Bewerkt Heterotopic achterpoten Osteomyocutaneous flap model in de rat voor translationele vasculaire composiet Allotransplantation onderzoek

Samenvatting

Vasculaire composiet Allograft biedt levensveranderende voordelen aan transplantatie ontvangers, maar de biologische oorzaken van enten afwijzing en vasculopathie blijven slecht begrepen. De knaagdier chirurgische model hier gepresenteerd biedt een reproduceerbaar, klinisch relevant model van transplantatie, waardoor onderzoekers om afwijzing gebeurtenissen en potentiële therapeutische strategieën te evalueren om hun optreden te voorkomen.

Samenvatting

Vasculaire composiet allotransplantation (VCA) is een relatief nieuw veld in de reconstructieve chirurgie. De klinische prestaties in menselijke VCA omvatten hand en gezichts transplantaties en, meer onlangs, buikmuur, baarmoeder, en urogenitale transplantaties. Functionele resultaten hebben de initiële verwachtingen overschreden, en de meeste ontvangers genieten van een betere kwaliteit van leven. Nochtans, aangezien de klinische ervaring accumuleert, moeten de chronische verwerping en de complicaties van immunosuppressie worden gericht. In veel gevallen waar enten hebben gefaald, de oorzakelijke pathologie is ischemische vasculopathie. De biologische mechanismen van de acute en chronische afwijzing geassocieerd met VCA, vooral ischemische vasculopathie, zijn belangrijke gebieden van onderzoek. Door het zeer geringe aantal VCA patiënten wordt de evaluatie van de voorgestelde mechanismen echter beter aangepakt in een experimenteel model. De veelvoudige groepen hebben dierlijke modellen gebruikt om enkele relevante onopgeloste vragen in VCA verwerping en vasculopathie aan te pakken. Verscheidene model ontwerpen die een verscheidenheid van soorten impliceren worden beschreven in de literatuur. Hier presenteren we een reproduceerbaar model van VCA heterotopic achterpoten osteomyocutaneous flap in de rat die kan worden gebruikt voor translationeel VCA onderzoek. Dit model zorgt voor de seriële evaluatie van het transplantaat, met inbegrip van biopten en verschillende Imaging modaliteiten, met behoud van een laag niveau van morbiditeit.

Inleiding

Reconstructieve chirurgie voor de katastrofisch weefsel verlies van amputatie, blast verwondingen, maligniteiten, en aangeboren afwijkingen worden beperkt door de beschikbaarheid van weefsel van de patiënt en de extra morbiditeit veroorzaakt op de donor site. In sommige gevallen, zoals branden slachtoffers of quadrilateral geamputeerden, levensvatbaar weefsel voor de wederopbouw is niet beschikbaar bij de patiënt. In 1964 werd de eerste moderne hand transplantatie uitgevoerd in Ecuador. Hoewel dit een technisch succes was, immunosuppressie beschikbaar op het moment was onvoldoende om afwijzing te voorkomen, en het Graft werd verloren in minder dan 3 weken¹. In 1998 en 1999, werden de eerste hand transplantaties in de moderne era van immunosuppressie uitgevoerd in Lyon, Frankrijk² en Louisville, Kentucky, de v.s.³. Voor de eerste keer, reconstructieve chirurgen kunnen vervangen als met like. Face transplantatie werd voor het eerst uitgevoerd in 2005⁴, en een aantal andere VCA enten zijn nu routinematig worden uitgevoerd, zoals buikwand⁵, baarmoeder, en urogenitale transplantaties⁶.

In tegenstelling tot vaste orgaantransplantatie, de meeste VCA-technieken te betrekken de aanwezigheid van de zeer antigenische donorhuid. Klinische ervaring heeft vastgesteld dat de acute afwijzing van de huid is relatief eenvoudig te controleren, maar kan bijdragen aan de chronische afwijzing van de onderliggende weefsels en vaten, die niet goed reageren op de behandeling⁷. De vasculaire dysfunctie geassocieerd met een alloimmune reactie is een meer onheilspellend obstakel voor het gebied van VCA⁷. Macrovasculopathies leiden tot doorbloeding tekorten, vertraagde genezing, en proinflammatoire aandoeningen. Beide Confluent agressieve grote vaartuigen vasculopathie en focale intima hyperplasie optreden in de hand transplantatie ontvangers⁷. Daarnaast, microvasculopathies waarschijnlijk bijdragen aan de VCA complicaties zo goed en kan zelfs leiden tot afwijzing gebeurtenissen. Terwijl zowel immune als niet-immune factoren waarschijnlijk een rol in de vasculopathie van hand transplantatie ontvangers spelen, zijn de specifieke mechanismen die distale schip dysfunctie in VCA bevorderen niet gekend, in het bijzonder in de context van low-grade, chronische verwerping. Deze onbeantwoorde vragen vereisen de ontwikkeling van een dier VCA model dat zal zorgen voor de seriële beoordeling van het transplantaat tijdens de klinische cursus van VCA afwijzing/onderhoud en vasculopathie. Zulk een model zal inzicht in de verwerping en vasculopathie in aanwezigheid van immunosuppressie, besmettelijke uitdaging, en/of andere postoperatieve traumatische verwonding^8,9aanbieden.

Hier gepresenteerd is een allogene rat VCA heterotopic achterpoten osteomyocutaneous flap model. Gebaseerd op eerder gepubliceerde VCA modellen, deze procedure is technisch eenvoudig uit te voeren, reproduceerbaar in een groot aantal, en vertoont minimale morbiditeit en ongemak voor de ontvangende dier. Dit model is ontworpen om klinische en histopathologisch beoordelingen van VCA acceptatie versus afwijzing mogelijk te maken, en biedt een kans om onderliggende immuun-en niet-immuun mechanismen die betrokken zijn bij afwijzing te evalueren.

Protocol

Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door de Universiteit van Louisville de institutionele Dierenzorg en het gebruik Comite (DEC-goedgekeurd protocol 18198) en de nationale instituten of Health (NIH) gids voor de zorg en het gebruik van Proefdieren¹⁰. Vier maanden oud mannelijk bruin-Noorwegen (RT1. Eenⁿ) en 4 maanden oude mannelijke Lewis (RT1. A^l) ratten werden gebruikt als VCA donor en ontvangers, respectievelijk.

1. donor Allograft oogst

1. Kalmeren de donordier met behulp van verdampte Isofluraan toegepast door een kamer.
2. Scheren de ent donor gebied (achterpoten), evenals de lies en de buik gebieden. Na dat, te behandelen met Ontharingscrème om de hoeveelheid fuzz achtergelaten door de Clippers te verminderen.
3. Diep verdoven donordieren met behulp van intraperitoneale (IP) ketamine (60 mg/kg)/xylazine (15 mg/kg)/Acepromazine (2 mg/kg). Toediening van een initiële dosis van 0,2 mL/100 g lichaamsgewicht en extra doses van 0,2 mL per h. Voor het gemak, is het facultatief om deze stap vóór stap 2 uit te voeren.
4. Continu toezicht houden op dieren, terwijl onder narcose voor de ademhaling, lichaamstemperatuur, en de diepte van de anesthesie, met behulp van de teen pinch intrekking reflex test.
5. Beheer 30 U van heparine oplossing onderhuids (SC) in de Scruff gebied voorafgaand aan de operatie om stolling te voorkomen.
6. Draag een masker, een hoofddeksel, een wegwerp isolatie jurk, en wegwerphandschoenen.
7. Plaats de donordier liggende op een verwarmingskussen. Produceer een steriel chirurgisch gebied door voor te stellen, schrobbend, en draperend het chirurgische gebied met inbegrip van zowel buik als dorsale aspecten van het been. Don steriele handschoenen.
8. Maak een 3 cm huid incisie in de lies holte met behulp van scalpel mes #15 en weerspiegelen de lies Fat pad lateraal gebruik van Iris schaar.
9. Bloot de gemeenschappelijke femorale vaten en plaats een draad haak met een elastische band om de buikspieren te trekken.
10. Met behulp van een ontleden Microscoop (40x), ontleden de pedicle proximaal van de opkomst van de gemeenschappelijke femorale vaartuigen onder de lies ligament en distally aan de samenvloeiing van popliteale schepen in het transplantaat.
11. Met behulp van microclips en bipolaire juweliers ' Tang, binden en verdeel de grote arteriële en veneuze takken, zoals laterale circumflex femorale schepen, oppervlakkige caudale epigastrische schepen, de Vena slagader, en proximale caudale femorale schepen, te mobiliseren de belangrijkste femorale vaten. Toeschroeien een kleine takken met behulp van fijne bipolaire Tang.
12. Maak een huid incisie van het centrum van de vorige huid gesneden langs de buikkant van de achterpoten, aan de enkel gebied, met behulp van Iris schaar.
13. Snijd de gracilis spier, evenals de andere adductor spieren eronder, in een verticale manier bloot te leggen en binden de mediale proximale genicular schepen, diepe vertakking kleine vaartuigen, en de heupzenuw.
    Opmerking: Op dit punt, op een aparte chirurgische tafel, de andere chirurg moet intubate en verdoven (2,5%-3% Isofluraan) de ontvangende dier; Dit laat de chirurgen om de ontvangende chirurgische site voor te bereiden op tijd voor het enten plaatsing en het minimaliseren van de transplantatie ischemische tijd.
14. Op de donordier, maken omtrek huid incisies op het niveau van de knie en enkel. Disarticuleren van de knie en enkel, verwijder vreemde spier-en weefsel, en maak een verticale huid incisie aan de dorsale kant van de achterpoten om de Graft vrij. Op dit punt, de Graft (samengesteld uit fibula en Tibia, bedekt met gerelateerde spieren en huid eiland gevoed door zijn perforators) is alleen verbonden door de pedicle.
15. Plaats kleine klemmen zo proximaal mogelijk op de femorale slagader en ader, en snijd de pedicle zo proximaal mogelijk, in de buurt van de lies ligament.
16. Om het transplantaat van het bloed te spoelen, injecteren heparinized Saline (30 U/mL) in de femorale slagader met behulp van een 27 G blozen botte bril.
    Opmerking: Verwijden de slagader voorafgaand aan de heparine flush zorgt voor een gemakkelijke toegang voor het inbrengen van de bril. Tijdens het spoelen, nauwlettend toezicht op de uitstroom van de femorale ader. Zodra heldere vloeistof verlaat de femorale ader, stop de flush.
17. Wikkel de geïsoleerde graft in warme zout-doorweekt gaas en het vervoer onmiddellijk naar de tafel van de ontvangende dier. Op dit moment moet de ontvangende chirurgische site al worden voorbereid op vasculaire anastomosis.
18. Na het enten oogst, onmiddellijk euthanaseren de donor rat via pneumothorax.

2. ontvanger transplantatie chirurgie

1. Na de sedatie inductie met behulp van verdampte Isofluraan toegepast via een kamer, diep verdoven het ontvangende dier via een ventilator-gecontroleerde endotracheale buis en 2,5%-3% Isofluraan.
   Opmerking: In dit stadium, de donor rat is nog steeds verdoofd.
2. Continu monitoren van de hartslag, ademhalingstarief, lichaamstemperatuur, en de diepte van de anesthesie van de ontvangende dier, met behulp van de teen pinch intrekking reflex test.
3. Met het oog op uitdroging en hypoglykemie te voorkomen, injecteren 2 mL van de oplossing van zogende beltoon en 2,5% dextrose onderhuids aan het begin en nog eens 2 mL aan het einde van de operatie.
4. Scheren de liesstreek, dan behandelen met ontharings room om de hoeveelheid fuzz achtergelaten door de Clippers te verminderen.
5. Draag een masker, een hoofddeksel, een wegwerp isolatie jurk, en steriele handschoenen.
6. Plaats het dier liggende op een verwarmingskussen. Toepassing oogheelkundige zalf om te voorkomen dat cornea schaafwonden tijdens de anesthesie. Produceer een steriel chirurgisch gebied door voor te stellen, schrobbend, en draperend het chirurgische gebied.
7. Maak een 3 cm huid incisie in de lies holte met behulp van scalpel mes #15 en weerspiegelen de lies Fat pad lateraal gebruik van Iris schaar.
8. Bloot de gemeenschappelijke femorale vaten en plaats een draad haak met een elastische band om de buikspieren te trekken.
9. Binden en verdelen Murphy takken.
10. Met behulp van 10-0 nylon onderbroken hechtingen, anastomose donor schepen aan de ontvangende schepen via veneuze end-to-side techniek en arteriële end-to-end techniek. Geleidelijk los van de klemmen van de slagader en vervolgens de ader. Monitor de anastomose sites voor bloeden en voeg extra hechtingen indien nodig.
11. Visueel beoordelen van de vasculaire anastomosis om effectieve enten reperfusie te verzekeren.
12. Inzet van de graft in de lies zak en oriënteer het ondersteboven, met de enkel gezamenlijke superieur en kniegewricht inferieur.
13. Met behulp van plooiende hechtingen, zet de Graft aan aangrenzende spieren. Sluit de huid via onderbroken horizontale matras huid absorbeerbare 4-0 hechtingen.
14. Verwijder het ontvangende dier uit de anesthesie en spenen het uit de ventilator. Plaats het dier op een verwarmingskussen voor thermische ondersteuning.
    Opmerking: De algemene verrichtingstijd is tussen 3 tot 4 h, afhankelijk van de ervaring en de kennis van de chirurg met de chirurgische procedure.
15. Beheren Meloxicam (1 mg/kg) onderhuids voor pijn onderdrukking en monitor tot het dier volledig is hersteld en mobiel.

3. VCA ontvanger monitoring

1. Huis de ontvanger ratten afzonderlijk en bewaken ze dagelijks voor klinische tekenen van pijn, uitdroging, gewichtsverlies, en verminderde activiteit in aanvulling op chirurgische storing (voor de eerste 48-72 h) of afwijzing. Te beheren Meloxicam onderhuids (1 mg/kg) dagelijks voor de eerste 3 dagen voor pijn onderdrukking.
2. Kies op basis van het eindpunt van het onderzoek een immunosuppressieve medicijn dat moet worden toegediend.

4. histologie

1. Onder ingeademde Isofluraan anesthesie (2,5%-3%), het verkrijgen van de seriële huid en de onderliggende spier Biopten van de donor Graft op de gewenste tijdpunten. De huid moet worden geschrobd en gedrapeerd voorafgaand aan het verkrijgen van een biopsie, en een steriele veld en techniek moet worden uitgevoerd.
2. Sluit de wond met een tot twee steken, met behulp van absorberende 4-0 hechtingen. Breng het dier naar zijn kooi en laat het terug te vorderen van de anesthesie.
3. Bevestig de biopsie weefsels in afzonderlijke buizen in 10% formaline.
4. Op de Terminal tijdpunt en onder ingeademde Isofluraan anesthesie (2,5%-3%), neem een grotere huid biopsie die overspant de donor/ontvanger grens. Zorgvuldig lokaliseren van het schip riem paar op de site van anastomoses; de juiste site zal zichtbaar zijn als gevolg van de hechtingen. Neem de gewenste vaartuig monsters van de slagader en/of ader. Bevestig alle monsters afzonderlijk in 10% formaline. Na inzameling van weefselsteekproeven, en terwijl het dier nog onder Isofluraan anesthesie is, onmiddellijk euthanaseren het dier via pneumothorax.
5. Met behulp van een tissue processor (of andere voorkeur inbedding techniek), paraffine-embed elke biopsie in zijn eigen blok. Voor de huid monsters, oriënteren het weefsel, zodat alle epidermale en dermale lagen kan worden gezien in een enkel segment. Voor vaartuig monsters, oriënteren de schepen, zodat dwarsdoorsneden kunnen worden verkregen.
6. Met behulp van een microtome, snijd 6 µm-dikke secties en breng ze op dia's voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
7. Vlek voor H & E met behulp van een standaardprotocol.
8. Verkrijg representatieve beelden van alle gewenste weefselmonsters met behulp van helderveld microscopie technieken.

Resultaten

De rat VCA heterotopic achterpoten osteomyocutaneous flap model zorgt voor lange termijn Allograft overleving onder immunosuppressie. Het model is betrouwbaar, reproduceerbaar en eenvoudig uit te voeren. De flap is goed verborgen in de liesstreek en vormt een minimale morbiditeit en ongemak voor het dier. De huid presentatie is een klinische manifestatie van de overleving en de afwijzing van de Allograft (Figuur 1). Het flap ontwerp zorgt voor een bruto klinisch toezicht en creëert een kans ...

Discussie

Bij de ontwikkeling van dit model van VCA, werden verschillende belangrijke kwesties in overweging genomen. Ten eerste was het belangrijk om intact bot (Tibia en fibula), beenmerg, en de huid in het transplantaat op te nemen. Terwijl de klinische hand transplantaties van volwassen donoren geen significante hoeveelheden van actief hematopoietische merg overdragen, zijn studies van de rol van het beenmerg niche beter gespiegeld met behulp van een intact, vasculaire bot in plaats van een cut lange bot, wat resulteert in fib...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparine Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA-licentie vereist
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	of 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50