Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas

Summary

Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.

Abstract

Tracheale penseel cellen zijn cholinerge chemosensorische epitheelcellen die zijn geportiseerd om signalen van de luchtweg lumen naar het immuunsysteem en het zenuwstelsel te zenden. Ze zijn onderdeel van een familie van chemosensorische Epitheelcellen, waaronder Tuft cellen in het darmslijmvlies, borstel cellen in de luchtpijp en eenzame chemosensorische en microvillous cellen in het neusslijmvlies. Chemosensorische cellen in verschillende epitheliale compartimenten delen belangrijke intracellulaire markers en een kern transcriptionele handtekening, maar vertonen ook significante transcriptionele heterogeniteit, waarschijnlijk een afspiegeling van de lokale weefsel omgeving. Isolatie van tracheale borstel cellen van enkelvoudige celsuspensies is nodig om de functie van deze zeldzame epitheelcellen gedetailleerd te definiëren, maar hun isolatie is uitdagend, mogelijk als gevolg van de nauwe interactie tussen tracheale borstel cellen en zenuwuiteinden of door luchtweg-specifieke samenstelling van strakke en hecht knooppunten. Hier beschrijven we een procedure voor isolatie van penseel cellen van het tracheale epitheel van de muis. De methode is gebaseerd op een initiële scheiding van tracheaal epitheel van de submucosa, waardoor een daaropvolgende kortere incubatie van het epitheel blad met papaïne mogelijk is. Deze procedure biedt een snelle en gemakkelijke oplossing voor flowcytometrische sortering en functionele analyse van levensvatbare tracheale borstel cellen.

Introduction

Borstel cellen behoren tot een klasse van chemosensorische epitheelcellen gekenmerkt door de uitdrukking van bittere smaak receptoren en de smaak receptor transductie machines gevonden in smaak Bud cellen. In tegenstelling tot smaak Bud cellen, zijn chemosensorische epitheelcellen verspreid in epitheliale oppervlakken en worden aangeduid als eenzame chemosensorische cellen (scc's) en microvillous cellen in het neus epitheel^1,2, borstel cellen in de luchtpijp ^3,4en Tuft cellen in de darm^5,6. Epitheelcellen die bittere smaak receptoren uitdrukken en de bittere smaak transductie machines zijn ook te vinden in de urethra^7,8 en de gehoor buis⁹. Luchtweg borstel cellen hebben unieke functies in neurogene en immuun luchtweg reacties. Ze zijn acetylcholine-producerende chemosensorische cellen die beschermende respiratoire reflexen oproepen bij activering met bittere verbindingen en bacteriële metabolieten zoals Quorum-sensing stoffen¹⁰. Luchtweg borstel cellen zijn ook de dominante luchtweg epitheliale bron van IL-25, die de aeroallergen-opgewekt type 2 ontsteking in de luchtwegen³regelt.

De karakterisering van de volledige transcriptome van lagere luchtweg borstel cellen en hun reactie op milieu stimuli is beperkt door hun lage aantallen in het tracheale epitheel en zeer beperkte aantallen buiten de grote bronchiën¹⁰. Technieken die worden gebruikt voor de isolatie van chemosensorische cellen uit het intestinale epitheel hebben niet proportioneel hoge aantallen van de luchtpijp opgeleverd, mogelijk vanwege de intieme contacten van tracheale borstel cellen met zenuwuiteinden¹⁰ of andere weefsel-specifieke factoren in de respiratoire mucosa zoals de samenstelling van de aanhangers en nauwe Junction eiwitten. Recente rapporten van succesvolle isolatie van tracheale borstel cellen in hogere aantallen voor single cell RNA sequencing analyse gebruikt ofwel een 2 h incubatie met papaïne of een 18 h incubatie met pronase^11,12. Aangezien een langere incubatie met spijsverteringsenzymen de levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen en het transcriptionele profiel van cel uit verteerde weefsels¹³kunnen veranderen, kan dit de vergelijkende analyse met andere chemosensorische epitheel populaties vooroordelen.

Hier rapporteren we een methode voor het isoleren van tracheale borstel cellen voor RNA-sequencing³. Behandeling van de luchtpijp met hoge dosis dispase scheidt het epitheel van de submucosa. Daaropvolgende vertering van het epitheel blad met papaïne zorgt voor een uitstekend herstel van deze structurele cel.

Protocol

Voordat de volgende experimenten worden uitgevoerd, moet ervoor worden gezorgd dat alle dierenverzorging en-protocollen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en worden verricht in overeenstemming met de "gids van de nationale Onderzoeksraad voor de zorg en het gebruik van Proefdieren " (8^e editie, 2011) en de richtlijnen voor aankomst. Alle hieronder beschreven procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité in het Brigham and Women's Hospital.

1. bereiding van de reagentia

1. Bereid de digestie oplossing voor, een PBS-oplossing met 16 e/mL dispase en 20 μg/mL DNase I. Zorg ervoor dat het dispase poeder volledig is opgelost voordat u de oplossing opwarmt in een waterbad van 37 °C.
2. Voeg 5% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) toe aan Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) om een stop oplossing te maken.
3. Bereid tyrode I buffer: Voeg toe 26 U/ml papaïne (20 μL/ml 48 U/mg papaïne oplossing) en 10 μL/ml L-cysteïne naar Hepes-tyrode de buffer zonder calcium.
4. Bereid de Tyrode II-buffer voor: Voeg 2 μL/mL leupeptine (5 mg/mL) toe aan de buffer van HEPES-Tyrode met calcium.
5. FACS-buffer voorbereiden: gebruik Hanks ' balanced salt solution (HBSS) zonder calcium, magnesium & fenolrood, aangevuld met 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en voeg 2% FBS toe.

2. dissectie van muis trachea

Opmerking: Muizen die in dit protocol worden gebruikt, zijn ChAT^(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 maanden oud van beide geslachten. Minimaliseer de blootstelling van het weefsel aan direct licht om fotobleaching van eGFP te verminderen.

1. Euthanasie de muis met 100 mg/kg pentobarbital euthanasioplossing geïnjecteerd intraperitoneaal of met behulp van standaardprotocollen goedgekeurd door de iacuc.
2. Bevestig de muis op een chirurgische plaat in rugligging met 21 G naalden met verlengde bovenste en onderste ledematen. Spray de vacht met 70% EtOH om het gebied te ontsmeseren.
3. Met behulp van rechte Tang, til de huid en vacht van de buik en maak een incisie in het midden met ontleed schaar (rechte schaar, 3 cm). Scheid met behulp van de schaar de huid van het onderhuidse weefsel van de buik tot het mandibula. Terwijl u het onderhuidse weefsel met de Tang vasthoudt, maakt u een kleine incisie met de schaar in het midden van de buikwand.
4. Open het peritoneum met een V-vormige incisie. Gebruik de Tang, beweeg voorzichtig de dunne darm naar de zijkant, lokaliseer de abdominale aorta en Vena Cava en maak een incisie met de ontleed schaar om snelle exsanguination mogelijk te maken.
5. Zoek het diafragma. Gebruik een 18 G naald, maak een opening in het diafragma net onder het borstbeen om de longen te laten leeglopen. Scheid voorzichtig het diafragma van de ribbenkast met behulp van een scherp puntige rechte ontsnij schaar om langs de basis van de ribben te snijden.
6. Met behulp van de Tang, til het blootgestelde uiteinde van het borstbeen en snijd het borstbeen longitudinaal van de basis van de ribbenkast naar de nek. Maak een centrale cervicale incisie met korte rechte schaar (2 cm) en scheid de twee lobben van de submandibulaire klier.
7. Verwijder voorzichtig het omringende bindweefsel en de thymus boven de Carina met een paar fijne punt hoge precisie Tang.
8. Ontleden de luchtpijp vrij eerst door het proximale uiteinde op het niveau van de epiglottis te scheiden en vervolgens door het distale uiteinde op het niveau van de bifurcatie van de luchtpijp uit te snijden.
9. Zoek de epiglottis en snijd de luchtpijp longitudinaal van de epiglottis naar de Carina.

3. tracheale epitheliale spijsvertering

1. Plaats de luchtpijp in een tube van 1,5 ml met 750 μL pre-warmed (tot 37 °c) oplossing voor de spijsvertering. Inincuberen op een shaker bij 200 rpm gedurende 40 min bij kamertemperatuur. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht te verminderen.
2. Voeg 750 μL koude DMEM toe met 5% FBS om de reactie te stoppen. Plaats op ijs.
3. Breng de luchtpijp over naar een Petri schaaltje (100 mm x 15 mm) en plaats deze onder een ontsnij bare Microscoop. Oriënteer de luchtpijp met de epitheel zijde naar boven gericht. De longitudinaal ontleed luchtpijp heeft een semi-cilindrische vorm die wordt gehandhaafd door de kraakbeen vormige ringen. Het epitheel bevindt zich op het concave oppervlak.
4. Tether het epiglottis gebied van de luchtpijp met rechte Tang naar de Petri schaal en met behulp van een maat 22 wegwerp scalpel, schrait het epitheum van de luchtpijp. De epitheliale laag scheidt als een doorschijnend blad.
5. Het epitheel met het scalpël. Breng de epitheel laag over in een buis van 2 mL.
6. Spoel de Petri schaal af met 750 μL Tyrode I-buffer en breng over naar de 2 mL-buis met de epitheliale laag.
7. Inbroed de tracheale epitheliale laag in Tyrode I buffer gedurende 30 min bij 37 °C op een shaker bij 200 rpm. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht te verminderen.
8. Voeg 750 μL koude Tyrode II-buffer toe. Vortex het verteerde weefsel krachtig voor 20-30 s. Triturate het homogenaat met een spuit bevestigd aan een 18 G naald 10 keer.  Overschakelen naar een 21 G gauge naald en wrijf 10-20 meer keren.
9. Filtreer de cellen door een zeef van 100 μm in een conische buis van 50 mL. Voeg 30:1 vol/vol koude FACS-buffer toe.
10. Spin bij 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg. Respendeer de pellet in de koude FACS buffer en breng de suspensie over in een polystyreen buis van 12 mm x 75 mm (5 mL). Draai opnieuw op 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
11. Resuspendeer de pellet in 100 μL FACS buffer.
12. Voeg 1 μL anti-Mouse CD16/32 blokkerende antilichaam toe om niet-specifieke binding te blokkeren en gedurende 15 minuten op ijs te inbroed. Niet wassen.
13. Voeg de volgende antilichamen en de respectieve Isotype-controles toe: Pacifische blauwe anti-muis CD45 of rat IgG2a, k (0,25 μg/10⁶ cellen in 100 μL volume) en allophycocyanin (APC) anti-muis epcam of rat IgG2b, k (0,5 μg/10⁶ cellen in 100 μL volume) monoklonale antilichamen. Incuberen voor 45 min op ijs beschermd tegen direct licht. Voeg 4,5 mL koude FACS buffer toe, meng en spin bij 350 x g gedurende 10 min bij 4 °c. Gooi de FACS buffer weg en onderbreek de pellet in 300 μL koude FACS buffer.
14. Voeg propidium jodide (PI) (5 μg/mL) toe direct voor de stroom cytometrische sortering.
    Opmerking: Penseel cellen hebben een onregelmatige vorm met verschillende processen die hun hechting op filters mogelijk zouden kunnen verhogen (Figuur 3C). We vergeleek 30 mm tot 70 mm en 100 mm filters en ontdekten dat grotere porie filters een betere opbrengst zorgden. Bovendien verbetert een grondige trituratie van de celsuspensie na de vertering van papaïne aanzienlijk de opbrengst van de borstel cellen. We raden aan om een 18G naald te gebruiken voor initiële trituratie gevolgd door een kleinere boring (21 of 23 G naald) voor een fijnere dissociatie van cellen.

4. Flowcytometrie gating strategie

1. Identificeer cellen van puin door voorwaartse en zijspreidings hoek. Sluit de wambuizen uit met de hoogte en breedte van de voorwaartse spreidings hoogte en-breedte. De wambuizen zijn de cellen met hoge breedtewaarden.
2. Identificeer in de afzonderlijke cellen de levende cellen als de populatie die PI-negatief is.
3. Identificeer in de Live-afzonderlijke cellen de CD45 laag tot negatieve cellen op basis van het Isotype-besturingselement.
4. Identificeer binnen de CD45 lage/negatieve cellen de EpCAM-positieve cellen die ook eGFP-positief zijn (in het FITC-kanaal). Dit is de populatie van penseel cellen (Figuur 2A).

Results

Deze procedure is met succes geïmplementeerd om tracheale penseel cellen te isoleren voor RNA-sequencing³. Na isolatie van de luchtpijp en de vertering van het weefsel met een 2-stappen Protocol (Figuur 1), werden cellen verzameld en gekleurd met fluorescently-GELABELDE CD45 en epcam na uitsluiting van dode cellen met pi. Na het uitgeren van wambuizen op basis van voorwaartse en zijspreidings karakteristieken, definieerde men de penseel cellen als laag/negatief voor C...

Discussion

We constateerden dat een combinatie van een hoge dosis dispase behandeling voor 40 min gevolgd door een korte papaïne behandeling (30 min) een optimaal protocol biedt voor tracheale spijsvertering en borstel celisolatie. Deze combinatie vermijdt uitgebreide spijsvertering en produceert de hoogste opbrengst van penseel cellen, vergeleken met alternatieve protocollen.

Terwijl Long spijsvertering te extract hematopoietische cellen heeft klassiek vertrouwd op milde spijsverteringsenzymen zoals Col...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antilichamen
Anti-GFP (Polyklonaal geit Ig)	Abcam	cat# ab5450
APC anti-muis CD326 (EpCAM)  (G8.8)	Biolegend	cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control	Biolegend	cat#400511
DAPI	Biolegend	cat#422801
Ezel anti-geit IgG (H+L) Hoog Cross-Adsorbed Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 488	Life Technologies/Molecular Probes	cat#A-11055
Normale Geit IgG	R&D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-muis CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (anti-muis CD16/32) Antilichaam	Biolegend	cat#101320
Chemicaliën, Peptiden en Recombinante Eiwitten
Dispase	Gibco	cat# 17105041
DNase I	Sigma	cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Zonder Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Bereid in 18,2 megohms water en gefilterd door 0,22 µm filter	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode’s Oplossing (HEPES-Gebufferd) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en 10 mM glucose. Bereid in 18,2 megohms water en gefilterd door 0,22 µm filter. )	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-Cysteïne	Sigma	cat# C7352
Leupeptine trifluoracetaat zout	Sigma	cat# L2023
Papaïne uit papaya latex	Sigma	cat# P3125
Propidium jodide	Sigma	cat# P4170
Experimentele Modellen: Organismen/Stamlijnen
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	The Jackson Laboratory	7902
Apparatuur
LSM 800 met Airyscan confocal systeem op een Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscoop	Zeiss
LSRFortessa	BD	647465
Beschikbare apparatuur
1,5 mL steriele buizen	Thomas Scientific	1157C86
5 mL Poysterene Ronde-bodembuis, 12 mm x 75 mm stijl	Falcon	14-959-1A
50 mL Polypropyleen conische buis, 30 mm x 115 mm stijl	Falcon	352098
Feather Wegwerp Scalpel nr.12	Fisher Scientific	NC9999403
Petrischaal, 100 mm x 15 mm Stijl	Falcon	351029
Steriele cel zeef, 100 μm	Fisherbrand	cat#22363549