We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën spelen de meest prominente rollen in cellulaire metabolisme door het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering en regulering van een verscheidenheid van fysiologische processen. Mitochondriale dysfunctie is een primaire oorzaak van een aantal metabole en neurodegeneratieve ziekten. Intact mitochondriën zijn van cruciaal belang voor hun goede werking. De enzym citraat synthase is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve enzym marker van intacte mitochondriale massa. Gezien het feit dat veel moleculen en trajecten die belangrijke functies in de mitochondriën hebben zeer worden bewaard tussen mensen en Drosophila, en dat een scala aan krachtige genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar in Drosophila, Drosophila fungeert als een goed modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie. Hier presenteren we een protocol voor snelle en eenvoudige meting van citraatsynthase-activiteit in weefsel homogenaat van volwassen vliegen zonder de mitochondriën te isoleren. Dit protocol is ook geschikt voor het meten van citraat synthase-activiteit in larven, gekweekte cellen en zoogdier weefsels.
Inleiding
Mitochondriën zijn het best bekend als de Power-producerende organellen in de meeste eukaryotische organismen, die de energie valuta produceren, ATP, door middel van de tricarboxylzuur cyclus (dat wil zeggen, Krebs cyclus) en oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn ook gevonden om te spelen belangrijke rollen in een heleboel andere fysiologische processen, zoals regulering van apoptosis1, CA2 + homeostase2,3, reactieve oxidatie soorten (Ros) generatie4, en endoplasmatisch reticulum (er)-stress response5. Mitochondriale dysfunctie kan elk orgaan in het lichaam op elke leeftijd beïnvloeden en is een primaire oorzaak van metabole, veroudering-gerelateerde6, en neurodegeneratieve ziekten7. Intact mitochondriën zijn mechanistisch gerelateerd aan mitochondriale functie. Dus, juiste kwantificering van intacte mitochondriale massa is zeer belangrijk voor de evaluatie van de mitochondriale functie8. Citraat synthase, een snelheidsbegrenzer enzym in de eerste stap van de tricarboxylzuurcyclus9, is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix binnen eukaryotische cellen, en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve marker voor de aanwezigheid van intacte mitochondriale massa9,10. Citraat synthase activiteit kan ook worden gebruikt als een normalisatie factor voor intacte mitochondriale eiwitten11,12.
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie, omdat veel moleculen en trajecten die cruciale rollen in mitochondriën spelen, evolutionair worden bewaard van Drosophila naar mensen13,14,15. Hier presenteren we een protocol voor een snelle en eenvoudige methode voor het meten van citraat synthase activiteit door een colorimetrische assay in Drosophila weefsel homogeniteert16 in een 96 goed plaat formaat. In de Citraatsynthase-activiteit test de citraat synthase in het weefsel van Drosophila een katalyseert de reactie van Oxaloacetaat met acetyl coenzym A (acetyl CoA) om de citraat COA-sh en H+te vormen. CoA-SH reageert vervolgens met 5,5 '-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) voor het genereren van een gekleurd product, 2-Nitro-5-thiobenzoaat (TNB), die gemakkelijk spectrofotometrisch kan worden gemeten bij 412 nm. Citraatsynthase-activiteit kan worden weerspiegeld door de snelheid van de kleur productie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. colorimetrische citraat synthase-Activiteitstest voor D. melanogaster16
- Verzamel tien volwassen vliegen voor elk monster. Verzamel ten minste drie monsters voor elk genotype.
- Bereid 500 μL ijskoude extractiebuffer met 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA en 0,1% Triton X-100 in een test buis van 1,5 mL voor elk monster.
- Anesthetize volwassen vliegt met CO2 op een verdoving pad en isoleren van de gewenste weefsels. Om de volwassen vlieg thoraxes te isoleren, bijvoorbeeld, Fixeer je de vlieg thoraxes met een paar tang en Isoleer je vervolgens de vlieg buikjes door langs de rand van de thorax en de buik te snijden met behulp van een schaar. Verzamel de vlieg thoraxes voor de spier citraat synthase activity assay.
Opmerking: Bepaal het verse gewicht van het weefsel bij deze stap als u het gebruikt om citraat synthase-activiteit te normaliseren. - Breng 10 volwassen vliegthoraxes over naar 100 μL ijskoude extractiebuffer en homogeniseren met een stamper op ijs. Om de monsters ijskoud te houden, homogeniseren de monsters voor 5-10 s op ijs, dan hebben de monsters zitten op ijs voor 5 s, en herhaal totdat alle weefsels in de buis zijn volledig gehomogeniseerd.
Opmerking: plak de buis, Controleer de homogenaten om ervoor te zorgen dat er geen stolsels in de homogenaten zijn en dat de weefsels in de buis volledig worden gehomogeniseerd. Alle monster behandelingen moeten op ijs worden uitgevoerd. - Neem 10 μL van elk gehomogeniseerd monster in een nieuwe buis voor meting van de eiwit inhoud. Houd de monsters voor de eiwit meting op ijs.
Opmerking: de proteïne monsters kunnen worden bevroren en opgeslagen bij-80 °C voor latere analyse. De eiwit concentraties dienen als een interne parameter voor het normaliseren van citraatsynthase-activiteiten. - Voeg 400 μL ijskoude extractiebuffer toe aan elk resterend monster om een totaal volume van 500 μL te maken. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren ten minste 5x, waardoor de ballonvorming wordt vermeden. Voeg voor elke reactie 1 μL verdund cellysaat toe aan 150 μL van de vers bereide reactie oplossing (20 mM tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM oxaloazijnzuur). Meng grondig en onmiddellijk door het zachtjes pipetteren, het vermijden van Bubble vorming. Meet de extinctie bij 412 nm elke 10-30 s gedurende 4 minuten bij 25 °C met behulp van een plaat lezer die bij een minimum interval van 10 sec. de extinctie kan meten bij 412 nm.
Opmerking: Wijzig de punt voordat u een ander reagens Pipetteer en Vermijd het vormen van bubbels in de putjes. Onvolledige menging van de reagentia kan variaties in de metingen veroorzaken. De Citraatsynthase-activiteit test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur onmiddellijk nadat de monsters zijn verzameld, omdat deze test wordt gebruikt om de intacte mitochondriale massa te kwantificeren. De reactiebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid en mag niet worden opgeslagen. - Plot gegevens als optische dichtheid (OD) extinctie (ABS) (Y-as) versus tijd (in minuten) (X-as). Bereken vervolgens de helling voor het lineaire gedeelte van de curve, waarbij de reactiesnelheid
Verdeel de waarde door de eiwitconcentratie van het monster om de citraat synthase-activiteit te normaliseren. De citraat synthase-activiteit wordt berekend als
Opmerking: de eiwitconcentratie van het monster kan worden gemeten met een eiwit concentratiekit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een voorbeeld van de kinetische curven voor de OD-extinctie bij 412 nm na verloop van tijd verkregen met behulp van de Citraatsynthase-activiteit colorimetrische assay om het Drosophila thorax-weefsel te meten homogeneert van verschillende genotypes. Het is bekend dat PGC-1α een Master regulator is van de mitochondriale biogenese. PGC-1α is functioneel bewaard tussen Drosophila en mensen. Drosophila RNF34 (dRNF34) is ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Metabole studies met Drosophila als model moeten rekening houden met de genetische achtergrond, voeding en voorraad onderhoud van de vliegen18. Om de effecten van verschillende genetische achtergronden op de meting van citraat synthase activiteit te voorkomen, moeten verschillende stammen van Drosophila gedurende 10 generaties worden teruggestoken naar de controlestam. De genetische achtergrond van alle Drosophila stammen gebruikt in onze experimenten is w1118
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31401013 en 31471010), de Science and Technology Commission van Shanghai Municipality, Shanghai Pujiang programma (14PJ1405900), en Natural Science Foundation van Shanghai (19ZR1446400).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referenties
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
