Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Summary

Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.

Abstract

Imaging massaspectrometrie (IMS) is routinematig toegepast op drie soorten monsters: weefselsecties, spheroïden en microbiële kolonies. Deze types van monster hebben zijn geanalyseerd met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) te visualiseren van de verdeling van eiwitten, lipiden en metabolieten in de biologische steekproef van belang. We hebben een nieuwe steekproef voorbereiding methode die de sterke punten van de drie vorige toepassingen aan te pakken een underexplored benadering combineert voor de identificatie van chemische communicatie bij kanker, door het zaaien van zoogdiercellen culturen in agarose in ontwikkeld coculture met gezonde weefsels gevolgd door uitdroging van het monster. Zoogdieren weefsels en cellen zijn cocultured in de nabijheid waardoor chemische communicatie via verspreiding tussen de weefsels en cellen. Op specifieke tijdstippen, wordt het monster agarose gebaseerde gedroogd op dezelfde wijze als microbiële kolonies IMS analyse voorbereid. Onze methode is ontwikkeld om de communicatie tussen hoogwaardige sereuze eierstokkanker afgeleid van de eileider, zoals deze met het ovarium tijdens metastase samenwerkt model. Optimalisatie van de bereiding van de monsters resulteerde in de identificatie van noradrenaline als een belangrijke chemische component in de eierstokken communicatie. Deze nieuw ontwikkelde methode kan worden toegepast op andere biologische systemen die een goed begrip van chemische communicatie tussen aangrenzende cellen of weefsels vereisen.

Introduction

Imaging massaspectrometrie (IMS) is geoptimaliseerd voor het karakteriseren van de ruimtelijke spreiding van moleculaire kenmerken in drie veelgebruikte toepassingen: weefsel segmenten, spheroïden en microbiële kolonies^1,2,3. Weefsel segmenten kunnen worden gebruikt om te evalueren van de lokalisatie van metabolieten in de context van biologische omstandigheden in een host, ofwel gerichte of een ongerichte binnen een specifieke waaier van de massa. Verschillen tussen moleculaire functies zijn echter de meest belangrijke en duidelijk wanneer een gezond weefsel wordt vergeleken....

Protocol

Alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Comité van het institutionele dier gebruik en zorg (IACUC) aan de Universiteit van Illinois te Chicago.

1. bereiding van reagentia

1. Handhaven lymfkliertest oviductal epitheel (MOE) cellen bij 37° C met 5% CO₂ in een bevochtigde incubator in alpha Minimum essentiële Medium (αMEM) media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 10 mg/mL insuline, transferrine, selenium (ITS) , 1.8 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 100 U/mL penici....

Results

Een optimaal gedroogde ITO dia zal resulteren in een platte gedroogde monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van het agarose en agarose stukken die handhaven van ruimtelijke scheiding op de dia (Figuur 3). Figuur 3A geeft optimale drogen, terwijl figuur 3B toont de rimpels die moeten worden vermeden. Deze optimalisatie vereist zorgvuldige controle van de dia in de oven, aangezien de.......

Discussion

Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat noradrenaline de rol in HGSOC^{12,17,18 impliceert}, en deze techniek meer mechanistische informatie heeft bijgedragen. Met ten minste acht biologische omstandigheden aanwezig op dezelfde dia, kan de methode goed zijn voor biologische besturingselementen zoals gen, evenals cel specificiteit en controles van de media in een enkele IMS uitvoeren. Terwijl de methode is geoptimaliseerd.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon tubes	Denville	C1017-O	To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber)	Millipore	PEZGS0816	Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM)	Fisher	10-022-CV	Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	Bruker		For IMS data analysis
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels	Fisher	22-079-707	For removal of the ovaries
Dissecting Scissors	Fisher	13-804-6	For removal of the ovaries
DMEM Media	Gibco	11995-065	Media mixed with agarose
epidermal growth factor	Peprotech Inc.	100-15	Cell culture media supplement
Eppendorf tubes	Genesee Scientific	22-282	For agarose aliquots
Estradiol-17β	Simga-Aldrich	E2758	Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum	Denville	fb5001	Cell culture media supplement
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		IMS data analysis software
Forceps (fine)	Fsiher	22-327379	For removal of the ovaries
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Cell culture media supplement
ITO-coated slide	Bruker	8237001	Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	11415064	Media used during tissue dissection
L-glutamine	Gibco	25030-081	Cell culture media supplement
Low-melting agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Mixed with media for plating
Media basin	Corning	4870	Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard	Bruker Daltonic	8206195	Calibrant for medium mass range
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt)	Fisher	08-875-8B	For removal of the ovaries
TFA	Fisher Technologies	A116-50	Added to matrix solution
TM Sprayer	HTX Technologies		For applying matrix