Het gebruik van Deuteriumoxide als niet-invasief, niet-dodelijk hulpmiddel voor de beoordeling van lichaamssamenstelling en waterverbruik bij zoogdieren

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de deuteriumoxide verdunningstechniek bij twee zoogdieren, een insectivore en carnivoor, om het totale lichaamswater, de spiermassa, de massa van lichaamsvet en het waterverbruik te bepalen.

Samenvatting

Body condition scoring systemen en body condition indexen zijn veel voorkomende technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van de gezondheidstoestand of fitness van een soort. Body condition scoring systemen zijn evaluator afhankelijk en hebben het potentieel om zeer subjectief. Body condition indices kunnen worden verward door foerageren, de effecten van lichaamsgewicht, evenals statistische en inferential problemen. Een alternatief voor lichaamsconditie scoringsystemen en lichaamsconditieindexen is het gebruik van een stabiele isotoop zoals deuteriumoxide om de lichaamssamenstelling te bepalen. De deuteriumoxideverdunningsmethode is een herhaalbare, kwantitatieve techniek die wordt gebruikt om de lichaamssamenstelling bij mensen, dieren in het wild en in het wild te schatten. Bovendien kan de deuteriumoxideverdunningstechniek worden gebruikt om het waterverbruik van een individueel dier te bepalen. Hier beschrijven we de aanpassing van de deuteriumoxide verdunningstechniek voor het beoordelen van de lichaamssamenstelling bij grote bruine vleermuizen(Eptesicus fuscus)en voor het beoordelen van het waterverbruik bij katten(Felis catis).

Inleiding

Body condition scoring systemen en body condition indexen zijn veel voorkomende technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van de gezondheidstoestand of geschiktheid van een soort^1,2. Veel binnenlandse en zoölogische soorten hebben unieke body condition scoring (BCS) systemen die worden gebruikt om de spier van een dier en oppervlakkig vetweefsel te beoordelen³. BCS-beoordeling is echter afhankelijk van de evaluator, wat betekent dat BCS een objectieve of semikwantitatieve meting is wanneer deze wordt beoordeeld door een getrainde beoordelaar. Bij wilde diersoorten worden lichaamsconditieindexen vaak gebruikt in plaats van BCS en zijn gebaseerd op een verhouding van lichaamsmassa tot lichaamsgrootte of lichaamsmassa tot onderarm². Lichaamsconditie indicis zijn vaak verward door de effecten van foerageren en kan worden verward door de lichaamsgrootte, alsmede statistische en inferentieve problemen⁴.

Een alternatief voor lichaamsconditie scoringsystemen en lichaamsconditieindexen is het gebruik van een stabiele isotoop om de lichaamssamenstelling te bepalen. Een veelgebruikte stabiele isotoop is deuteriumoxide (D₂O), een niet-radioactieve vorm van water waarin de waterstofatomen deuteriumisotopen zijn. De deuteriumoxideverdunningsmethode die in deze studie wordt beschreven, kan een niet-subjectieve, kwantitatieve en herhaalbare techniek zijn die wordt gebruikt om de lichaamssamenstelling bij mensen te schatten⁵ en een breed scala aan soorten^4,6,7. Deze techniek kan voordelig zijn voor het bestuderen van de lichaamssamenstelling in het wild. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om longitudinale veranderingen in lichaamssamenstelling te beoordelen, zoals voor en na een beheersactie. Bij sommige wilde diersoorten kan deuteriumoxide echter het werkelijke watergehalte overschatten⁸. Daarom is het bij de aanpassing van de techniek voor een soort belangrijk om de methode te valideren door de deuteriumoxidemethode te vergelijken met karkasanalyse voor niet-bedreigde soorten. Voor bedreigde en bedreigde soorten moet een niet-destructieve methode, zoals dubbele röntgenonthouding (DXA), worden beschouwd als een alternatieve vergelijkingsmethode voor de goudstandaarddestructieve methode voor volledige karkasanalyse.

Naast de lichaamssamenstelling kan de D₂O verdunningstechniek worden gebruikt om het waterverbruik van een individueel dier te bepalen⁹. Deze unieke toepassing van D₂O kan worden gebruikt om niet alleen onderzoeksvragen te beantwoorden, maar kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van het waterverbruik van individuele dieren(en) die in grote sociale omgevingen zijn gehuisvest.

Hier beschrijven we de aanpassing van de D₂O verdunningstechniek voor het beoordelen van lichaamssamenstelling in een insectivore, grote bruine vleermuizen(Eptesicus fuscus), en voor het beoordelen van het waterverbruik bij een carnivoor, katten (Felis catis).

Protocol

Alle experimenten hier beschreven werden goedgekeurd door de Universiteit van Missouri Animal Care and Use Committee en uitgevoerd onder de Missouri Department of Conservation (MDC) Wildlife Scientific Collection vergunning (Vergunning #16409 en #17649).

1. Bereiding van steriele, isotone, verzilte D₂O-voorraadoplossing

1. Maak een 50 mL voorraad oplossing van 9,0 g/L salinated D₂O.
   1. Weeg 450 mg nacl van farmaceutische kwaliteit en breng alle NaCl over in een 100 mL, gesteriliseerd bekerglas. Noteer de exacte hoeveelheid NaCl tot 4 decimalen in het laboratoriumnotitieblok.
   2. Meet met behulp van een steriele gegradueerde cilinder 50 g ≥ 99,8% deuteriumoxide en breng over naar het steriele bekerglas met de NaCl. Noteer de exacte hoeveelheid deuteriumoxide tot 4 decimalen in het laboratoriumnotebook of spreadsheet.
   3. Filter 10 mL isosmotische sterkte NaCl (9,0 g/L) door een niet-pyrogene steriele schijffilter met submicron poriën (0,2 μm).
   4. Bevestig een naald van 20 G aan het niet-pyrogene steriele schijffilter met submicron poriën (0,2 μm) voorzien van een spuitvat van 10 mL. Voeg in het septum van een steriele lege flacon van 100 mL.
   5. Bevestig een vacuümbuis aan een naald van 22 G en steek de naald in het septum van de 100 mL steriele lege flacon.
   6. Giet 10 mL van de voorraadoplossing in het spuitvat. Zet het vacuüm langzaam aan totdat de D₂O-voorraadoplossing langzaam in de steriele flacon begint te filteren. Blijf de D₂O-voorraadoplossing in het spuitvat gieten totdat alle 50 mL is gefilterd.
      OPMERKING: De voorraadoplossing moet mogelijk worden verdund of geconcentreerd, afhankelijk van de vereiste dosis. De dosis D₂O zal variëren op basis van de soort en de gevoeligheid van de analysemethode. Voor katten werd de werkoplossing gebruikt om een dosis van 0,7 g/kg D₂O toe te dienen. De hierboven beschreven voorraadoplossing minimaliseert de hoeveelheid NaCl-oplossing die onderhuids aan het dier wordt geïntroduceerd en tegelijkertijd een nauwkeurige meting van de dosis mogelijk maakt. Voor kleine zoogdieren zoals vleermuizen moet deze concentratie worden verdund tot een werkoplossing zoals 0,1600 g/mL. Met deze concentratie kan de dosis van 0,75 g/kg D₂O nauwkeurig worden gemeten en toegediend in ongeveer 100 μL of minder NaCl-oplossing.

2. Bereiding van steriele, isotone, verzilte D₂O-voorraadwerkoplossing voor vleermuizen

1. Weeg een 10 mL lege steriele flacon en neem gewicht op tot de dichtstbijzijnde 4 decimalen. Tare schaal.
2. Gebruik een 1,0 mL spuit om 0,65 mL van de D₂O voorraad oplossing over te brengen naar de geteerd, 10 mL lege steriele flacon. Record gewicht van D₂O tot 4 decimalen. Tare schaal.
3. Bereken het volume van D₂O in de 10 mL lege flacon. Gebruik de volgende vergelijking.
   
   waarbij W is geregistreerd gewicht en D is de dichtheid van 99,8% D₂O (1.107 g/mL).
4. Gebruik het berekende volume en het bekende gewicht van de D₂O om het volume van isotone zoutoplossing te bepalen die nodig is om ~ 0,1600 g/mL-werkoplossing te maken.
5. Steek in het septum van de 10 mL steriele flacon, de 22 G naald (bevestigd aan de vacuümbuis). Steek in het septum van de 10 mL steriele flacon, de 20 G naald (bevestigd aan een 0,22 μm spuitfilter uitgerust met een spuitvat van 10 mL).
6. Giet de berekende massa/volume van isotone NaCl in het spuitvat en zet het vacuüm aan om een langzame druppel in de steriele flacon van 10 mL mogelijk te maken.
7. Noteer het gewicht van de flacon en zorg ervoor dat er een ~0,1600 g/mL-werkoplossing wordt gecreëerd.

3. Bepaling van de lichaamssamenstelling van grote bruine vleermuizen(Eptesicus fucsus)met D₂O

LET OP: De voorraadoplossing van D₂O die in het protocol wordt gebruikt, is 0,1598 g/mL. Zorg er voor het verzamelen van bloed ervoor dat het verwijderen van maximaal 200 μL bloed ≤ 10% van het totale bloedvolume van de vleermuis bedraagt en binnen de vastgestelde richtlijnen van het Comité voor de institutionele dierenverzorging en het gebruik (IACUC) is vastgesteld. Alle dieren moeten worden vasten of buik palpated om een lege maag te garanderen. Een recente maaltijd kan het gewicht van het dier veranderen, wat resulteert in verwarde resultaten, omdat berekeningen voor het bepalen van lichaamsvet afhankelijk zijn van de lichaamsmassa van het dier.

1. Verdoven een grote bruine vleermuis.
   1. Gebruik 5,0% isoflurane voor inductie. Handhaaf een stabiel anesthesievlak met 0,5%−3,0% isoflurane.
   2. Bepaal de juiste anesthesiediepte door de pedaalontwenningsreflex te testen (knijpen de tenen van de vleermuis). De vleermuis mag niet reageren op het gevoel en de ademhalingsfrequentie moet traag en stabiel blijven. Pas isoflurane aan als dat nodig is om een stabiel anesthesievlak te behouden.
   3. Record isoflurane niveau, hartslag, ademhalingsfrequentie, en andere informatie zoals vereist door IACUC.
2. Weeg de grote bruine vleermuis en neem het gewicht op tot 4 decimalen.
3. Reinig het uropatagium (staartmembraan) over de interfemorale ader met een alcoholpreppad en laat drogen. Breng een dunne laag vaseline over de interfemur ader.
4. Gebruik een 29 G naald om het rugdeel van de interfeorale ader door te boren en verzamel 100 μL bloed met behulp van plastic natriumheparine capillaire buizen. Zorg voor een adequate vermenging van het hele bloed met de natriumheparine door elke buis na het verzamelen voorzichtig te rollen en de buis te etiketteren.
5. Met behulp van een DXA machine gekalibreerd voor kleine zoogdieren, het verkrijgen van drie DXA scans van de vleermuis¹⁰.
6. Bepaal de massa (g) van D₂O om te injecteren door het vleermuisgewicht in kg te vermenigvuldigen met de D₂O-dosis van 0,75 g/kg. Bepaal het volume van de berekende D₂O dosis (V) door het gewicht van de D₂O-dosis te delen door de concentratie van de werkoplossing.
   
   
7. Gebruik een insulinespuit met een 29 G naald bevestigd om het volume van D₂O berekend op te stellen. Weeg de D₂O, insulinespuit en naald. Record tot 4 decimalen.
8. Injecteer de D₂O onderhuids over het rugheupgebied van de verdoofde vleermuis.
9. Laat vleermuis te herstellen van anesthesie en het tijdstip van injectie registreren.
10. Weeg onmiddellijk na de injectie de nu lege insulinespuit met de 29 G naald eraan. Neem het gewicht op tot 4 decimalen.
11. Bepaal de dosis D₂O geïnjecteerd door het gewicht na de injectie van de insulinespuit af te trekken van de voorinjectie D₂O gevulde insulinespuit. Record tot 4 decimalen.
12. Gebruik binnen 30 min na de bloedafname een hematocrietcentrifuge om elke capillaire buis gedurende 5 min te draaien. Als de hematocrietcentrifuge meerdere snelheden toelaat, ingesteld op 10.000 x g.
13. Gebruik een scherpe schaar om de plastic capillaire buis tussen het hele bloed en plasma te snijden. Gebruik een pipet van 200 μL om het plasma rechtstreeks in een gelabelde 500 μL-opslagbuis te verdrijven.
14. Verzamel na de evenwichtsperiode nog eens 100 μL bloed uit de interfemorale ader.
    OPMERKING: De evenwichtsperiode zal per soort verschillen en als de vleermuizen in torpor gaan. Voor grote bruine vleermuizen, meestal 2 uur is voldoende voor de equilibratie periode.
15. Scheid plasma in een tweede geëtiketteerde, 500 μL microcentrifuge schroefbovenbuis door stap 3.13 te herhalen. Bewaar monsters bij -20 °C of kouder tot de analyse.

4. Fourier-transformatie infraroodspectrofotometrie analyse

1. Stel de temperatuur van een zandbad in op 60 °C om de distillatie te vergemakkelijken (laat de scheiding van water en D₂O van andere bloedbestanddelen mogelijk maken).
2. Pipetteer 50 μL van elk plasmamonster en standaard aan de binnenkant van een 1,5 mL conische microcentrifuge buisdop. Inclusief normen die bekende concentraties van D₂O als kwaliteitscontrole bevatten.
   OPMERKING: Idealiter elk dier zal drie replica's per monster en het gemiddelde van de drie replica's gemeld. Vanwege het beperkte monstervolume en het volume van het monster dat nodig is voor de FT-IR-apparatuur die door de auteurs werd gebruikt, werden er geen replica's uitgevoerd voor de vleermuismonsters. Als een monster minder dan 50 μL plasma bevat, moet u de monsterhoeveelheid op de conische microcentrifugebuisdop laten lopen en het volume registreren.
3. Houd de microcentrifugedop ondersteboven en schroef de 1,5 mL conische microcentrifugebuis op de dop. Plaats de omgekeerde (ondersteboven) buis met de dop in contact met het zand in het zandbad voor een minimum van 12 uur ('s nachts).
4. Verwijder na 12 uur de dop en vervang door een nieuwe, schone dop. Pulseer de microcentrifugebuis gedurende 10 s in een centrifuge.
5. Maak de volgende normen: 0 ppm (0 mg D₂O in 1 L gedestilleerd water), 293 ppm (293 mg D₂O in 1 L gedestilleerd water), 585 ppm (585 mg D₂O in 1 L gedestilleerd water), 878 ppm (878 mg D₂O in 1 L gedestilleerd water) en 1170 ppm D₂O (1170 mg D₂O in 1 L gedistilleerd water).
   OPMERKING: De bovenstaande waarden worden voorgesteld voor een standaardcurve. Alternatieve waarden zoals 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, enzovoort kunnen worden gebruikt.
6. Installeer een vloeibare transmissiecel in de Fourier-transform infraroodspectrofotometrie (FTIR) spectrometer(Table of Materials). Vul de cel met methanol en sluit de injectiepoort aan. Vul de cel langzaam met achtergrondwater terwijl u de methanolspuit zorgvuldig verwijdert om het risico op luchtbellen te verminderen. Bevestig buizen aan de uitgangspoort om verwijdering van de monsters na de analyse mogelijk te maken.
7. Bereid de FTIR spectrometer software(Tabel van materialen) voor analyse van D₂O in water. De parameterinstellingen voor de spectrometersoftware die in dit protocol wordt gebruikt, worden vermeld in tabel 1.
8. Verzamel een achtergrondmonster met behulp van het verdunningsmiddel, 0,22 μm gefilterd, gedestilleerd water. Dit moet hetzelfde water gebruikt voor de normen.
9. Injecteer 40 μL van de 0 ppm D₂O en neem de spectra op. Sla de spectra op als een CSV-bestand (komma gescheiden waarden).
10. Blijf de spectra van alle standaarden injecteren en opslaan om een standaardcurve te creëren.
11. Herhaal de achtergrond en standaard curve om de 60−90 min.
12. Injecteer 40 μL van elk gedestilleerd monster in de vloeibare transmissiecel en sla de spectra op.
    OPMERKING: Wijzig het injectievolume van de normen en gedistilleerde monsters op basis van het volume van de vloeistoftransmissiecel. Gebruik een vloeistoftransmissiecel met een kleiner volume als het monstervolume lager is dan 40 μL of verdun 1:1 met op de achtergrond gedestilleerd water.
13. Bepaal de concentratie van D₂O van elk monster van de FTIR-spectra met behulp van een spreadsheetprogramma zoals beschreven door Jennings et al.¹¹ of de spectrale software. Wanneer replica's worden uitgevoerd, gebruikt u de gemiddelde concentratie om de lichaamssamenstelling te berekenen.

5. Berekening van de lichaamssamenstelling

1. Zet de deuteriumverrijking (ppm) om in atomprocentconcentratie voor elk monster met behulp van de volgende vergelijking¹²:
   
   waarbij x de gemeten deuteriumverrijking (ppm) van het monster is en 0,0001557 de molfractie is van deuterium gerapporteerd in Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)¹³.
2. Bereken het totale lichaamswater voor elk monster met behulp van de volgende vergelijking^4,12,14:
   )
   waar E de gemeten verrijking (atoom%) is van deuterium in het monster na achtergrondcorrectie, B is de injectiemassa in g, en 0,998 is de concentratie van geïnjecteerde D₂O.
   OPMERKING: Deuterium uitwisseling met labile waterstof veroorzaakt een 2% overschatting van de totale lichaamswatermassa. Totaal lichaamswater moet worden gecorrigeerd door het verminderen van de totale lichaamswatermassa schatting met 2% van het lichaamsgewicht.
3. Schat de vetvrije massa (magere lichaamsmassa en alle andere vetvrije componenten) van elke vleermuis met behulp van de volgende vergelijking:
   
   OPMERKING: Gebruik de conventioneel geaccepteerde waarde van 0,732 voor het fractionele vochtgehalte van magere lichaamsmassa voor gezonde, euhydrateerde, niet-zogende vleermuizen. Het fractionele vochtgehalte van vetvrije massa kan veranderen in zogende grote bruinen op basis van de post-partum week¹⁵. Voor andere soorten, gebruik maken van de waarden gepubliceerd in de literatuur of bepalen van de fractionele vochtgehalte van mager lichaam massa voorafgaand aan het uitvoeren van berekeningen van de magere lichaamsmassa.
4. Schat de massa lichaamsvet met behulp van de volgende vergelijking:
   
5. Zet de lichaamsvetmassa in g naar procent lichaamsvet massa met behulp van de volgende vergelijking:
   

6. Bepaling van de watersamenstelling bij een carnivoor (Felis catus, huiskat)

1. Bereid de voorraadoplossing voor zoals beschreven in punt 1.
2. Weeg elke kat tot de dichtstbijzijnde 3 decimalen en neem gewicht op. Bereken de dosis voor elke kat zoals beschreven in stap 3.6 met behulp van een D₂O-dosis van 0,70 g/kg.
3. Bereid elke dosis voor zoals beschreven in de stappen 3.7−3.8. met behulp van een 3 mL of 5 mL spuit met een 22 G naald in plaats van een insulinespuit.
4. Verzamel 500 μL volbloed en toedienen vervolgens onderhuids de 0,7 g/kg D₂O. Centrifuge volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mLcentrifuge microcentrifuge schroefbovenbuizen op -20°C tot analyse.
5. Verzamel 500 μL volbloed 4 h na de injectie. Centrifugeer volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mL microcentrifuge schroefbovenbuizen bij -20 °C tot analyse.
6. Verzamel 500 μL volbloed 14 dagen na de injectie. Centrifugeer volbloed bij 2.000 x g voor 15 min en bewaar plasma in 1,5 mL microcentrifuge schroefbovenbuizen bij -20 °C tot analyse.
   OPMERKING: Het aantal dagen tussen de bloedafname kan gebaseerd zijn op de experimentele behoeften en de periode na de injectie waarin D₂O boven de achtergrondniveaus kan worden gedetecteerd. Veertien dagen was de lengte van de dieetbehandeling blokken van Hooper et al.⁹.
7. Voer FT-IR-analyse uit volgens sectie 4 en bereken de lichaamssamenstelling volgens sectie 5 van dit protocol.
8. Bereken het waterverbruik in mL/dag met behulp van de volgende vergelijkingen:
   
   
   
   wanneer TBW totaal lichaamswater is, zijn de initiële D₂O en de laatste D₂O de concentraties gemeten in ppm in de monsters na de injectie D₂O.

Resultaten

De deuteriumoxideverdunningstechniek kan worden gebruikt om de lichaamssamenstelling van een verscheidenheid aan soorten te beoordelen. Om het aanpassingsvermogen aan te tonen, rapporteren we het eerste gebruik van de deuteriumoxideverdunningstechniek in een Noord-Amerikaanse insectenetende vleermuissoort, Eptesicus fuscus, de grote bruine vleermuis voor representatieve resultaten. Een timing plateau werd voltooid door het nemen van pre- en post-D₂O injectie bloedmonst...

Discussie

Het gebruik van deuteriumoxide om TBW te bepalen wordt sinds de jaren 1940¹⁷ gebruikt en wordt gebruikt bij mensen en een verscheidenheid aan huisdieren- en wilde diersoorten^4,6,7. Andere niet-destructieve technieken zijn ontwikkeld, waaronder bio-elektrische impedantie analyse (BIA), DXA, en kwantitatieve magnetische resonantie (QMR). Elke methode heeft voor- en nadelen die in overweging moeten worden ge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 micron non-pyrogenic disk filter	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30mm diameter, 0.22um, steriel
1.5 mL conical microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-9701	1.5 ml zelfstandige microcentrifuge buis, natuurlijk met blauwe dop
10 mL steriele glazen injectieflacon	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	heldere, steriele glazen injectie-eenheid
10 mL injectiespuit	Becton Dickinson	305219	steriele 10 mL injectiespuit individueel verpakt
100 mL steriele glazen injectieflacon	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	heldere, steriele glazen injectie-eenheid
20 gauge naald	Exel	26417	naalden hypodermisch 20g x 1" plastic hub (geel) / reguliere snijrand
22 gauge naald	Exel	26411	naalden hypodermisch 22g x 1" plastic hub (zwart) / reguliere snijrand
deuteriumoxide	Sigma-Aldrich	151882-25G	99,9 atoom % D
isofluraan	Vetone	3060	fluriso isofluraan, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR standaard software
vaseline	Vaseline	305212311006	Vaseline, 100% pure petroleumgeleïe, origineel, huidbeschermer
plastische capillaire buisjes	Innovative Med Tech	100050	natriumheparine anticoagulant, 50 μL capaciteit, 30 mm lengte
Verzegelde vloeistofspectrofotometer SL-3 FTIR CAF2-cel	International Crystal Laboratory	0005D-875	0,05 mm Padlengte
natriumchloride	EMD Millipore	1.37017	geschikt voor biofarmaceutische productie
Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer	ThermoFisher Scientific	269-169400	discontinueer model, nieuwere modellen beschikbaar