL van de media en toegevoegd aan een enkele put van een zes-well schotel.
  4. Voeg genoeg cellen geschorst in NSC media om het zaad van de kelder membraan matrix-gecoate cultuur gerechten (100.000 cellen/cm2) en verander de media om de andere dag (bij gebruik van een bevroren voorraad, verander de media de dag na plating en elke andere dag daarna). Kweek de cellen tot ze 75%-80% Confluent.
    Opmerking: De cellen zullen waarschijnlijk bereiken 75%-80% samenloop kort na plating, maar dit kan langer duren als bevroren voorraden worden gebruikt.
  5. Zodra de NSCs zijn 75%-80% Confluent, beginnen neuronale differentiatie door het verwijderen van de NSC (+) bFGF media en te vervangen door NSC (-) bFGF media. Kweek de cellen in deze media (ter vervanging van de media om de andere dag) gedurende ten minste 4 weken.
    Opmerking: De cellen zullen blijven verdelen voor een paar dagen na de intrekking van bFGF; Daarom kunnen cellen bereiken 90 tot 100% samenloop. Na kweken voor 4 weken, zullen de cellen hebben bereikt een neuronale lot en zal klaar zijn voor de behandeling van lentivirus.

4. transductie en onderhoud van neuronale culturen

  1. Om trans Duce neuronen met lentivirus, gebruik een titer graaf van 3,4 x 105 transducible eenheden/cel (een 100% Confluent 10 cm schotel zal bevatten ~ 10.000.000 neuronen). Verdun de transducible eenheden om de nodige concentratie in de cel cultuurmedia en voeg ze toe aan de cellen (gebruik het normale volume van de media voor de cel cultuur schotel). Twee dagen na het toevoegen van de lentivirus, was de cellen 1x met verse (-) bFGF media (zonder lentivirus) en verder kweken in (-) bFGF media zoals gewoonlijk.
  2. Voor de post-lentiviral behandeling, voer de transduced neuronen door het veranderen van de cel cultuurmedia ([-] bFGF media) om de andere dag. Handhaaf de cellen voor ~ 8 weken na transductie. Visualiseer routinematig de cellen onder een lichte Microscoop om levensvatbaarheid te verzekeren.
    Opmerking: Schaarste of dendritische breuken zijn tekenen dat de cellen niet meer levensvatbaar zijn.

5. beeldvorming van cellen

  1. Live-cel beeldvorming
    1. Na de transductie (4 dagen na de toevoeging van lentivirus), observeren YFP signalen onder een fluorescerende Microscoop in staat van Live-cel beeldvorming. Neem de cel cultuur gerechten uit de incubator en zorg ervoor dat de cultuur putten steriel blijven door het deksel te houden op de top van de cultuur gerechten. Visualiseer de cellen met behulp van een 10x doelstelling met een excitatie golflengte van ~ 514 nm en een emissie filter van ~ 527 nm.
      Opmerking: Aggregaten zijn meestal zichtbaar in transduced Cell cultures 6 – 8 dagen na de toepassing van lentivirus.
  2. Vaste-cel kleuring (β-tubulin III etikettering en thioflavin kleuring)
    1. Om de cellen in Paraformaldehyde (middel) te bevestigen, verwijder de cultuurmedia van transduced neuronen die op glas-dekglaasjes worden gekweekt. Was de cellen 1x met PBS, verwijder het wassen, en voeg 300-500 µ L (bij gebruik van 24-Well platen) van 4% (verdund in PBS) op de-dekglaasjes voor 20 min bij kamertemperatuur. Verwijder de-dekglaasjes en was de 2x met PBS.
    2. Bereid een blokkerende oplossing, bestaande uit PBS, 3% boviene serum albumine (BSA), en 0,3% Triton X-100. Voeg 300 – 500 µ L van de oplossing aan de putten toe en broed de-dekglaasjes voor 2 h bij 4 °C uit. Na 2 h, Verdun primaire antilichamen (bij een antilichamen concentratie van 1:500) in het blokkeren van oplossing en voeg 300 – 500 µ L van primaire antistof oplossing aan elk goed toe. Plaats de plaat op een schommelend of roterend platform (bij lage snelheid) overnachting bij 4 °C.
    3. De volgende dag, verwijder de primaire antilichaam oplossing en was de-dekglaasjes 3x voor 5 min elk met PBS. Verdun secundaire antilichamen in een blokkerende bufferoplossing (bij een concentratie van 1:1000) en voeg secundaire antilichamen oplossing aan elk goed toe. Selecteer het juiste secundaire antilichaam door een fluorescerende tag te gebruiken die niet overlapt met het YFP-signaal (bijvoorbeeld CY-3). Incubeer de cellen bij kamertemperatuur voor 2 uur op een schommelend of roterend platform. Na 2 h, verwijder de secundaire antilichaam oplossing en was de-dekglaasjes 3x voor 10 min elk met PBS.
    4. Was de-dekglaasjes in dubbel-deioniseerde water (DDW) voor 10 min. Verwijder de DDW en voeg 300 µ L/put van 0,015% thioflavin-S verdund in 50% ethanol voor 10 min. Verwijder de thioflavin oplossing en was de-dekglaasjes 2x voor 4 min elk met 50% ethanol, gevolgd door een 4 min wassen met 30% ethanol en twee wasbeurten voor 5 min elk met 30% ethanol. Was de-dekglaasjes 1x met DDW voorafgaand aan de montage.
      Opmerking: De thioflavin kleuring beschreven in stap 5.2.4 is optioneel.
    5. Om de-dekglaasjes te monteren op glas dia's, plaats een enkele druppel van de montage van media op de "+" kant van een glazen glijbaan. Verwijder alle vloeistof uit de put met de glazen dekglaasje en, met behulp van fijne Tang, zorgvuldig verwijderen van de glazen dekglaasje, het bijhouden van welke kant heeft de gekweekte cellen.
    6. Druk zachtjes op de rand van de dekglaasje tegen een Kimwipe om overtollig vocht te verwijderen. Nog steeds aangrijpend de dekglaasje met fijne Tang, raak de rand (met de cel zijde naar de daling van de montage van de media) van de dekglaasje aan de montage media, en vervolgens voorzichtig plaats de dekglaasje op de montage media (het plaatsen van de gekweekte cellen in de montage media en beboteren ze tussen de dekglaasje en de glazen glijbaan). Laat de bevestigings media gedurende 30 minuten uitharden voorafgaand aan de beeldvorming. De dia's kunnen worden opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik.
    7. Afbeelding van de cellen met behulp van een fluorescerende Microscoop en de juiste excitatie/emissie spectra (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, en thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. facultatieve methodes

  1. Om de 2 dagen, verzamel geconditioneerde media van de culturen en bewaar het bij-20 °C voor toekomstige analyses van Tau soorten die door culturen worden vrijgegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau-RDLM-YFP-transduced neuronen werden fluorescerend gelabeld met YFP, en RDLM-transduced culturen weergegeven aggregaten na transductie. Deze inclusies gekleurd positief voor thioflavin (Figuur 1). Zoals Figuur 1 aantoont, produceert dit protocol neuronale culturen die thioflavin-positieve tau aggregaten weergeven. Voor de eerste experimenten, is het aanbevolen dat neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling de neuron-specifieke marker β-tubul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de generatie van een in vitro model van de menselijke tauopathy dat vertoont zilver-vlek-positieve aggregaten en thioflavin-positieve neurofibrillaire klitten (NFTs). Bovendien, transduced cellen weer te geven tau-geïnduceerde pathologieën zoals morfologische gebreken, verminderde synaptogenese, en een verhoogd lysosomale volume. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een toegankelijke en kosteneffectieve model van neuronale tauopathy, die kan worden gebruikt voor drug screening st...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen bedanken Dr. Peter Davies bij Albert Einstein College of Medicine voor het leveren van PHF-1 en CP13 antilichamen en Dr Marc Diamond aan de Universiteit van Texas, het zuidwesten, voor het verstrekken van de tau constructen. Dit werk werd gesteund door toelagen van de vereniging van Alzheimer (NIRG-14-322164) aan S.H.Y. en van het Instituut van Californië voor regeneratieve geneeskunde (TB1-01193) aan P.R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm kweekschalenThermofisher12556002
15 mL buizenBiopioneerCNT-15
16% paraformaldehydeThermofisher50-980-487
24 wel kweekplatenThermofisher930186
50 mL buizenBiopioneerCNT-50
70% ethanol in spuitflesDiverse bronnenNA
B27 supplementThermofisher17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)Corning356231
Basic FGFBiopioneerHRP-0011
Bovine serum albumineSigmaA7906
Celkweek incubatorDiverse bronnenNA
CentrifugeDiverse bronnenNA
DMEM-F12 kweekmedium met glutamineThermofisher10565042
Ethanol (50% concentratie of hoger)Diverse bronnenNA
Fluorescent gelabelde secundaire antilichamenDiverse bronnen, afhankelijk van het experimentNA
Fluorescente microscoopDiverse bronnenNA
Glazen dekglasjesThermofisher1254581
Glazen objectglaasjesThermofisher12-550-15
Menselijke neurale stamcellenDiverse bronnenNA
Lentivirale vectorenDiverse bronnenop bestelling
Montage mediumThermofisherP36934
N2 supplementThermofisher17502048
Penicilline-StreptomycineThermofisher15140122
Fosfaat gebufferde zoutoplossingThermofisher14190250
Primaire antilichamenDiverse bronnen, afhankelijk van het experimentNA
Schud- of draaitafelDiverse bronnenNA
Steriele celkweek kapDiverse bronnenNA
Thioflavine SSigmaT1892-25G
Triton X-100ThermofisherBP151-100
WaterbadDiverse bronnenNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
  2. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  3. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
  4. Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
  5. Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
  6. DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
  7. Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).
  8. Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
  9. Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
  10. Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
  11. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).
  12. Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).
  13. Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).
  14. Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lentivirale transductiefluorescentiemicroscopiethioflavine kleuringaxonale degeneratielysosomaal volumeb ta tubuline IIIneuronale differentiatiecelkweekmedia

Gerelateerde artikelen