Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Imaging massaspectrometrie (IMS) is routinematig toegepast op drie soorten monsters: weefselsecties, spheroïden en microbiële kolonies. Deze types van monster hebben zijn geanalyseerd met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) te visualiseren van de verdeling van eiwitten, lipiden en metabolieten in de biologische steekproef van belang. We hebben een nieuwe steekproef voorbereiding methode die de sterke punten van de drie vorige toepassingen aan te pakken een underexplored benadering combineert voor de identificatie van chemische communicatie bij kanker, door het zaaien van zoogdiercellen culturen in agarose in ontwikkeld coculture met gezonde weefsels gevolgd door uitdroging van het monster. Zoogdieren weefsels en cellen zijn cocultured in de nabijheid waardoor chemische communicatie via verspreiding tussen de weefsels en cellen. Op specifieke tijdstippen, wordt het monster agarose gebaseerde gedroogd op dezelfde wijze als microbiële kolonies IMS analyse voorbereid. Onze methode is ontwikkeld om de communicatie tussen hoogwaardige sereuze eierstokkanker afgeleid van de eileider, zoals deze met het ovarium tijdens metastase samenwerkt model. Optimalisatie van de bereiding van de monsters resulteerde in de identificatie van noradrenaline als een belangrijke chemische component in de eierstokken communicatie. Deze nieuw ontwikkelde methode kan worden toegepast op andere biologische systemen die een goed begrip van chemische communicatie tussen aangrenzende cellen of weefsels vereisen.
Inleiding
Imaging massaspectrometrie (IMS) is geoptimaliseerd voor het karakteriseren van de ruimtelijke spreiding van moleculaire kenmerken in drie veelgebruikte toepassingen: weefsel segmenten, spheroïden en microbiële kolonies1,2,3. Weefsel segmenten kunnen worden gebruikt om te evalueren van de lokalisatie van metabolieten in de context van biologische omstandigheden in een host, ofwel gerichte of een ongerichte binnen een specifieke waaier van de massa. Verschillen tussen moleculaire functies zijn echter de meest belangrijke en duidelijk wanneer een gezond weefsel wordt vergeleken....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Comité van het institutionele dier gebruik en zorg (IACUC) aan de Universiteit van Illinois te Chicago.
1. bereiding van reagentia
- Handhaven lymfkliertest oviductal epitheel (MOE) cellen bij 37° C met 5% CO2 in een bevochtigde incubator in alpha Minimum essentiële Medium (αMEM) media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 10 mg/mL insuline, transferrine, selenium (ITS) , 1.8 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 100 U/mL penici....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een optimaal gedroogde ITO dia zal resulteren in een platte gedroogde monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van het agarose en agarose stukken die handhaven van ruimtelijke scheiding op de dia (Figuur 3). Figuur 3A geeft optimale drogen, terwijl figuur 3B toont de rimpels die moeten worden vermeden. Deze optimalisatie vereist zorgvuldige controle van de dia in de oven, aangezien de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat noradrenaline de rol in HGSOC12,17,18 impliceert, en deze techniek meer mechanistische informatie heeft bijgedragen. Met ten minste acht biologische omstandigheden aanwezig op dezelfde dia, kan de methode goed zijn voor biologische besturingselementen zoals gen, evenals cel specificiteit en controles van de media in een enkele IMS uitvoeren. Terwijl de methode is geoptimaliseerd.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Financiering werd verstrekt door het Consortium Chicago biomedische met steun van de fondsen van de Searle op The Chicago Gemeenschap Trust (C-076) (L.M.S.); Universiteit van Illinois te Chicago opstarten middelen (L.M.S.); Subsidie 543296 van de ovariële kanker onderzoek Fonds Alliantie (M.D.); en UG3 ES029073 (J.E.B.) en door het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institute of Health, door middel van subsidie UL1TR002003 (JEB & LMS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | Om cellen te verzamelen |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Hergebruikt vanuit Millipore Millicell EZ-slide kamerslide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent voor gespoten matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Celcultuur media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | Voor IMS data-analyse | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | Om cellen te verzamelen en supernatant te verwijderen |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix gespoten op droge slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix gespoten op droge slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | Voor het verwijderen van de eierstokken |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | Voor het verwijderen van de eierstokken |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media gemengd met agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Celcultuur media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | Voor agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Celcultuur media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Celcultuur media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS dataverzameling software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data-analyse software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | Voor het verwijderen van de eierstokken |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Celcultuur media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Celcultuur media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform voor co-cultuur incubatie |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media gebruikt tijdens weefseldissectie |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Celcultuur media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Gemengd met media voor plateren |
| Media basin | Corning | 4870 | Gebruikt om plastic verdelers voor verdeelde kamers te snijden |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Celcultuur media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant voor medium massabereik |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant voor laag massabereik |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistische analyse | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | Voor het verwijderen van de eierstokken |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Toegevoegd aan matrixoplossing |
| TM Sprayer | HTX Technologies | Voor het aanbrengen van matrix |
Referenties
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
