We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën spelen de meest prominente rollen in cellulaire metabolisme door het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering en regulering van een verscheidenheid van fysiologische processen. Mitochondriale dysfunctie is een primaire oorzaak van een aantal metabole en neurodegeneratieve ziekten. Intact mitochondriën zijn van cruciaal belang voor hun goede werking. De enzym citraat synthase is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve enzym marker van intacte mitochondriale massa. Gezien het feit dat veel moleculen en trajecten die belangrijke functies in de mitochondriën hebben zeer worden bewaard tussen mensen en Drosophila, en dat een scala aan krachtige genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar in Drosophila, Drosophila fungeert als een goed modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie. Hier presenteren we een protocol voor snelle en eenvoudige meting van citraatsynthase-activiteit in weefsel homogenaat van volwassen vliegen zonder de mitochondriën te isoleren. Dit protocol is ook geschikt voor het meten van citraat synthase-activiteit in larven, gekweekte cellen en zoogdier weefsels.
Inleiding
Mitochondriën zijn het best bekend als de Power-producerende organellen in de meeste eukaryotische organismen, die de energie valuta produceren, ATP, door middel van de tricarboxylzuur cyclus (dat wil zeggen, Krebs cyclus) en oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn ook gevonden om te spelen belangrijke rollen in een heleboel andere fysiologische processen, zoals regulering van apoptosis1, CA2 + homeostase2,3, reactieve oxidatie soorten (Ros) generatie4, en endoplasmatisch reticulum (er)-stress response5. Mitochondriale dysf....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. colorimetrische citraat synthase-Activiteitstest voor D. melanogaster16
- Verzamel tien volwassen vliegen voor elk monster. Verzamel ten minste drie monsters voor elk genotype.
- Bereid 500 μL ijskoude extractiebuffer met 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA en 0,1% Triton X-100 in een test buis van 1,5 mL voor elk monster.
- Anesthetize volwassen vliegt met CO2 op een verdoving pad en isoleren van de gewenste weefsels. Om de volwassen vlieg thoraxes te isoleren, bijvoorbeeld, Fixeer je de vlieg thoraxes met een paar tang en Isoleer je vervolgens de vlieg buikjes door langs de rand van de thorax en de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een voorbeeld van de kinetische curven voor de OD-extinctie bij 412 nm na verloop van tijd verkregen met behulp van de Citraatsynthase-activiteit colorimetrische assay om het Drosophila thorax-weefsel te meten homogeneert van verschillende genotypes. Het is bekend dat PGC-1α een Master regulator is van de mitochondriale biogenese. PGC-1α is functioneel bewaard tussen Drosophila en mensen. Drosophila RNF34 (dRNF34) is .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Metabole studies met Drosophila als model moeten rekening houden met de genetische achtergrond, voeding en voorraad onderhoud van de vliegen18. Om de effecten van verschillende genetische achtergronden op de meting van citraat synthase activiteit te voorkomen, moeten verschillende stammen van Drosophila gedurende 10 generaties worden teruggestoken naar de controlestam. De genetische achtergrond van alle Drosophila stammen gebruikt in onze experimenten is w1118
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31401013 en 31471010), de Science and Technology Commission van Shanghai Municipality, Shanghai Pujiang programma (14PJ1405900), en Natural Science Foundation van Shanghai (19ZR1446400).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referenties
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
