Een convergerende strategie voor het genereren van een virtueel Gesequentieerde cDNA-Bibliotheek van niet-gerefereerde Pacifische oesters

Summary

We beschrijven een strategie voor het gebruik van RNA-monsters van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens en evalueren het genetische materiaal in vergelijking met openbaar beschikbare genoom gegevens om een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek te genereren.

Abstract

De toegang tot biologisch materiaal van referentie soorten, die voorheen werden gebruikt in belangrijke experimenten zoals bij de ontwikkeling van nieuwe cellijnen of genoom volgorde projecten, zijn vaak moeilijk te voorzien voor verdere studies of derden als gevolg van de het verbruik van de monsters. Hoewel de individuele Pacifische oester specimens nu op grote schaal over de Pacifische kusten van Azië, Australië en Noord-Amerika verdeeld zijn, zijn ze genetisch vrij divers en daarom niet direct geschikt als uitgangsmateriaal voor genbibliotheken. In dit artikel demonstreren we het gebruik van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens verkregen van regionale vismarkten om cDNA-bibliotheken te genereren. Deze bibliotheken werden vervolgens vergeleken met het publiek beschikbare oester genoom, en de dichtstbijzijnde gerelateerde bibliotheek werd geselecteerd met behulp van de mitochondriale referentie genen cytochroom C oxidase subeenheid I (COX1) en NADH dehydrogenase (ND). De geschiktheid van de gegenereerde cDNA-Bibliotheek wordt ook aangetoond door het klonen en de expressie van twee genen die de enzymen UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) coderen en UDP-xylose synthase (UXS), die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese van UDP-xylose van UDP-glucose.

Introduction

De overname van biologisch materiaal waarnaar wordt verwezen, kan een uitdaging zijn als gevolg van lange levertijden, ondernemende redenering of landspecifieke douanevoorschriften. Als alternatief kan het vereiste biologisch materiaal ook worden opgevangen uit fenotypisch identieke specimens. Deze monsters kunnen echter aanzienlijk variëren op het niveau van genotype, en daarom worden vergelijkingen met digitaal opgeslagen referentie-genoom van dezelfde soort vaak moeilijk of zelfs nutteloos als gevolg van onverenigbaarheid van het nieuw geproduceerde materiaal met bestaande DNA-versterkings methoden. Sequentiëren van sterk gecondengeerde genen van individuele monste....

Protocol

Opmerking: een schematisch overzicht wordt weergegeven in afbeelding 1.

1. monsterverzameling

1. Verkrijgen van oester preparaten. Houd oesters op ijs tijdens de Pluk periode, het transport en voorafgaand aan het laboratoriumgebruik en het proces binnen 4-7 dagen na aankoop.
   Opmerking: voor dit protocol werden oesters gekocht van Zhong Cai Wholesale Market in Nanjing (afkomstig uit Ningde, Fujian, China en Lianyungang, Jiangsu, China), Haijie Aquatic product Company in Qingdao (afkomstig uit Qingdao, Shandong, China), Jucheng Aquatic product Company in Yantai (afkomstig uit Yantai, Shandong, China) en....

Results

Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de beschreven bereidingswijze van de convergente cDNA Library, afgeleid van Pacific Oyster individuen. Figuur 2 toont de sequenties van de COX1 en ND genen van een verre verwant oester specimen met een hoge divergentie van de COX1 en ND gen sequenties van het referentiemateriaal. Figuur 3 toont de sequenties van de COX1 en ND genen van een nauw verwant oester specimen met een geringe dive.......

Discussion

Het gepresenteerde protocol maakt de genetische identificatie mogelijk van niet-gerefereerde oester specimens met soortgelijk fenotype van regionale vismarkten door vergelijking van de COX1-en ND-genen met een publiekelijk beschikbare oester-DNA-genoom-database. Het belang van deze methode ligt in zijn eenvoud, omdat er slechts één PCR-reactie nodig is voor de evaluatie van de virtuele cDNA-Bibliotheek. De twee geconjugeerde mitochondriale COX1 en ND-genen werden versterkt uit een cDNA-bibliotheek die werd gegenereerd do.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
1% Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	*Alternative distributors possible
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Alfa Aesar	490-79-9	*Alternative distributors possible
Acetonitrile	Merck	75-05-8	*Alternative distributors possible
Agarose for molecular biology	Biowest Chemicals	111860	*Alternative distributors possible
Ampicilin	Solarbio	69-52-3	*Alternative distributors possible
Chloroform	Lingfeng, Shanghai	67-66-3	*Alternative distributors possible
DEPC water	Thermo Scientific	R0601
Ethanol	Jinhuada, Guangzhou	64-17-5	*Alternative distributors possible
Guanidinium thiocyanate-phenol reagent	Invitrogen	15596018	TRIzol reagent
Imidazole	Energy Chemical	288-32-4	*Alternative distributors possible
Isopropyl alcohol	Nanjing Chemical Reagent	67-63-0	*Alternative distributors possible
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside	Solarbio	367-93-1	*Alternative distributors possible
Kanamycin	Solarbio	25389-94-0	*Alternative distributors possible
LB Agar	Thermo Fisher	22700025	*Alternative distributors possible
LB Broth	Thermo Fisher	10855021	*Alternative distributors possible
Methanol	Jinhuada, Guangzhou	67-56-1	*Alternative distributors possible
MgCl2 hexahydrate	Xilong Huagong	7791-18-6	*Alternative distributors possible
NaCl	Xilong Huagong	7647-14-5	*Alternative distributors possible
NAD+	Duly Biotech	53-84-9	*Alternative distributors possible
Phenyl-methylsulfonyl fluoride	Macklin	329-98-6	*Alternative distributors possible
Tris	Solarbio	77-86-1	*Alternative distributors possible
UDP-glucose	Wuhu Nuowei Chemicals	28053-08-9	*Alternative distributors possible
UDP-glucuronic acid	SIGMA	63700-19-6	*Alternative distributors possible
Tools/Instruments:
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex	*Alternative distributors possible
Metal block heater	Long Yang Scientific Instruments	Thermoshaker HB20	*Alternative distributors possible
PCR thermocycler	Hema	9600	*Alternative distributors possible
Enzyme and Kits:
10×Ligation buffer	Thermo Scientific	B69	*Alternative distributors possible
5×PrimeSTAR buffer	Takara	9158A
Alkaline phosphatase	ThermoFisher FastAP	EF0654	*Alternative distributors possible
COX forward primer	Genscript	ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX reverse primer	Genscript	ACTTGACCAAAAACATAAGACATG
Cutsmart Buffer	NEB	B7204S	*Alternative distributors possible
dNTP mix	Invitrogen	18427088
MgUGD forward primer	Genscript	ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD reverse primer	Genscript	ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG
MgUXS forward primer	Genscript	CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC
MgUXS reverse primer	Genscript	ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND forward primer	Genscript	ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT
ND reverse primer	Genscript	ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR Cleanup Kit	AxyGen	AP-PCR-250	*Alternative distributors possible
pET-30a(+) vector	Merck Millipore	69909