Directe Intrabronchiale toediening om de selectieve depositie van de agent binnen de muis Long te verbeteren

Samenvatting

Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia bij muizen resulteert vaak in asymmetrische afgifte aan de distale longen.  In dit rapport beschrijven we een directe intrabronchiale (IB) benadering om elke Long in levende muizen niet-operatief te cannuleren.  Deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of kan worden aangepast om de symmetrische agent levering aan beide longen te verbeteren.

Samenvatting

Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia is een essentiële techniek in muriene modellen van diffuse longziekten, zoals bleomycine-geïnduceerde pulmonale fibrose.  Echter, distributie van intratracheally-toegediende agenten aan de distale muis Long is vaak asymmetrisch, met de Long parenchymale concentraties verhoogd in de kleinere (maar even toegankelijk) linker long van de muis.  Beschreven in dit rapport is een nieuwe intrabronchiale (IB) benadering om de linker-en/of rechter longen van levende muizen niet-operatief te cannuleren.  Het is ook aangetoond hoe deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of aangepast (via dosis gecorrigeerde IB-levering) om de linker-rechter symmetrie van de Long afgifte van experimentele agentia te verbeteren, waardoor de modellen van diffuse longziekte zoals bleomycine-geïnduceerde pulmonale fibrose.

Inleiding

Directe pulmonale toediening van experimentele agenten in muizen zorgt voor de studie van Long immuunresponsen, acute long letsel, en longfibrose. Directe Long toediening wordt meestal uitgevoerd via intratracheale (IT) instillatie, zoals eerder beschreven^1,2,3. Deze benadering is echter niet-selectief, waardoor beide longen in een nontargeted en vaak asymmetrische wijze worden aangetast.  Experimentele modellering van long letsel kan profiteren van de mogelijkheid om selectief te richten op een specifieke Long, waardoor het gebruik van de contralaterale Long als een controle. Omgekeerd, accurate modellering van menselijke diffuse longziekten profiteert van symmetrische verdeling van experimentele agentia naar het bilaterale Long parenchym.

Het algemene doel van dit verslag is het beschrijven van een methode voor selectieve levering van experimentele agentia aan de linker-of rechter long van een muis (Figuur 1). Deze intrabronchiale (IB) toedieningsweg zorgt voor een eenzijdige behandeling van een muis Long en kan gemakkelijk worden aangepast om een gelijke afgifte van een agens aan de bilaterale hoofdstam bronchiën te waarborgen. Door gebruik te maken van de IB-toediening om grotere doses experimentele agentia te leveren aan de grotere rechter long en kleinere volumes naar de kleinere linker long (d.w.z. een dosis gecorrigeerde IB-toediening), wordt in dit rapport aangetoond dat het een verbetering is van de homogeniteit van pulmonale levering van experimentele agenten, het optimaliseren van het model van diffuse long letsel bij muizen. Als zodanig kan dit verslag waarde hebben voor onderzoekers die proberen om de experimentele agentia eenzijdig toe te dienen aan muizen of om de symmetrie van de afzetting van het geneesmiddel in beide longen te verbeteren.

Protocol

Alle dier protocollen zijn goedgekeurd door de University of Colorado Denver Institutional Animal Care and use Committee (IACUC). Alle hieronder beschreven procedures (paragrafen 4 – 7) zijn geoptimaliseerd met zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6 muizen. Deze aanpak is gevalideerd met muizen variërend van 19 – 40 g in lichaamsgewicht.

1. creatie van platform voor IB administratie

1. Buig de Boekensteun van de originele 90 ° hoek tussen de basale vleugel en de staande vleugel tot 70 ° (Figuur 2a).
2. Boor een gat in het midden-bovenzijde van de staande vleugel van de metalen Boekensteun (Figuur 2a).
3. Boor een gat van identieke grootte op de corresponderende positie van het plastic bord. Boor twee kleinere gaten ondeugdelijkheid en lateraal (Figuur 2a).
4. Drapeer een 4:0 zijde hecht tussen deze kleine gaatjes in de kunststof plaat (Figuur 2a).
5. Plaats de klittenband op de rand van de kunststof plaat (Figuur 2a).
6. Monteer de kunststof plaat op de metalen Boekensteun met de schroef (Figuur 2b). Zorg ervoor dat de schroef moer voldoende strak is om het board in positie te houden, maar indien nodig om de hoek te kunnen afstellen.
7. Zorg ervoor dat de rotatie van het plastic bord rechtsom en linksom beweegt, vrij bewegen.
   Opmerking: rechtsom beweging wordt in dit rapport weergegeven als een (+) graden rotatie, en linksom wordt weergegeven als een (-) graden rotatie.
8. Gebruik een hoek gradenboog om het plastic bord te positioneren op + 30 °, + 86 °,-30 ° en-74 ° en markeer ze respectievelijk op de Boekensteun.

2. creatie van uitgebreide katheters voor de toediening van IB-agenten

1. Maak een rechte hoek snede met een scherp mes op de punt van een originele katheter van 22 G (25 mm, Zie tabel met materialen) (Figuur 3, stap 1a).
2. Schuine kant (~ 50 ° – 60 °) de punt van de andere oorspronkelijke katheter (25 mm) met het mes, vervolgens afgesneden in rechte hoek van de hub (Figuur 3, stap 1b).
3. Lijm de twee katheters aan hun stompe uiteinden met een iets minder dan 180 ° hoek (Figuur 3, stap 2).
4. Bot de schuine punt door te smelten met een lage temperatuur cauterie (Zie tabel van de materialen).
5. Polijsten de verlengde katheter met "0" grootte schuurpapier op het gelijmde gebied en de schuine punt van de verlengde katheter (Figuur 3, stap 3).
6. Markeer op de verlengde katheter met verschillende kleuren op 25 mm, 30 mm en 35 mm (Figuur 3, stap 3).
7. Geef de schuine zijde van de verlengde katheter aan door de hub met marker te labelen.
8. Spoel de verlengde katheter met DI water, na door het spoelen van de binnenkant van de katheter met 70% ethanol. Airdry de katheter.
9. Steriliseren met UV-licht gedurende 10 minuten voor gebruik.

3. voorbereiding voorafgaand aan de procedure

1. Maak alle toegediende stoffen in een biologische veiligheids motorkap onder steriele techniek.
2. Reinig de werkplek met 70% ethanol.
3. Steriliseer alle chirurgische gereedschappen met 70% ethanol.
4. Bevestig de basis van het werkplatform aan de bank direct voor de onderzoeker door het aanbrengen van C-klemmen op de basale vleugel van de Boekensteun.
5. Genereer verschillende geïmproviseerde spirometers, die apparaten zijn die het mogelijk maken de getijden luchtstroom bij muizen te detecteren. In het kort, deponeren 60 μL gesteriliseerde zoutoplossing in een 1 mL spuit (zuiger verwijderd) met een gel laadpunt.
   Opmerking: de gestorte druppel zoutoplossing occludeert het vat en beweegt naar boven en naar beneden bij blootstelling aan getijden ventilatie³.
6. Bevestig losjes de naaf van een 22 G verlengde katheter aan de geïmproviseerde spirometer.
7. Plaats elk van de glazen druppel pers aan elke kant van het platform voor gemakkelijke toegang.
8. Verbind de Isofluraan inductie kamer met de knaagdieren anesthesie machine (Zie tabel van de materialen) in een Isofluraan-compatibele biologische veiligheidskast.

4. niet-operatieve IT-intubatie benadering

1. Anesthetiseer een C57BL/6 muis (mannelijk of vrouwelijk, 8 – 10 weken, ~ 25 g) met zuurstof (2 L/min) en 5% Isofluraan (Zie tabel van materialen) in een inductie kamer voor 4 min.
2. Aspirate het experimentele middel dat moet worden afgeleverd (bijvoorbeeld Evans Blue Dye of FITC-dextran, zoals aangetoond in Figuur 4) in twee pipetten, en plaats ze vervolgens aan elke kant van het platform tijdens sedatie.
3. Zorg voor een ademhalingsfrequentie van ongeveer 24 – 30 ademhalingen/min voordat u de muis uit de anesthesie-inductie kamer verwijdert.
   Opmerking: Isoflurane anesthesie duurt meestal 4 minuten, voldoende voor alle IB-procedures. Als de operator niet bekwaam is met de techniek, kan ketamine/xylazine (80 mg/kg en 10 mg/kg intraperitoneaal, Zie tabel van de materialen) worden gebruikt voor meer langdurige anesthesie.
4. Onderbreek de muis door de snijtanden op de gedrapeerde hecht lijn in rugligging. Beveilig de muis met twee tot drie stukken haak en loop de tape losjes en Vermijd de beperking van ventilatie.
5. Zet de LED Fiber Optic illuminator aan (Zie tabel met materialen, figuur 2c).
6. Plaats de operator achter het platform (dorsaal aan de muis).
7. Oriënteer de zwanenhals van de verlichter zodat deze het strottenhoofd gebied door de huid verlicht. De afstand tussen de muis en de lichtbron is 2 – 3 cm (figuur 2c).
8. Bevestig de diepte van de anesthesie met een teen/paw pinch voordat u alle onderstaande procedures uitvoert.
9. Houd de steriele Tang vast met de dominante hand en trek de tong uit de mondholte met de Tang.
10. Houd de steriele depressor met de niet-dominante hand, dan afvlakken van de wortel van de tong met de depressor om de orofarynx op grote schaal bloot. De Tang kan dan worden losgelaten, waardoor de dominante hand vrijkomt.
11. Gebruik de dominante hand om de verlengde katheter via de mondholte in de luchtpijp te intuberen (figuur 2c).
12. Bevestig de plaatsing door te observeren of de bubbel in de spuit met elke adem op en neer beweegt.
13. Aanvullende details van IT-intubatie zijn eerder gepubliceerd³. Totale procedure tijd, met uitzondering van anesthesie, duurt 10 – 15 s voor een goed opgeleide operator.

5. niet-operatieve IB intubatie-en leverings benaderingen

1. IB-benadering van selectieve lobar-cannulatie van de distale rechter long
   1. Na het uitvoeren van het infusen (stap 4,11), draai het plastic bord + 30 ° (Fig. 4a).
   2. Houd de naaf van de katheter vast en leid deze op natuurlijke wijze parallel met de middenlijn van de muis, en strek deze uit tot op gewicht gebaseerde diepten zoals beschreven in tabel 1.
      Opmerking: de weerstand op deze diepten moet worden genoteerd. Op dit punt, de muis zal enigszins tachypneic worden, zoals uitgelegd in de representatieve resultaten. Voor een ervaren operator zal ongeveer 90% van de pogingen de rechter Long met succes cannuleren (met tachypneu genoteerd).
   3. Lever 20 μL 0,3% Evans Blue Dye (EBD, Zie tabel met materialen) met een gel loading tip.
   4. Verdeel 1 – 2 aliquots (elk 0,1 mL) van de lucht met behulp van de glas druppelaar.
      Opmerking: Dit zorgt voor de klaring van de resterende EBD-oplossing (of experimentele middelen) van binnenuit van de katheter.
   5. Trek de katheter in en houd vervolgens de muis stand voor 30 sec.
   6. Leg het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
2. IB benadering van selectieve segmentale cannulatie van de distale linker long
   1. Na het uitvoeren van de cannulatie (stap 4,11), draai het plastic bord-74 ° (figuur 4b).
   2. Houd de naaf van de katheter vast en breng zachte druk aan om de katheter in de linker mainstam bronchus te brengen, terwijl de bescheiden druk zowel naar beneden (90 °) als naar de Boekensteun wordt gebracht. Op dieptes vermeld in tabel 1moet de operator de weerstand opmerken, aangezien de onderste segmenten van de linker long zijn ingeschakeld. Als tachypneu optreedt, trekt u de katheter in op de positie van 20 – 25 mm en probeert u opnieuw.
   3. Na het cannuleren van de linker onderste Long segmenten is een verandering in positie vereist om zwaartekracht assistentie toe te staan voor agent administratie. Draai de kunststof plaat-30 ° (figuur 4b).
   4. Lever 40 μL 0,3% EBD met een gel-laadpunt.
      Opmerking: het is mogelijk om een groter volume van de agent te leveren, omdat de linker long slechts één LOB heeft.
   5. Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van de glas druppel pers.
      Let op: Dit zorgt voor de klaring van eventuele resterende EBD (of experimentele agenten) van binnenuit van de katheter.
   6. Trek de katheter in en houd vervolgens de muis stand voor 30 sec.
   7. Leg het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
3. Aanpassing van de IB-administratie om de levering van een agent volledig van linker-of rechter longen mogelijk te maken
   Opmerking: als de operator streeft naar het leveren van agenten niet aan een specifieke rechter long kwal of linker long segment, maar in plaats van de hele Long (rechts of linker long), de katheter moet enigszins worden teruggetrokken om de respectieve hoofdstam bronchiën, als volgt.
   1. Juiste volledige Long toediening
      1. Draai na stap 4,11 het plastic bord + 30 ° (figuur 5a).
      2. Houd de naaf van de katheter en leid deze natuurlijk parallel aan de middenlijn van de muis, en bereik deze tot diepten die nodig zijn voor de rechter zijdige distale lobar-cannulatie (tabel 1).
      3. Bevestig het uiterlijk van het tachypneu-teken.
      4. Draai de muis-74 ° om zwaartekracht assistentie voor de levering van agenten in te schakelen (Figuur 5b).
      5. Zuig de katheter op in een positie die overeenkomt met het opstijgen van de rechteronderstam bronchus (tabel 1). Zorg ervoor dat de schuine kant van de katheter naar beneden gericht is (Figuur 5b).
      6. Lever 30 μL 0,3% EBD met een gel loading tip aan de juiste Long.
      7. Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van een glas druppelaar.
      8. Trek de katheter in en houd de muis stand gedurende 30 sec. plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
   2. Volledige Long toediening links
      1. Draai na stap 4,11 de plastic plaat-74 ° (Figuur 6a). Als alternatief kan rotatie optreden na stap 5.3.1.8 door de katheter terug te trekken naar de luchtpijp, wat de bilaterale toediening van IB-agenten mogelijk maakt.
      2. Houd de naaf van de katheter vast en breng zachte druk aan om de katheter in de linker mainstuurkath eter te brengen, terwijl de bescheiden druk zowel naar beneden (90 °) als naar de Boekensteun wordt gebracht. De diepte van de Intubatie wordt geleid door tabel 1.
      3. Bevestig het no tachypneu teken.
      4. Draai de muis + 86 ° om zwaartekracht hulp met agent administratie mogelijk te maken.
      5. Trek de katheter aan de linker mainstam bronchus (dezelfde afstanden als de rechter long voldoende zijn, tabel 1) en draai de schuine kant van de katheter naar beneden (Figuur 6b).
      6. Lever 30 μL 0,3% EBD met een gel-laadpunt naar de linker long.
      7. Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van een glas druppelaar.
      8. Trek de katheter in en houd de muis stand gedurende 30 sec. plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.

6. gebruik van sequentiële IB-cannulatie benaderingen voor het leveren van dosis gecorrigeerde hoeveelheden agent aan elke Long

1. IT-beheergroep
   1. Voer de cannulatie uit zoals beschreven in stap 4.1 – 4.11.
   2. Lever 60 μL 0,05% FITC-dextran (Zie tabel met materialen) met een gel-laadpunt (Figuur 1b).
   3. Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van de glas druppel pers.
   4. Houd de positie voor 60 s en toestaan voor muis herstel zoals hierboven beschreven.
2. Symmetrische bilaterale IB-administratie
   1. Voer stappen 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (rechter long) en stappen 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (linker long) uit.
   2. Dien gelijke volumes (30 μL) van 0,05% FITC-dextran (of een experimenteel middel) toe aan elke zijde van de longen.
3. Dosis-gecorrigeerde bilaterale IB-toediening
   1. Voer stap 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (rechter long) en stappen 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (linker long).
   2. Dien een groter volume (40 μL) van 0,05% FITC-dextran toe aan de grotere rechter long, en een kleiner volume (20 μL) van 0,05% FITC-dextran aan de kleinere linker long. In plaats van FITC-dextran kan een experimenteel agens worden toegediend.

7. gebruik van een dosis gecorrigeerde IB-toediening ter verbetering van de symmetrie van de enkelvoudige dosis bleomycine (BLM)-geïnduceerde long letsel

1. BLM-beheergroepen
   1. Dosis-gecorrigeerde IB-BLM (1,2 mg/kg, Zie Inhoudsopgave) toedienings groep: 60 μl (20 μl voor de linker long en 40 μl voor de rechter long) van blm-oplossing werden bij muizen afgeleverd (n = 5). Besturingselementen (n = 5) ontvangen vergelijkbare volumes zoutoplossing.
      Opmerking: Zie de stappen 5.3.1 en 5.3.2.
   2. IT-administratie groep: 60 μL BLM-oplossing werd geleverd aan muizen met IT-beheertechnieken.
      Opmerking: Zie de stappen 6.1.1 – 6.1.4.
2. Longfunctie meting
   1. Op dag 21 na BLM of zoutoplossing, anesthetiseer muizen met een intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (160 mg/kg) en xylazine (32 mg/kg).
   2. Na bevestiging van de diepte van de anesthesie door paw/teen pinch, voer een tracheostomie met een 18 G canule (Zie tabel van de materialen).
   3. Verbind muizen met de ventilator en meet de Ademhalings mechanica zoals eerder beschreven⁴.
3. Longweefsel inzameling en-verwerking
   1. Na het meten van de pulmonaire mechanica, euthanruseer de verdoofde muizen door cardiale punctie.
   2. Open de borstwand en induceren bilaterale pneumothoraces.
   3. Blaas de longen op met 1% laag smelt agarose (40 °C)⁵ in PBS met een constante druk (42 cm H₂O).
   4. Snijd vier tot vijf stukjes van de longen langs de lange as dwars, fixeer in 10% formaline, en insluiten in paraffine.
   5. Snijd 5 μm secties en beits met de trichrome van Masson om de depositie van collageen te visualiseren.

8 post-procedurele zorg

1. Aan het einde van de overlevings procedures, plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.

Resultaten

Selectieve IB-intubatie richt zich op specifieke lobben (rechter long) of basilaire segmenten (linker long).

IB toediening van EBD naar de juiste Long werd uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 5,1. Na afloop van het experiment werden muizen een dodelijke dosis intraperitoneale ketamine/xylazine toegediend, en longen werden geoogst voor demonstratie van EBD-verdeling (figuur 4a, ...

Discussie

Long letsel is klassiek gemodelleerd in knaagdieren met behulp van de IT-administratie van schadeveroorzakende agenten zoals BLM⁶. Een dergelijke IT-administratie leidt echter alleen tot fragmentarisch letsel, dat de nontargeted aard van de Long levering weerspiegelt met deze aanpak⁷. Deze beperkingen van het modelleren van long letsel zijn leerzame uitdagingen bij het proberen van de IT-levering van niet-schadelijke experimentele agenten, zoals drugs, siRNA of cellulaire t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini knaagdieranesthesiemachine	DRE Veterinary	9280
Evans blue kleurstof	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isofluraan	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscoop Illuminator	AmScope	LED-30W
Laagtemperatuur cautery met fijne tip	Bovie	AA02
Precisionglide naald, 18G x 1"	BD	305195	Geslepen punt, 12 mm lengte
Xylazin	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine