Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59446

⸱

23 april 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

In dit artikel

Samenvatting

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Samenvatting

Olfactorische waarneming begint met de interactie van odorant met odorant receptoren (of) uitgedrukt door olfactorische sensorische neuronen (OSN). Geur erkenning volgt een combinatorische coderingsschema dat, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van odorant en één odorant kan het activeren van een combinatie van ultraperifere regio's. Door dergelijke combinatorische codering, kunnen organismen detecteren en onderscheid maken tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen. Dus, een geur met een bepaalde concentratie kan worden beschreven door een patroon voor activering van ultraperifere regio's, die specifiek is voor elke geur. In die zin, het kraken van de mechanismen die de hersenen gebruikt voor het waarnemen van geur vereist het begrip odorant-OR interacties. Dit is de reden waarom de reukzin Gemeenschap streeft naar "--orphanize" deze receptoren. Conventionele in vitro systemen gebruikt voor het identificeren van odorant- of interacties drachtige cel media met odorant, hebben gebruikt die verschilt van de natuurlijke detectie van geuren via damp odorant ontbinding in nasale mucosa voor interactie met ORs. Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van OR activering via damp-fase odorant. Onze methode is afhankelijk van de cAMP release door luminescentie met behulp van de bepaling van de Glosensor meten. Het huidige verschillen tussen de in vivo en in vitro benaderingen overbrugt en vormt de basis voor een biomimetische vluchtige chemische sensor.

Inleiding

De betekenis van geur kunt landdieren om te interageren met hun vluchtige chemische omgeving station gedrag en emoties. Fundamenteel, is het detectieproces geur begint met de allereerste interactie van odorant moleculen met de olfactorische systeem, op het niveau van odorant receptoren (ORs)1. ORs worden individueel zoogdieren uitgedrukt in olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel2. Zij behoren tot de familie van de G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en precies te zijn naar de subgroep van rodopsine-achtige (ook wel klasse A). ORs paar met de stimulerend G eiwit Golf wiens Activering tot cAMP productie leidt, gevolgd door de opening van cyclische nucleotide gated kanalen en de generatie van de actie potentieel. Het is geaccepteerd dat een geur percept is afhankelijk van een specifiek patroon van geactiveerde ORs3,4 en geur erkenning een combinatorische coderingsschema dat volgt, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van reukstoffen en één odorant kunt activeren een combinatie van ultraperifere regio's. En door middel van dergelijke combinatorische codering, het is gepostuleerd dat organismen kunnen detecteren en onderscheid tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen maken. Een van de sleutels tot het inzicht hoe geuren worden waargenomen is te begrijpen hoe en die ultraperifere regio's worden geactiveerd door een bepaalde geur.

In een poging om het verhelderen van odorant- of interacties, in vitro functionele testen een essentiële rol hebben gespeeld. De identificatie van de agonist geurige liganden voor wees ORs (OR ambtshalve orphanization) is een zeer actief gebied geweest voor de afgelopen twintig jaar, door het gebruik van diverse in vitro, ex vivo en in vivo Functionele assays5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In-vitro-assay systemen zijn zeer geschikt voor de gedetailleerde functionele karakterisering van ultraperifere regio's, met inbegrip van identificatie van de functionele domeinen en kritische residuen van ultraperifere regio's, evenals mogelijke waterbouwkundige toepassingen. Ontwikkeling van waardevolle in vitro systemen voor ultraperifere regio's is echter verder een uitdaging, gedeeltelijk als gevolg van problemen met kweken OSNs en functionele expressie van ultraperifere regio's in heterologe cellen geweest. De eerste uitdaging was geweest om de protocollen die voor de cel-oppervlakte expressie van functionele ultraperifere regio's in de toewijzing van odorant toegestaan-OR interacties. Een aantal onafhankelijke groepen hebben gebruikt verschillende benaderingen5,6,7,8,9,10,11,12, 14,,18,19,20. Een van de vroegste successen geboekt door Krautwurst et al. gelabeld in de N-terminus van ultraperifere regio's met een verkorte opeenvolging van rodopsine (Rho-tag) en een verbeterde oppervlakte expressie in menselijke embryonale nier (HEK) cellen13waargenomen. Voor de tag gekoppeld aan de volgorde van de OR aangebrachte wijzigingen is nog steeds een pad onderzocht voor het verbeteren van de OR expressie en functionaliteit19,-21. Saito et al.. dan vervoer van receptor eiwitten 1 (RTP1) geïdentificeerd en RTP2 die vergemakkelijken OR mensenhandel. 22 een kortere versie van RTP1, genaamd RTP1S, is ook aangetoond dat zelfs effectiever dan de oorspronkelijke eiwit23. De ontwikkeling van een cellijn (Hana3A) die stabiel Golf uitdrukt, REEP1 en RTP1, RTP2 24, in combinatie met het gebruik van cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) verslaggevers identificatie van odorant heeft ingeschakeld-OR interacties. Het mechanisme waarmee de RTP-familie van eiwitten cel oppervlakte expressie van ultraperifere regio's bevordert moet nog worden bepaald.

Een waarschuwing voor deze gevestigde methoden is dat ze op de stimulatie van de odorant in vloeibare fase vertrouwen, wat betekent dat odorant vooraf in een medium stimulatie opgelost zijn en cellen stimuleren door vervanging van het medium. Dit is zeer verschillend van de fysiologische omstandigheden waar odorant moleculen de olfactorische epitheel in damp fase bereiken en activeren van ORs door ontbinding in de nasale mucosa. Als u wilt meer sterk gelijken op fysiologisch relevante stimulans blootstelling, Sanz et al.20 voorgesteld een bepaling op basis van damp stimulatie door toepassing van een daling van odorant oplossing om op te hangen onder de binnenzijde van een plastic folie geplaatst op de top van cel wells. Zij de calcium antwoorden opgenomen door controle van de intensiteit van de fluorescentie. Deze methode was de eerste die lucht-fase odorant stimulatie, maar deed het niet toestaan dat een grote screening van OR activering.

Hier, ontwikkelden we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van in vitro OR activering via damp fase odorant stimulatie door de bepaling van de Glosensor (Figuur 1). Deze bepaling heeft eerder is gebruikt in het kader van vloeibare odorant stimulatie18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. de controle kamer van de luminometer is eerste geëquilibreerd met gevaporiseerde odorant vóór plaat lezen(Figuur 1). Odorant moleculen zijn dan solvated in de buffer, Baden van Hana3A cellen, uiting geven aan de OR van belang, RTP1S en de Glosensor eiwitten (Figuur 1B). Als de odorant een agonist van de UPR's is, zal de OR overschakelen naar een geactiveerde bevleesdheid en binden de Golf, activeren de adenylyl cyclase (AC) en uiteindelijk leiden tot cAMP niveaus te stijgen. Dit stijgende kamp zal binden aan en activeer het eiwit Glosensor voor het genereren van luminescentie luciferine katalyseren. Deze luminescentie wordt vervolgens geregistreerd door de luminometer en kan OR activering. Deze methode is van groot belang in het kader van OR deorphanization, zoals het in vitro systemen dichter bij de natuurlijke waarneming van geuren brengt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Hana3A cellen cultuur

  1. Bereiden M10 (Minimum essentiële Medium (MEM) plus 10% v/v foetale runderserum (FBS)) en M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B).
  2. Cultuur van de cellen in 10 mL van de M10PSF in een 100 mm cel cultuur schotel in een incubator vastgesteld op 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2).
  3. Verdeel de cellen om de 2 dagen op een 20%-verhouding: bij 100% samenvloeiing van cellen (ongeveer 1.1 x 107 cellen) wordt waargenomen onder een Microscoop fase contrast, streven de media en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. PBS gecombineerd en voeg 3 mL 0,05% trypsine-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA, 0,48 mM). Laten treden voor ongeveer 1 minuut, totdat de cellen van de plaat distantiëren.
  5. Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens.
  6. Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.
  7. Breng 1 mL van de oplossing van de geresuspendeerde cellen in een nieuwe cel cultuur schotel van 100 mm en voeg 9 mL verse M10PSF. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.

2. voorbereiding van de cellen van de Transfectie

  1. Evalueren de samenvloeiing, of het aantal cellen, door het observeren van hen onder een Microscoop fase contrast. Ten minste 10% samenvloeiing (ongeveer 1.1 x 106 cellen) is nodig voor een plaat.
  2. De media gecombineerd en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL PBS. PBS gecombineerd en voeg 3 mL EDTA. Laten treden voor ongeveer 1 minuut bij kamertemperatuur, totdat de cellen van de plaat distantiëren.
  3. Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens. Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
  4. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.
  5. Afhankelijk van het aantal platen om te zijn transfected, overdracht van een passend bedrag van cellen in een reservoir met de juiste bijbehorende volume van M10PSF. Een 96-wells-plaat moet worden bedekt met 1/10 van een 100% confluente 100 mm schotel (ongeveer 1.1 x 106 cellen) verdund in M10PSF tot een totaal volume van 6 mL. Voeg voor een 96-wells-plaat beginnen met een schotel van 100% samenvloeiing 100 mm, 500 µL van de 5 mL geresuspendeerde cellen tot 5,5 mL van verse M10PSF. Meng de cellen en M10PSF zonder dat er luchtbellen.
  6. Pipeteer 50 µL van de zwevende cellen in elk putje van de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO2.

3. plasmide transfectie

  1. Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 30% en 50%.
  2. Bereiden van een eerste transfectie mix waarin de plasmiden gemeenschappelijk aan de gehele plaat (RTP1S, of en Glosensor eiwit, Zie Tabel van materialen) na de volumes in tabel 1. Merk op dat de hoeveelheid Rho-gelabeld OR moet worden gedeeld door het aantal ORs als verschillende ORs.
    Opmerking: We sterk advies een lege vector negatieve controle (hier Rho-pCI) en een positieve controle (OR bekend om te reageren op de geteste odorant) toevoegen aan het experiment-plan.
  3. Een tweede transfectie mix met 500 µL van MEM en 20 µL van het Lipofectamine 2000 reagens te bereiden (geldig voor een 96-wells-plaat, Zie Tabel van materialen). De tweede mix toevoegen aan de eerste, en zachtjes Meng door omhoog en omlaag pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 5 mL M10 en meng voorzichtig.
  4. De M10PSF in de eerder vernikkeld 96-wells-plaat vervangen door 50 µL van de definitieve transfectie media. Incubeer in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 en vacuüm van de kamer van de luminometer overnachting volgende de procedure zoals in stap 6 beschreven.

4. substraat incubatie

  1. Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 60% en 100%. Bereid de oplossing van een stimulatie van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met 10 mM voor hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 5 mM van D-glucose.
  2. Verdun 75 µL van het kamp reagens (Zie tabel van materialen) -oplossing tot 2.75 / mL van de oplossing van de stimulatie. Verwijder het medium van de transfectie van de 96-wells-plaat en wassen van de cellen door 50 µL van vers stimulatie oplossing toe te voegen aan elk putje.
  3. Verwijder de stimulatie-oplossing en voeg 25 µL van cAMP reagens oplossing bereid in stap 4.2 aan elk putje. Incubeer de 96-wells-plaat bij kamertemperatuur in een donkere en geur-vrije omgeving (bijvoorbeeld een schone lege lade ver weg tegen chemicaliën of odorant) voor 2 h.

5. Odorant stimulatie

  1. Eerst, equilibreer de luminometer kamer met vluchtige odorant moleculen. Verdun de odorant aan de gewenste concentratie in 10 mL minerale olie(Figuur 2). Vóór het eind van de incubatietijd cAMP reagens, voeg toe 25 µL van de odorant oplossing in een nieuwe 96-wells-plaat (niet de ene met de cellen). Incubeer deze odorant plaat bij kamertemperatuur in de zaal van de luminometer voor 5 min (Figuur 2B) (geen luminometer opname is hier vereist).
  2. Instellen van de luminometer om vast te leggen van de luminescentie met 0 s van vertraging tijdens 20 cycli van plaat meting van 90 s met 0,7 s van het interval tussen de cycli.
  3. Vlak voor het lezen van de plaat, de odorant plaat uit de zaal te verwijderen. Voeg 25 µL van odorant tussen de putjes van de 96-wells-plaat met de cellen (de odorant niet toevoegen in de putjes met de cellen) en snel beginnen met het meten van de luminescentie van alle putjes voor 20 cycli binnen 30 min (Figuur 2C).

6. verwijdering van de resterende odorant binnen de Luminometer

  1. Open het deurtje van de luminometer. Plaats de buis verbonden met de vacuümpomp.
  2. Vacuüm odorant in de lezing kamer uitgebreid (ten minste 2 uur, bij voorkeur 's nachts) tussen twee odorant aan het voorkomen van kruisbesmetting van vluchtige stoffen de geur van een experiment naar de andere. Vervangen door frisse lucht door het sturen van perslucht gedurende 5 min voordat de volgende odorant aan het broeden.

7. de gegevensanalyse

  1. Exporteer de gegevens uit de luminometer-software.
  2. Het gemiddelde van de duplo's van hetzelfde of voor elke opnametijd. Bereken de genormaliseerde OR reactie aan een eventuele besturingselement (bijvoorbeeld lege vector, Figuur 3A en representatieve resultaten sectie) door het verdelen van de waarde van het besturingselement gemiddeld of gemiddeld waarde op elk tijdstip van de opname (Figuur 3B en representatieve resultaten sectie).
  3. Normaliseren de elke OR-reactie op hun basale activiteit door het verdelen van de gemiddelde reactie van de OR bij 0 s tot elke opname tijd reactie (Zie Figuur 3C en representatieve resultaten sectie).
  4. Bereken de oppervlakte onder de curve van elke of het verkrijgen van een interne OR-responswaarde. Om dit te doen, som van alle waarden van de luminescentie van elke opnametijd voor elke OR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij onderzocht de reactie van drie muis ORs, Olfr746, Olfr124 en Olfr1093 met behulp van cinnamaldehyde damp stimulatie (Figuur 3). Gelijktijdig, gebruikten we een lege vectorbestrijding (Rho-pCI) om te verzekeren dat de activiteiten van odorant-geïnduceerde van de geteste ultraperifere regio's specifieke (Figuur 3A). De real-time activering van de ultraperifere regio's op damp odorant stimulans was gecontroleerde meer dan 20 meting cycli. De ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De perceptie van geur is fundamenteel afhankelijk van de activering van ultraperifere regio's. Bijgevolg, begrip van hun functionaliteit is vereist voor spleet naar de complexe mechanismen waarmee de hersenen zijn vluchtige chemische omgeving waarnemen. Echter heeft het begrip van dit proces belemmerd door de moeilijkheden bij het vaststellen van een robuuste methode om het scherm van het repertoire van de OR voor functionaliteit tegen odorant in vitro. Cel oppervlak en heterologe expressie van ultraperifere reg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Y.F., H. K en H.M. een patent aanvraag ingediend relevant zijn voor dit werk op 27 oktober 2016.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH (DC014423 en DC016224) en het Defense Advanced Research Project Agentschap RealNose-Project. YF bleef aan de Duke University met financiële steun van JSPS programma voor de bevordering van strategische internationale netwerken voor het versnellen van de omloop van getalenteerde onderzoekers (R2801). Wij danken Sahar Kaleem voor het bewerken van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05 % trypsin-EDTAGibco25300-0540.05% Trypsin - EDTA (1x), fenol rood - bewaar bij 4°C
100 mm celkweekschaal BD Falcon353003100 mm x 20 mm celkweekschaal 
15 mL buisBD Falcon35209917 mm x 120 mm kegelvormige buizen
96-well plaatCorning384396 well, met LE-deksel wit met heldere bodem Poly-D-lysine gecoat Polystyreen
AmphotericinGibco15290-018Amphotericin B 250 µg/mL - bewaar bij 4 °C
centrifuge-machineJouanC312Centrifuge-machine met roterende emmer voor 15 mL
Klasse II Type A/B3 afzuigkapNUAIRENU-407-500afzuigkap voor celkweek
FBSGibco16000-044Fetaal bovien serum - bewaar bij -20 °C
GloSensor cAMP ReagensPromegaE1290GloSensor cAMP Reagens luminescente eiwit substraat - bewaar bij -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2Fisher Scientific11-676-604Incubator voor celkweek
Lipofectamine 2000 reagensInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000 Reagens 1mg/ml transfectie reagens - bewaar bij 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMABMG LABTECHdiscontinued96 well plaatlezer voor luminescentie
MineralolieSigmaM8410Solvent voor geurstoffen - bewaar bij kamertemperatuur
Minimum Essential Medium (MEM)Corning cellgro10-010-CVMinimum Essential Medium Eagle met Earle’s zouten & L-glutamine - bewaar bij 4 °C
Penicilline/StreptomycineSigma AldrichP4333Penicilline-Streptomycine oplossing gestabiliseerd met 10.000 U penicilline en 10 mg streptomycine - bewaar bij -20 °C
pGlosensorPromegaE2301pGloSensor-22F cAMP luminescente eiwit plasmide - bewaar bij 4 °C
Phase contrast microscoopLeica090-131.001phase contrast microscoop met x4, x10, x20 objectieven
RTP1SH. Matsunami lab-100 ng/µL plasmide - bewaar bij 4 °C

Referenties

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432(2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446(2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455(2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81(2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758(2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402(2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831(2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556(2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821(2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114(2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865(2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127(2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468(2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Geurstoffen in dampfasereal-time monitoringGlosensor-assaycAMP-vrijstekkingsmetingolfactorische sensorische neuronenacetofenonstimulatieluminometeranalysecelkweekprotocoltransfectieprocedure
Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.