Gerichte studies met behulp van seriële blokkering en gerichte ionen straal scan elektronenmicroscopie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het efficiënt combineren van seriële Block face en gerichte Ion Beam Scanning elektronenmicroscopie om een interessegebied te targeten. Dit maakt efficiënt zoeken mogelijk, in drie dimensies, en het lokaliseren van zeldzame gebeurtenissen in een groot gezichtsveld.

Samenvatting

Dit protocol zorgt voor een efficiënte en effectieve beeldvorming van cel-of weefselmonsters in drie dimensies op het resolutie niveau van elektronenmicroscopie. Voor vele jaren is Elektron microscopie (EM) een inherent tweedimensionale techniek gebleven. Met de komst van seriële scanning elektronen microscoop beeldvormingstechnieken (volume EM), met behulp van ofwel een geïntegreerde microtoom of gerichte Ion Beam te snijden vervolgens weergave ingesloten weefsels, de derde dimensie wordt gemakkelijk toegankelijk. Seriële blok gezicht Scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) maakt gebruik van een ultramicrotome ingesloten in de SEM kamer. Het heeft de mogelijkheid om grote specimens (1.000 μm x 1.000 μm) te hanteren en grote beeld velden te bekijken bij kleine X-, Y-pixelgrootte, maar is beperkt in de Z-dimensie door het diamantmes. Gerichte Ion Beam SEM (FIB-SEM) is niet beperkt in 3D-resolutie, (isotrope voxels van ≤ 5 nm zijn haalbaar), maar het gezichtsveld is veel beperkter. Dit protocol demonstreert een workflow voor het combineren van de twee technieken om individuele interessegebieden (ROIs) in een groot veld te vinden en vervolgens het daaropvolgende gerichte volume te Imaging bij hoge isotrope Voxel-resolutie. Het voorbereiden van vaste cellen of weefsels is veeleisender voor volume EM-technieken vanwege het extra contrast dat nodig is voor een efficiënte signaal generatie in SEM-beeldvorming. Dergelijke protocollen zijn tijdrovend en arbeidsintensief. Dit protocol omvat ook de verwerking van microgolf-geassisteerde weefsels die de penetratie van reagentia vergemakkelijkt, waardoor de tijd die nodig is voor het verwerkings Protocol van dagen tot uren afneemt.

Inleiding

Dit protocol beschrijft een workflow voor de efficiënte targeting van drie-dimensionale elektronenmicroscopie (EM) met hoge resolutie en een specifieke regio van belang (ROI). Sinds het begin in de jaren 1930 is EM een in wezen tweedimensionale techniek geweest. De eerste gepubliceerde beelden waren van hele weefsels of cellen, maar dat gaf snel plaats aan secties die met de hand werden gesneden met behulp van een ultramicrotome en afbeelding gemaakt met behulp van een transmissie-elektronen microscoop (TEM). TEM produceert micro grafieken met zeer hoge resolutie, waarbij zelfs de kleinste cellulaire structuren duidelijk kunnen worden onderscheiden. Echter, de dunheid van de sectie die nodig is voor het weefsel te worden afbeelding gemaakt door de elektronenstraal maakte informatie in de Z-dimensie minimaal. Omdat cellen driedimensionale structuren zijn, moesten interacties tussen celstructuren en celoppervlakken worden afgeleid uit beperkte gegevens. Dit bracht het potentieel voor verkeerde interpretatie naar voren, vooral in structuren die complex waren. Sommige microscopisten slaagden erin om nauwkeurigere 3D-structuren te verkrijgen door seriële-snij cellen en weefsels en ze vervolgens nauwgezet te reconstrueren van individuele TEM-afbeeldingen¹. Dit was een zeer arbeidsintensieve proces en vóór de opkomst van digitale beeldvorming en computer rendering waren de resultaten ook moeilijk te visualiseren. In de afgelopen jaren zijn er twee technieken geïntroduceerd die collectief bekend zijn geworden als volume elektronenmicroscopie (volume EM)² die em in drie dimensies toegankelijk hebben gemaakt voor meer laboratoria.

Het idee om een stapel beelden van een ingebed blok in een elektronen microscoop te verkrijgen, kan worden teruggevoerd naar 1981 toen Steve Leighton en Alan Kuzirian een miniatuur microtoom bouwden en het in de kamer van een scanning elektronen microscoop³ (SBF-SEM) plaatsten . Dit prototype werd uiteindelijk 23 jaar later gekopieerd en verbeterd door denk en Horstmann⁴ en vervolgens gecommercialiseerd. Op ongeveer dezelfde tijd werden biologische wetenschappers zich bewust van een andere technologie die voornamelijk werd gebruikt in de materiaalwetenschap, de gerichte ionen straal. Deze techniek maakt gebruik van een ionen straal van een of andere soort (gallium, plasma) om een zeer kleine hoeveelheid Oppervlaktemateriaal uit een monster (FIB-SEM)⁵te verwijderen. Beide technieken gebruiken snijden, gevolgd door beeldvorming die een reeks afbeeldingen biedt die kunnen worden gecombineerd in een X, Y, Z, stack. Beide technieken bieden 3D-informatie, maar op verschillende resolutie schalen. SBF-SEM wordt beperkt door de fysische eigenschappen van het diamantmes tot segmenten die niet dunner zijn dan 50 nm voor lange seriële beeldvormings runs; de steekproef blokgrootte die kan worden verdeeld is echter groot, tot 1 mm x 1 mm x 1 mm. door het grote digitale acquisitie formaat van de achterzijde verspreide elektron detector (32k x 32k pixels) die een signaal van het blok gezicht ontvangt , kunnen beeld pixel groottes zo klein zijn als 1 nm. Dit resulteert in niet-isotrope voxels waarbij de X-, Y-afmeting vaak kleiner is dan de Z. Vanwege de precisie van de ionen straal heeft FIB-SEM de mogelijkheid om beelden te verzamelen met isotrope voxels ≤ 5 nm. Echter, de totale oppervlakte die kan worden afbeelding gemaakt is vrij klein. Een overzichtstabel met verschillende voorbeelden en volumes die met de twee technieken zijn afgebeeld, is eerder gepubliceerd³.

Weefsel voorbereiding voor volume EM is moeilijker dan voor standaard TEM of SEM, omdat monsters moeten worden gekleurd om adequate signaal vorming in de SEM te bieden. vaak moeten de kleuringen niet alleen worden geoptimaliseerd voor het specifieke weefseltype, maar ook voor het toevoegen van contrast met bepaalde cellulaire structuren om identificatie en reconstructie gemakkelijker te maken. Het protocol dat hier wordt gebruikt, is gebaseerd op de NCMIR-norm⁶. Extra kleuring betekent meestal extra protocol stappen. Dus voor volume EM moeten standaardprotocollen worden uitgebreid om voldoende tijd te hebben voor het binnendringen van reagentia in het monster. Door de magnetron ondersteunde verwerking kan de tijd die nodig is voor kleuring van uren tot minuten verminderen en maakt volume EM monstervoorbereiding efficiënter⁷. Deze methode is van toepassing op alle cel-en weefsel typen⁸ en op onderzoeksvragen waarbij de inhomogeniteit van het weefsel bemonstering van een specifiek gebied noodzakelijk maakt⁹.

Zodra een Data stack wordt verkregen kan het worden uitgelijnd en de structuren van belang gesegmenteerd uit de rest van de gegevens en gemodelleerd in 3D. Hoewel de automatisering van beeldvorming veel segmenten van weefsel heeft gemaakt beeld verwerving relatief eenvoudig, het proces van het digitaal reconstrueren en visualiseren van de gegevens is een tijdrovende taak. Software voor dit doel is nog niet geïntegreerd of volledig geautomatiseerd. Omdat veel van het vroege werk met behulp van volume EM gericht was op de neurowetenschappen, zijn de technieken voor het vlekken en digitaal segmenteren van structuren zoals axonen vrij ver gevorderd in vergelijking met andere cellen en organellen. Terwijl de literatuur op andere niet-neuronale weefsels snel groeit, niet-lineaire of onregelmatige structuren vereisen meer handmatige invoer.

Het gebruik van zowel SBF-SEM als FIB-SEM is een nuttige benadering voor targeting en imaging specifieke, niet-homogene weefselstructuren met hoge resolutie in 3D. Combineren dat met microgolf geassisteerde weefsel verwerking die sterk vermindert de tijd die nodig is voor monstervoorbereiding. Samen maakt deze workflow het genereren van hoge-resolutie isotrope Voxel beeld sets van fijne constructies een efficiënt en sneller proces.

Protocol

1. monster fixatie en-verwerking voor elektronenmicroscopie

1. Fixeer zaailingen van Arabidopsis thaliana geteeld op agar-platen in 0,5% Paraformaldehyde, 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) pH 6,8 voor 2 uur bij kamertemperatuur (RT).
   VOORZICHTIGHEID: aldehyden zijn irriterende en corrosieve en hebben een carcinogeen, mutageen en teratogeen potentieel. Alle oplossingen moeten worden behandeld met passende beschermende uitrusting en in een rook afzuigkap.
2. Snijd wortel uiteinden van de plant geteeld in stap 1,1 en zet 2-3 tips in 0,5 mL buisjes met dezelfde fixeermiddel 's nachts bij 4 °C.
   Opmerking: het volume van deze en eventuele oplossingen in de resterende stappen wordt bepaald door het monstervolume; een minimale verhouding van het monster tot de oplossing is 10:1. Monsters die groter zijn dan 1 mm in elke afmeting zullen moeilijk te vlekken zijn, dus het werken met grotere weefsel blokken is moeilijker. Niet alle weefsels hebben dezelfde kenmerken; bijvoorbeeld, planten bladeren en stengels kunnen moeilijk te vlekken zijn. Als grotere monsters of moeilijke weefsel typen gewenst zijn, moet optimalisatie van de monsterverwerking worden uitgevoerd voordat u doorgaat met het verzamelen van gegevens.
3. Bereid de thiocarbohydrazide (TCH) oplossing, vers en beschikbaar voor stap 1,7. Voeg 0,1 g thiocarbohydrazide toe aan 10 mL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) en los op door te verwarmen tot 60 °c in de oven gedurende 1 uur. Voor gebruik, filter TCH oplossing met behulp van een 0,22 μm spuit filter.
4. Verwijder fixeer van de buizen en vervang met 0,1 M PB pH 6,8. Zet de buizen op een orbitale schudtafel bij 100 rpm en was 10 min. Herhaal het wassen met verse PBS 5 keer.
5. Post Bevestig de wortel tips door PB te vervangen door 2% osmium tetroxide (OsO₄) en 0,2% ruthenium rood in 0,1 M PB pH 6,8. Zet de buisjes in de magnetron met de deksels open en startprogramma 9 (tabel 1).
   Let op: osmium is zeer gevaarlijk in geval van inname, zeer gevaarlijk in geval van inademing, en gevaarlijk in geval van aanraking met de huid. Altijd hanteren van de juiste beschermende uitrusting en in een rook afzuigkap.
   Opmerking: gedurende het gehele protocol zijn de deksels van de buizen altijd open tijdens de stappen van de magnetron.
6. Was de wortel uiteinden tweemaal met ddH₂O voor 5 min elk op de tafel. Voor het derde en vierde ddH₂O was gebruik programma 15 op de magnetron (tabel 1). Na de eerste 40 tweede ddH₂o wassen, neem monsters uit de magnetron en vervang de buffer met verse DDH₂o. zet samples terug in de magnetron en ga verder met het programma.
   Opmerking: de magnetron zal een alarm klinken wanneer de buffer moet worden vernieuwd. Zorg ervoor dat het deksel van de vacuümkamer elke keer correct wordt vervangen.
7. Inbroed monsters in eerder bereide TCH oplossing bij RT gedurende 2 minuten op de Bank en voor verdere incubatie gebruik het microgolf programma 8 (tabel 1). Verander de oplossing niet tussen Bank en magnetron.
8. Was de monsters zoals beschreven in stap 1,6.
9. Plaats monsters in 1% OsO₄ in DDH₂O voor microgolf programma 9 (tabel 1).
10. Was de monsters zoals beschreven in stap 1,6.
11. Inbroed monsters in 1% ammoniumuranylcarbonaat acetaat in ddH₂O met behulp van microgolf programma 16 (tabel 1).
    Let op: uranyl acetaat is giftig, een irriterend en heeft een carcinogeen, mutageen en teratogeen potentieel. Altijd hanteren van de juiste beschermende uitrusting.
12. Was de monsters zoals beschreven in stap 1,6.
13. Maak de lead oplossing van Walton voor gebruik in stap 1,14. Maak eerst een stamoplossing van L-Aspartic acid door toe te voegen 0,998 g van L-Aspartic acid 250 mL ddH₂O en de pH aanpassen aan 3,8 met 1 M Koh. Los vervolgens 0,066 g lood nitraat op in 10 mL L-Aspartic acid Stock Solution en pas de pH aan op 5,5. Laat de oplossing gedurende 30 minuten in de oven bij 60 °C.
    Opmerking: er mogen geen precipitaten vormen.
14. Inincuberen monsters in de lood oplossing van Walton gedurende 30 minuten in de oven bij 60 °C.
15. Was de monsters zoals beschreven in stap 1,6.
16. Dehydraat monsters in EtOH in gesorteerde stappen van 50%, 70%, 90% in ddH₂O, en vervolgens 2x in 100% Etoh. Gebruik microgolf programma 10 (tabel 1) en de magnetron zal gebruikers elke 40 s vragen om de oplossing te vervangen door de volgende EtOH-stap. Dit is de laatste stap gedaan in de magnetron.
17. Verder dehydraat in 100% propyleenoxide 2x voor 10 min elk bij RT op de Bank, waarbij de oplossing tussen de stappen wordt vervangen.
    Opmerking: propyleenoxide kan sommige plastics oplossen, zoals poly styrenes; Gebruik glazen flesjes voor deze stap of pre-test plastics voor weerstand.
    Let op: Propyleenoxide is zeer licht ontvlambaar. Altijd hanteren van de juiste beschermende uitrusting en in een rook afzuigkap.
18. Start infiltratie van wortel uiteinden door in 50% van Spurr's hars in propyleenoxide (min 2 h) te bebroed.
    Let op: de hars componenten van Spurr zijn irriterende stoffen. Altijd hanteren van de juiste beschermende uitrusting en in een rook afzuigkap.
19. Vervang oplossing met 100% Spurr's en laat 's nachts op RT.
20. Verandering in vers 100% Spurr's Resin 2 keer (min 2 h incubaties).
21. Plaats monsters in een insluitings mal, opnieuw met verse 100% Spurr's hars en polymeriseren in een oven bij 65 °C gedurende 36 − 48 uur.
    Opmerking: de gebruikte insluitings mal is afhankelijk van het type weefsel en de benadering die wordt gebruikt voorbeeld vorming. Hier werd een platte siliconen insluitings mal gebruikt (Figuur 1a).

2. bereid ingesloten voorbeelden voor Imaging

1. Verwijder de monsters uit de oven, verwijder hars uit de insluitings mal (Figuur 1b).
2. Gebruik een scheermesje om het monster ruwweg te trimmen tot een blok van maximaal 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm (figuur 1c).
   Opmerking: om het opladen in SBF-SEM te voorkomen, is het belangrijk om zoveel mogelijk kale hars weg te knippen en het monster zo plat/dun mogelijk te maken. Idealiter bevatten alle zijden van het blok al weefsel, maar vooral de zijkant die aan de metalen pen zal worden bevestigd (zie stap 2,3) moet blootgestelde weefsel bevatten zodat het weefsel in direct contact staat met het geleidende metaal.
3. Verwijder het monster uit de vreemde hars en bevestig het aan een metalen pen (figuur 1d) met geleidende epoxy hars, zodat een deel van het weefsel de metalen pen raakt. Laat de epoxy in de oven 's nachts op 65 °C genezen.
   Opmerking: Zorg ervoor dat het monster in het midden van de PIN is geplaatst, omdat de beweging van het podium in de SB-SEM beperkt is. Het verwijderen van het zeer kleine hars omhuld monster van extra hars kan moeilijk zijn, omdat het kleine monster de neiging heeft om weg te vliegen wanneer het loskomt. Een eenvoudige en doeltreffende oplossing hiervoor is om het monster te bedekken met een vel paraffinefolie zoals weergegeven in de aanvullende film van referentie¹.
4. Bevestig de drager in de houder voor de ultramicrotome. Gebruik een scheermesje om overtollige epoxy te verwijderen en gebruik de ultramicrotome en een diamant mes om het gezicht en de zijkanten van het blok glad te maken, waardoor een piramide ontstaat. Zorg ervoor dat ten minste een deel van het weefsel al op het blok gezicht is blootgesteld.
   Opmerking: de extra stap van het gebruik van een diamantmes is optioneel, maar het maakt het resulterende blok gemakkelijker te benaderen in de SBF-SEM omdat de schaduw van het mes op het blok gezicht duidelijker is, waardoor het schatten van de afstand tussen mes en blok gezicht gemakkelijker te bepalen is.
5. Plaats het getrimde monster blok in de sputteren coater en mantel het monster met een dunne laag (2 − 5 nm) Platina (PT).
   Opmerking: de platina op het blok-gezicht wordt weggesneden tijdens de aanpak in de SBF-SEM (zie hieronder), maar de platina aan de zijkanten van de piramide zorgt voor extra geleiding. In dit voorbeeld werd het monster gecoat met platina, maar Gold, of Gold/Palladium is ook effectief; echter, coating met goud resulteerde in meer puin op de blok-gezicht tijdens een Imaging run.

3. beeldvorming in de SBF-SEM

1. Plaats de drager in de SBF-SEM Microscoop en breng het mes dicht bij het monster oppervlak. Met behulp van het diamantmes trim van het bovenste gedeelte van het monster, zodat de PT-laag al is verwijderd en ten minste een deel van het weefsel wordt blootgesteld.
   Opmerking: aangezien dit proces voor elke SBF-SEM Microscoop verschillend is, wordt hier niet elke stap gespecificeerd. Zolang het monster oppervlak vrij is van PT en klaar is voorbeeld vorming, zullen de volgende stappen mogelijk zijn.
2. Start Imaging met lage resolutie en korte verblijfs tijden om een overzicht van het monster te krijgen en een interessegebied te lokaliseren (Figuur 1e).
   Opmerking: hier, 512 x 512 pixels en 1 μs dwelltijd werden gebruikt voor het snel scannen en positioneren van het podium en 2.000 x 2.000 pixels met 1 μs dwelltijd werden gebruikt voor het optimaliseren van het Imaging venster en het aanpassen van de focus.
3. Gebruik een versnelde spanning van 1,5-2,0 kV bij een stroom van 80 − 100 pA, leg een beeld van het weefsel vast.
   Opmerking: het getoonde voorbeeld werd afgebeeld op een hoog vacuümsysteem waar de straalstroom moet worden aangepast om het opladen te minimaliseren, wat zeer monster afhankelijk is. Meestal is de elektronenstraal ingesteld op 1.5 − 2,0 kV, maar dit zal monster afhankelijk zijn. Bij hogere vergroting (meestal > 10.000 x) wordt de hars te veel beïnvloed door de straal om een soepele snede te garanderen, dus meestal is de pixelgrootte ingesteld op 8 − 20 Nm bij een beeldformaat van 8000 − 10000 x 8000 − 10000 pixels met een overeenkomstige vergroting van 430 – 1, 400x en veld grootten van respectievelijk 64 X 64 mm en 200 x 200 mm.
4. Bepaal een regio van belang en bepaal hoeveel secties nodig zijn om het volume van belang te dekken en start de Imaging run, met behulp van de achterste verspreide elektron detector.
   Opmerking: in het hier gepresenteerde voorbeeld werden 500 secties van 80 nm afgebeeld op 10 nm pixels en 10.000 x 10.000 pixel afbeeldingen (dwelltijd 1 μs). De Microscoop werd ingesteld op 1,6 kV en 100 pA. In het algemeen is het aantal secties afhankelijk van het monster en de grootte van de ROI en kan variëren van 100 s tot 1.000 s van opeenvolgende secties. De resulterende gegevensset bestaat uit enkele afbeeldingen van elke sectie. Deze afbeeldingen moeten worden geconverteerd naar een 3D-stack.

4. gegevensverwerking door SBF-SEM

1. Gebruik Fiji, Selecteer File-Import-Image sequence en zoek de afbeeldings stack om de afbeeldingen te laden. Controleer, afhankelijk van de grootte van de gegevensset, het vak ' virtuele stack gebruiken '.
   Notes: als de gegevensset echt groot is, converteert u deze eerst naar 8-bits (indien verzameld op 16-bits) en indien nodig de gegevens bin totdat deze een bruikbare grootte heeft.
2. Met de knop afspelen onder aan de afbeelding bladert u door de gegevensset om te zien of de uitvoering van de Imaging is gelukt. Controleer op typische beeldvormings artefacten voor SBF-SEM, zoals secties die van het mes vallen op het blok gezicht, het laden in gebieden van kale hars, het snijden van artefacten van het mes (horizontale lijnen op de afbeelding).
3. Met behulp van de opdracht afbeelding-eigenschappen aanpassen van de pixelgrootte en Voxel diepte (dat wil zeggen, sectie-dikte) gebruikt tijdens de uitvoering. Als de gegevens al binned zijn, neem dan hier rekening mee.
4. Met behulp van de opdracht plugins-registratie-lineaire stack uitlijning met SIFT om de gegevens te registreren.
   Opmerking: de registratie van SBF-SEM-gegevens is nodig omdat er tijdens de beeldvorming een lichte beweging van het monster mogelijk is vanwege het opladen of de drift van het monster. Aangezien dit slechts een minimale beweging in XY is, is alleen vertaling nodig.
5. Controleer de uitlijning door door de gegevensset te scrollen en als OK de opdracht opslaan in het menu bestand gebruikt om de uitgelijnde gegevensset op te slaan als een 3D-TIF-bestand.
6. Analyseer de gegevensset zorgvuldig om te zien of de ROI is opgenomen en bevat de informatie die nodig is voor de biologische vraag. Op de laatste afbeelding van de stack (= de huidige blok-face), selecteert u een nieuwe ROI voor FIB-SEM Imaging.
   Opmerking: als er geen goede regio voor FIB-SEM Imaging aanwezig op de huidige blok-gezicht, meer secties kunnen worden afgesneden van het blok (die nog steeds in de SBF-SEM) totdat een ROI wordt weergegeven. Er is een limiet aan het volume dat kan worden afgebeeld met de FIB. De ROI op het SBF-SEM-beeld kan maximaal zijn in X, Y van 30-40 μm X 15-20 μm.

5. beeldvorming in de FIB-SEM

1. Neem overzichts beelden van het monster in de SBF-SEM, idealiter met inbegrip van een of meer randen van het monster die vervolgens herkenbaar zijn in de FIB-SEM (Figuur 2a, C).
   Opmerking: in dit voorbeeld zijn de SBF-SEM-overzichts afbeeldingen genomen op 10 nm pixelgrootte, 8.000 x 8.000 pixels bij 1 μs dwelltijd. De Microscoop was nog steeds ingesteld op 1,6 kV en 100 pA.
2. Verwijder het monster uit de SBF-SEM en plaats in de sputteren coater. Mantel het monster met ≥ 20 nm platina voor FIB-SEM-beeldvorming.
3. Steek monster in FIB-SEM en gebruik secundaire elektronen detector bij 15 kV, 1 nA Lokaliseer de ROI geïdentificeerd in de SBF-SEM op het blok gezicht (Figuur 2b, D).
   Opmerking: beeldvorming bij 15 kV is noodzakelijk om te zien door de platina coating.
4. Breng de ROI op het monster in het toeval punt van de FIB-en SEM-balken, door het podium te bewegen en te kantelen (Figuur 3a).
   Opmerking: de FIB-kolom wordt meestal onder een hoek gemonteerd (Figuur 3a). Dit betekent dat elk monster zodanig moet worden gekanteld dat het oppervlak dat wordt gefotografeerd en verdeeld parallel aan de FIB-balk wordt geplaatst. Het oppervlak dat wordt afgebeeld wordt nu gekanteld met betrekking tot de SEM-straal en een sleuf van weefsel moet worden verwijderd voordat de SEM in staat is om de ROI te beeld (Figuur 3E)
5. Met behulp van de FIB Beam en gas injectiesysteem, deponeren een 1 mm beschermende laag platina op het oppervlak boven de ROI (figuur 3c). Vervolgens, met behulp van een lage frees stroom (50-100 pA), molen fijne lijnen in de platina depositie voor autofocus en 3D-tracking tijdens de Imaging run (figuur 3D). Gebruik de FIB-kolom en de koolstof gasinjector om deze lijnen te bedekken met koolstof depositie.
   Opmerking: de grootte van de ROI komt hier overeen met de grootte van de ROI op het SBF-SEM-beeld en de maximale grootte kan dus 30-40 μm x 15-20 μm zijn. In dit voorbeeld werd een ROI van 17 μm x 8 μm imaged. Koolstof depositie is nodig voor de bescherming van de lijnen en het creëren van een zwart-wit contrast tussen de koolstof en platina die ideaal is voor autofocus. De voor elke stap gebruikte frees stromen zijn te vinden in tabel 2.
6. Met behulp van een hoge frees stroom, molen een sleuf van 30 μm voor de ROI, het creëren van het beeldoppervlak voor de SEM Beam (figuur 3e).
   Opmerking: de FIB Beam is inherent destructief, nog meer bij hoge stromingen. Zorg ervoor dat beeldvorming bij hoge stromen tot een minimum en beeld bij lage vergroting en snelle scansnelheden om te voorkomen dat het smelten van de hars op de ROI.
7. Glad het beeldoppervlak met een frees stroom dichter bij de stroom die wordt gebruikt tijdens de Imaging run. Stop met polijsten wanneer alle autofocus-en 3D-tracking markeringen duidelijk zichtbaar zijn op het Imaging-oppervlak (figuur 3F). De voortgang van de FIB kan worden gevolgd door het oppervlak met de EM (met behulp van een achterste verspreide elektron detector) te beeldvorming tijdens het polijsten.
8. Bepaal het gebied dat op het nieuw gecreëerde oppervlak moet worden afgebeeld en stel de imaging parameters in. Zorg ervoor dat de elektronenstraal is gericht op het oppervlak, Stel helderheid en contrast in en stel de pixelgrootte en de sectie dikte in. Houd de beeldvormings tijd onder de 1 minuut door de dwelltijd en het regel gemiddelde aan te passen.
   Opmerking: het is belangrijk om een lage spanning te gebruiken voorbeeld vorming met de elektronenstraal om ervoor te zorgen dat alleen het oppervlak van het blok wordt afgebeeld (d.w.z. dat er geen elektronen van dieper in het monster worden afgebeeld). Dit wordt gedaan door het houden van de spanning onder de 2 kV en het gebruik van een terug verspreide elektron detector met een grid voltage, waardoor alleen hoge energie-elektronen worden afgebeeld. In dit voorbeeld werd de elektronenstraal ingesteld op 1,5 kV en 1 nA met een netspanning van 1,2 kV op de rug verspreide elektron detector. Ook hier werd een pixelgrootte van 5 nm gebruikt met 5nm-secties om te resulteren in een gegevensset met isotrope voxels. Een oppervlakte van 17 μm x 10 μm werd afgebeeld op 6,5 μs dwelltijd en een lijn gemiddelde van 1,0.
9. Stel de Vensters in voor automatisch afstemmen en 3D-tracking, met dezelfde pixelgrootte, dwelltijd en regel gemiddelde als gebruikt voor de Imaging.
   Opmerking: dit proces zal verschillen voor verschillende systemen, dus alleen de stap wordt vermeld zonder de verschillende acties op te geven.
10. Start de Imaging run en bewaak de stabiliteit van het proces tijdens de eerste 50 − 100 secties. Zodra het systeem soepel loopt, verlaat u de kamer en zorgt u ervoor dat er zo weinig mogelijk overlast is voor de kamer.
    Opmerking: de duur van de uitvoering en het aantal secties is afhankelijk van de grootte van de ROI en de sectie dikte. In FIB-SEM is de Z-as eigenlijk de hoogte van de ROI-box op het SBF-SEM-beeld (max. 15 − 20 μm; Figuur 3e).
11. Registreer de FIB-SEM-gegevens op dezelfde manier als hierboven beschreven voor de SBF-SEM-gegevens.

Resultaten

Afbeeldingen uit de SBF-SEM bieden een overzicht van het weefsel, wat inzicht geeft in de ruimtelijke oriëntatie van cellen en intercellulaire verbindingen (figuur 4a). De daaropvolgende FIB-SEM-beeldvorming op een nieuwe regio, die gewoonlijk een regio van belang is, bepaald na inspectie van de SBF-SEM-uitvoering, voegt Details van specifieke cellen en/of structuren met een hoge resolutie toe (figuur 4b).

Figuur 4c , D toont het verschil in weergave van de niet-isotrope voxels van de SBF-SEM-gegevens (figuur 4c) en de ISOTROPE Voxel FIB-SEM-gegevens (figuur 4D). De z-dikte die wordt gebruikt in SBF-SEM betekent dat de weergave duidelijk de secties weergeeft, wat resulteert in een ' trap-effect ' op het oppervlak. In de FIB-SEM-gegevens zorgen de 5 nm-secties ervoor dat de weergave veel soepeler lijkt en dat afzonderlijke secties volledig in het oppervlak overvloeien.

Figuur 1: creatie van het blok gezicht van een hars ingesloten monster. A) eenwortel punt ingebed in hars. (B) met behulp van een scheermesje wordt de overtollige hars weggesneden tot een blok van 0,5 mm² resten. (C, D) Het geknipte blok wordt op een metalen pen gelijmd en na een nacht in de oven worden de zijkanten van het blok bijgesneden en wordt het oppervlak glad gemaakt met een diamant mes met behulp van een ultramicrotome. E) in de SBF-SEM is het monster zodanig georiënteerd dat de blockface en ROI kunnen worden herkend, schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: correlatie tussen SBF-SEM en FIB-SEM. Overzichts beelden van de Block-face met behulp van de SBF-SEM (a) en de FIB-SEM (B), schaalbalk = 5 μm. (C, D) zoom in op de ROI. Rode doos afbakenen de regio om te worden afgebeeld met FIB-SEM, schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: FIB-SEM-regeling en voorbereidingsstappen. A) regeling die de oriëntatie van de FIB-balk, SEM-straal en monster weergeeft. Het monster moet worden gepositioneerd op het toeval punt van de FIB-en SEM-balken om te kunnen frezen en beeld in dezelfde regio. B) Schematische tekening van de sleuf die nodig is voor SEM-beeldvorming van de door het FIB verwijderde delen. (C) beeld genomen met de FIB Beam met platina depositie op de ROI, schaalbalk 5 μm. (D) beeld genomen met de FIB Beam met de lijnen die worden gebruikt voor autofocus en 3D-tracking. De lijnen in het midden worden gebruikt voor autofocus en de buitenlijnen zorgen voor 3D-tracking. Koolstof depositie bovenop de lijnen biedt het benodigde contrast (platina VS Carbon) om deze taken uit te voeren, schaalbalk 5 μm. (E) beeld genomen met de FIB Beam na het frezen van de sleuf, schaalbalk 5 μm. (F) beeld genomen met de SEM-straal die de regio van belang afbeelding gemaakt tijdens de FIB-SEM run, Scale Bar 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: SBF-SEM en FIB-SEM resultaten voor en na segmentatie. (A) 3D-weergave van SBF-SEM-gegevensset (100 x 100 x 40 μm, schaalbalk = 10 μm), (B) 3D-weergave van FIB-SEM-gegevensset (17 x 10 x 5,4 μm, schaalbalk = 2 μm), (C) gerenderde VACUOLEN GESEGMENTEERD uit SBF-SEM-gegevens per drempel, schaalbalk = 2 μm D. gerenderde korrels Seg van FIB-SEM gegevens door Thresholding, schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol voor microgolf verwerking
Programma #	Beschrijving	Gebruikers prompt (aan/uit)	Tijd (uur: min: SEC)	Vermogen (watt)	Temperatuur (°C)	Laad koeler (uit/automatisch/aan)	Vacuüm/bubbler pomp (uit/bubb/VAC Cycle/VAC on/VAP)	Steady Temp
								Pomp (aan/uit)	Temperatuur (°C)
8	TCH	Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
9	Osmium	Uit	0:02:00	100	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:02:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:02:00	100	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:02:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:02:00	100	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
10	50% EtOH	Op	0:00:40	150	50	Uit	Uit	Op	30
	70% EtOH	Op	0:00:40	150	50	Uit	Uit	Op	30
	90% EtOH	Op	0:00:40	150	50	Uit	Uit	Op	30
	100% EtOH	Op	0:00:40	150	50	Uit	Uit	Op	30
	100% EtOH	Op	0:00:40	150	50	Uit	Uit	Op	30
15	0.1 M CACODYLATE	Op	0:00:40	250	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
	0.1 M CACODYLATE	Op	0:00:40	250	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
15	ddH2O	Op	0:00:40	250	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
	ddH2O	Op	0:00:40	250	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
16	Uranyl acetaat	Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	0	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30
		Uit	0:01:00	150	50	Uit	VACUÜMCYCLUS	Op	30

Tabel 1. Gedetailleerd protocol voor microgolf verwerking.

Stap	Huidige	Geschatte tijd
Depositie platina	3n A	10-15 minuten
Auto Tune-en tracking markeringen frezen	50-100 pA	4-6 minuten
Afzetting koolstof	3 nA	5-10 minuten
Frezen grof Geul	15-30 nA	30-50 minuten
Polijsten oppervlak	1.5-3 nA	15-20 minuten
Imaging run	700 pA-1,5 nA	Uur-dagen

Tabel 2. FIB frees stromingen gebruikt voor monstervoorbereiding en imaging run

Discussie

Volume elektronenmicroscopie is uitdagender en tijdrovend dan conventionele SEM of TEM. Vanwege de noodzaak om weefsels of cellen en bloc te vlekken, moeten de verwerkingsstappen lang genoeg zijn om de penetratie van reagentia in het monster te garanderen. Het gebruik van microgolfenergie om penetratie te vergemakkelijken zorgt voor kortere, efficiëntere verwerking en verbetert de kleuring. Omdat de voorbereiding voor EM veel strenger is dan bij lichte microscopie moeten alle oplossingen en reagentia strikt gecontroleerd worden op kwaliteit. Veranderingen in pH, toniciteit, het gebruik van onzuivere reagentia en de introductie van verontreinigingen als gevolg van slechte techniek kunnen allemaal schadelijke effecten hebben op het uiteindelijke beeld.

Voor volume EM zijn ook afzonderlijke protocollen op maat vereist voor elk verschillend sample type. Zoogdier weefsels van verschillende types: planten, enkelvoudige cellen zoals gist, trypanosomes, C. elegans, etc., hebben allemaal hun eigen variaties nodig om optimale resultaten te behalen. Fixatie en kleuring moeten zodanig zijn ontworpen dat de structurele integriteit behouden blijft en het monster zo dicht mogelijk bij zijn in vivo morfologie wordt bewaard. Fixatie van weefsels op fysiologische temperatuur, pH en toniciteit is van cruciaal belang voor het maken van het monster als leven-zoals het kan zijn. Hogedruk bevriezing (HPF) van monsters kan helpen om een meer levens achtige situatie te behouden, (of misschien gewoon verschillende artefacten opleveren), maar voor andere dan cellen en zeer dunne weefsels zal HPF falen als glasachtig ijs alleen in kleine hoeveelheden kan worden gegenereerd. Daarom is voor veel vragen chemische fixatie de enige optie. Het maakt niet uit of de fixatie HPF of chemisch is, in een EM-experiment moeten de structurele resultaten zorgvuldig worden vergeleken met vergelijkbare resultaten van Live-cel-of weefsel beeldvorming om te zien of ze consistent zijn. De kleuring moet ook worden geoptimaliseerd, rekening houdend met de specifieke vraag die moet worden beantwoord en het protocol dat zal worden gebruikt voor de visualisatie van de digitale beelden.

Het hebben van zowel een SBF-SEM en FIB systeem in de nabijheid is een groot voordeel in vele experimenten. Het grote gezichtsveld en de hoge X, Y-resolutie van SBF-SEM maakt het vinden van individuele structuren/cellen/gebeurtenissen ongecompliceerd en biedt een algemene ruimtelijke oriëntatie van cellen in weefsels. Bovendien is het vermogen om beeldvorming door middel van een monster in Z toe te staan zeer krachtig; echter, reconstructies die fijne geometrische Details vereisen kunnen mislukken of artefacten produceren met behulp van deze techniek als gevolg van de niet-isotrope voxels die het genereert. De FIB wordt beperkt door de fysica van het proces naar een kleiner beeldvormings veld, maar de 3D-resolutie is voldoende voor zeer nauwkeurige reconstructies. Het combineren van de twee technieken is eenvoudig, omdat monsters van SBF-SEM naar FIB kunnen worden verplaatst zonder verdere verwerking of voorbereiding. We erkennen dat het gebruik van de SBF-SEM voor het zoeken door een steekproef om een bepaald gebied te vinden een zeer dure toepassing is van een veel beter instrument. De mogelijkheid om de nieuwe blockface onmiddellijk te zien en te bepalen of de ROI is bereikt, is echter een groot voordeel. Bovendien kunnen de alternatieven voor het gebruik van seriële semi-dunne (0,5 μm) LM-secties kleine constructies verwijderen voordat ze worden gedetecteerd, en een blok inspecteren met behulp van enkele TEM-secties die moeten worden afgesneden, op een raster worden geplaatst en vervolgens in een even duur TEM worden bekeken, is niet zo efficiënt als de gepresenteerde methode.

Omdat er veel Programma's bestaan om de gegevens te segmenteren en te renderen en de behoeften van een bepaalde structuur mogelijk niet het best door één toepassing worden bediend, kan geen standaardworkflow worden voorgesteld. Sommige eenvoudige structuren kunnen worden gesegmenteerd met een drempelwaarde-algoritme als ze binnen zeer smalle grijs schaalwaarden vallen. Neuronale structuren kunnen worden semi-automatisch gesegmenteerd met behulp van een programma zoals Ilastik¹¹ maar het zal minder nuttig zijn op meer willekeurige of complexe gevormde ORGANELLEN zoals er. Microscopie afbeeldings browser is een zeer flexibel programma dat volume EM-gegevens kan uitlijnen, segmenteren en renderen, maar aanzienlijke gebruikersinteractie vereist¹². Als algemene regel geldt dat de hoeveelheid tijd die nodig is om de resultaten digitaal te visualiseren, de tijd voor het voorbereiden van het monster en de beeldvorming aanzienlijk overschrijdt.

Volume EM-technieken hebben de derde dimensie opengesteld voor Ultrastructurele analyse. Andere methoden voor het verkrijgen van 3D EM hebben beperkingen in hun volume (TEM tomografie), of hun efficiëntie (seriële sectie TEM). Hoewel voor het grootste deel volume EM-technieken te complex en kostbaar zijn om in afzonderlijke laboratoria te worden geïmplementeerd, is het aantal gedeelde kern faciliteiten dat hen aanbiedt, gegroeid en is het aantal voorbeeld typen dat met succes is gefotografeerd, snel toegenomen. Voor mensen met een specifieke vraag en een bepaald weefsel is het waarschijnlijk dat iemand in staat is om advies en instructies te geven over de voorbereiding en beeldvorming. Volume EM-apparatuur kan worden verbeterd met de capaciteit voor het verwerken van grotere monsters in de SBF-SEM en de mogelijkheid van het frezen van grotere ROIs met de FIB. Software die in staat is om de structuren van belang op een meer geautomatiseerde manier te segmenteren zal het proces van het analyseren van de gegevens aanzienlijk vereenvoudigen en verbeteringen in de computer snelheid zal de tijd die nodig is om dit te doen verminderen. Ondanks de huidige beperkingen is volume EM nog steeds een handig hulpmiddel en combineert SBF-SEM en FIB-SEM een efficiënte workflow voor het identificeren van zeldzame gebeurtenissen en het weergeven van afbeeldingen met een hoge resolutie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3View 2XP	Gatan	NA	In kamer ultramicrotoom voor SBFI
Cacodylate buffer 0.2M oplossing	EM Sciences	11652
Geleidende epoxyhars (circuit werkt)	RS components	496-265
Diatome Histo 4.0mm diamantmes	EM Sciences	40-HIS
Digitalisatietablet	Wacom	DTV-1200W	Niet meer verkrijgbaar
Eppendorf buisjes	Eppendorf	0030 120.094
Platte inbeddingsvorm	EM Sciences	70900
Gluteraldehyde 25% oplossing	EM Sciences	16220
Hoog moleculair gewicht Tanninezuur	EM Sciences	21700
Loodcitraat	Sigma-Aldrich	22861
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Osmium Tetroxide 4% oplossing	EM Sciences	19170
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pelco Biowave Pro +	Ted Pella	36700
Kaliumferrocyanide	Sigma-Aldrich	P3289
Quorum Q150T ES sputtercoater	Quorum Technologies	27645
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotoom	NA	NA	Niet meer verkrijgbaar
Natriumcacodylate 0.2M	EM Sciences	11653
Spurrs Harskit	EM Sciences	14300
Uranylacetaat	EM Sciences	22400