Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Samenvatting

Patiënten-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen meer robuust even melanoom moleculaire en biologische kenmerken en zijn meer voorspellend van therapie respons in vergelijking met traditionele kunststof weefselcultuur gebaseerde assays. Hier beschrijven we ons standaard Besturingsprotocol voor de oprichting van nieuwe PDX-modellen en de karakterisatie/experimenten van bestaande PDX-modellen.

Samenvatting

Accumulatie van bewijs suggereert dat moleculaire en biologische eigenschappen verschillen in melanoom cellen gekweekt in traditionele tweedimensionale weefselkweek vaten versus in vivo bij menselijke patiënten. Dit komt door de knelpunt selectie van klonale populaties melanoom cellen die in vitro in de afwezigheid van fysiologische omstandigheden krachtig kunnen groeien. Verder reflecteren de reacties op therapie in tweedimensionale weefselculturen over het algemeen niet getrouw de reacties op therapie bij melanoom patiënten, waarbij de meerderheid van de klinische proeven niet de werkzaamheid van therapeutische combinaties laat zien die effectief blijken te zijn in Vitro. Hoewel het xenotransplanteren van melanoom cellen in muizen de fysiologische in vivo context bevat die afwezig is in de tweedimensionale weefsel cultuurassays, hebben de melanoom-cellen die worden gebruikt voor engraftment al een knelpunt selectie ondergaan voor cellen die kunnen groeien onder twee-dimensionale voorwaarden wanneer de cellijn werd vastgesteld. De onomkeerbare veranderingen die zich voordoen als gevolg van het knelpunt zijn veranderingen in de groei en invasie eigenschappen, evenals het verlies van specifieke subpopulaties. Daarom kunnen modellen die de menselijke toestand in vivo beter recapituleren, beter therapeutische strategieën voorspellen die de totale overleving van patiënten met gemetastaseerd melanoom effectief verhogen. De patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) techniek omvat de directe implantatie van tumorcellen van de menselijke patiënt aan een muis ontvanger. Op deze manier, tumorcellen worden consequent geteeld onder fysiologische spanningen in vivo en nooit ondergaan de tweedimensionale knelpunt, die behoudt de moleculaire en biologische eigenschappen aanwezig wanneer de tumor in de menselijke patiënt was. Opmerkelijke, PDX-modellen afgeleid van orgaan sites van metastasen (d.w.z. hersenen) vertonen vergelijkbare metastatische capaciteit, terwijl PDX-modellen afgeleid van therapie-naïeve patiënten en patiënten met verworven resistentie tegen therapie (d.w.z. BRAF/MEK-remmer therapie) weergeven vergelijkbare gevoeligheid voor therapie.

Inleiding

Preklinische modellen zijn van cruciaal belang voor alle aspecten van translationeel kankeronderzoek, waaronder ziekte karakterisering, ontdekking van bruikbare kwetsbaarheden die uniek zijn voor kanker versus normale cellen, en de ontwikkeling van werkzame therapieën die misbruik maken van Deze kwetsbaarheden om de algehele overleving van patiënten te verhogen. In het melanoom-veld zijn tienduizenden cellijn modellen intensief gebruikt voor het screenen van drugs, met > 4000 bijgedragen door onze groep alleen (WMXXX-serie). Deze cellijn modellen werden afgeleid van melanoom patiënten met verschillende vormen van cutane melanoom (d.w.z. acral, ukalfs en oppervlakkige verspreiding) en diverse genotypen (d.w.z. braf^V600-Mutant en neuroblastoom RAS virale oncogen homo [ Nri's ^Q61R-Mutant]), die het spectrum van de ziekte aanwezig in de kliniek^1,2omvatten.

Ondubbelzinnig, de meest succesvolle, gerichte therapie strategie in het melanoom veld is voortgekomen uit 1) de genomische karakterisering van patiënten ' tumoren identificeren van braf mutaties in ~ 50% van melanomen³ en van 2) preklinisch onderzoek gebruik maken van melanoom Cell line modellen⁴. De combinatie van braf/MEK-remmer was Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurd in 2014 voor de behandeling van patiënten bij wie de melanomen Harbor braf^V600E/K -mutaties activeert en een > 75% responsratio⁵heeft. Ondanks deze initiële werkzaamheid, ontstaat er snel resistentie in bijna elk geval als gevolg van multifarische intrinsieke en verworven resistentiemechanismen en intratumoreel heterogeniteit. Helaas, cellijn modellen niet recapituleren representatieve biologische heterogeniteit wanneer geteeld in de tweedimensionale cultuur in kunststof vaten, die maskeert hun klinisch voorspellend potentieel wanneer onderzoekers proberen om experimenteel te bepalen therapieën die effectief kunnen zijn bij patiënten met een specifieke vorm of genotype van melanoom⁶. Begrijpen hoe het beste model patiënt intratumoral heterogeniteit zal onderzoekers in staat stellen om beter te ontwikkelen therapeutische modaliteiten die kunnen doden therapie-resistente subpopulaties die het falen van de huidige standaard-van-zorg therapieën rijden.

Essentieel voor de beperkte voorspellende waarde van cellijn modellen is hoe ze in eerste instantie worden vastgesteld. Onomkeerbare veranderingen optreden in het tumor klonale landschap wanneer een eencellige suspensie van de tumor van een patiënt wordt geteeld op tweedimensionale, kunststof weefselkweek vaten, inclusief veranderingen in proliferatief en invasief potentieel, de eliminatie van specifieke subpopulaties en de wijziging van genetische informatie⁷. Xenografts in muizen van deze melanoom cellijn modellen vertegenwoordigen de meest gebruikte in vivo platform voor preklinische studies; echter, deze strategie lijdt ook aan de slechte recapitulatie van complexe tumor heterogeniteit waargenomen klinisch. Om deze tekortkoming te overwinnen, is er een groeiende belangstelling voor het opnemen van geavanceerdere preklinische modellen van melanoom, waaronder het PDX-model. PDX-modellen zijn gebruikt voor > 30 jaar, met zaad studies bij longkanker patiënten die overeenstemming aantonen tussen de respons van de patiënten op cytotoxische middelen en de respons van het PDX-model dat is afgeleid van dezelfde patiënt⁸. Onlangs is er een drive geweest om PDX-modellen te gebruiken als het instrument van keuze voor preklinisch onderzoek, zowel in de industrie als in academische centra. PDX-modellen zijn, vanwege hun superieure recapitulatie van tumor heterogeniteit bij humane patiënten, meer klinisch relevant voor gebruik in therapie optimaliserings inspanningen dan cellijn xenotransplantaten⁹. Bij melanoom zijn er immense hindernissen die het therapeutische beheer van gevorderde ziekte¹⁰botte. Klinisch relevante PDX-modellen zijn gebruikt om klinische resistentie te modelleren en therapeutische strategieën te identificeren met klinisch beschikbare agenten voor de behandeling van therapieresistente tumoren^11,12. In het kort, het protocol hier gepresenteerd voor het genereren van PDX modellen vereist de subcutane implantatie van vers weefsel van primaire of gemetastaseerde melanomen (verzameld door biopsie of chirurgie) in NOD/scid/IL2-receptor Null (NSG) muizen. Verschillende variaties in methodologische benadering worden door verschillende groepen gebruikt; Er bestaat echter een fundamentele kern van¹³.

Protocol

De volgende dieren protocollen volgen de richtlijnen van het Wistar Institute humane ethische Commissie en Dierenzorg richtlijnen.

1. melanoma tumorweefsel collectie

1. Verzamel tumorweefsel (zogenaamde passage 0) van melanoom patiënten door een van de volgende chirurgie of biopsie methoden.
   1. Houd voor chirurgisch excisie weefsel minimaal 1 g weefsel (uitzaaiingen en primaire laesies) in transport opslagmedia (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) bij 4 °C of op ijs.
   2. Voor chirurgisch biopsie weefsel, handhaven van minder dan 1 g weefsel (vaak Punch biopsieën van subcutane [s.c.] metastasen en lymfeklieren [LN] metastasen) in het vervoer opslagmedia bij 4 °c of op ijs.
   3. Voor kern biopsie weefsel, wassen van een cilinder (kern) weefsel van ongeveer 10 mm x 1 mm (vaak, lever biopsieën) in een buis van 15 mL met 5 mL van de opslagmedia van het vervoer bij 4 °C of op ijs.
   4. Voor fijn naald aspiraat (Fnas) weefsel, houd een zeer kleine hoeveelheid weefsel (minder dan 1 mm in grootte) rechtstreeks genomen van de patiënt in een naald en spuit op 4 ° c of op ijs.
2. Lever het weefsel in de transport opslagmedia bij 4 °C of op het ijs op dezelfde dag of met een nachtelijke verzending na chirurgische excisie of biopsie. Verwerken van het weefsel binnen 1-2 h van levering.

2. tumor weefsel verwerking voor muis implantatie

1. Chirurgische excisie of chirurgische biopsie weefsel verwerking
   1. Breng het weefsel over naar een steriele Petri schaal en scheid het tumorweefsel zo veel mogelijk van het omringende normale weefsel.
   2. Verwijder necrotisch weefsel (meestal geïdentificeerd als licht-witachtig weefsel dat centraal binnen de tumor ligt) van de overgebleven tumor zoveel mogelijk.
   3. Gebruik een scalpel om een eerste tumor Brok te onderverdelen in ongeveer gelijke stukken (~ 3 mm x 3 mm) voor chirurgische muis implantatie (Figuur 2).
   4. Optioneel, als er voldoende tumorweefsel beschikbaar is, snap-Freeze het weefsel voor downstream assays (RNA sequencing [RNASeq], exoomsequencing [WES], enz.).
   5. Maak een tumor slurry door het mineren van het tumorweefsel met behulp van een cross Blade techniek met twee scalpel messen. Snipper de tumor brokken zo fijn mogelijk om een slurry te vormen, die nu klaar is voor implantatie van een chirurgische muis.
   6. Als alternatief, als het tumorweefsel te moeilijk is voor mechanische dissociatie, gebruik dan een verterings dissociatie procedure om gel-achtige slurry te vormen en een suspensie met één cel voor implantatie en/of injectie.
      1. Snipper de tumor brokken zo fijn mogelijk om slurry te vormen.
      2. Zet de slurry in een tube van 50 mL met de gebalanceerde zoutoplossing van Cold Hank (HBSS)^-/- (zonder CA^{+ +} en mg^{+ +}); vervolgens Centrifugeer en pellet bij 220 x g gedurende 4 minuten bij 4 °c.
      3. Resuspendeer de slurry in 10 mL opgewarmde verse Digest media (200 U/mL Collagenase IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/ml DNase in HBSS^-/-) per 1 g tumorweefsel.
      4. Plaats de buis gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C en meng elke 5 min krachtig met een wegwerp pipet.
      5. Wassen met maximaal 50 mL HBSS^-/-; Centrifugeer vervolgens op 220 x g gedurende 4 minuten bij 4 °c.
      6. Voeg 5 mL voorverwarmde TEG toe (0,025% trypsine + 40 μg/mL ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraazijnzuur [EGTA] + 10 μg/mL polyvinylalcohol [PVA]) per 1 g tumorweefsel, zachtjes respenderen/schudden, en plaats de buis bij 37 °C gedurende 2 minuten zonder te mengen.
      7. Voeg ten minste 1 gelijk volume koude kleurings media toe (1% boviene serumalbumine [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur [HEPES] + 1x penicillaire-streptomycine in L15 media) om de trypsine te doven en te centrifugeren bij 220 x g gedurende 4 minuten bij 4 ° C.
      8. Hervat het monster in 10 mL kleurings media per 1 g tumorweefsel en filtreer het door een celzeef van 40 μm om een eencellige suspensie voor muis injectie te krijgen (Figuur 2).
      9. Slurry overgebleven bovenop de cel zeef kan ook worden verzameld voor chirurgische muis implantatie.
2. C erts biopsie weefsel verwerking
   1. Giet het kern cilinder weefsel in de tissue transportbuis in een 5 cm Petri schaaltje.
   2. Verwijder overtollige vloeistof, schraap weefsel aan de rand van de Petri schaal, fijngehakt het tumorweefsel, voeg ~ 100 – 150 μL HBSS^-/- bovenop het tumorweefsel, en trek snel de HBSS/tumorweefsel suspensie in de 1 ml spuit.
   3. Bevestig een 23 G naald aan de 1 mL spuit, passeren de HBSS/tumorweefsel suspensie door de naald in een 1,5 mL spin buis.
   4. Trek de tumor suspensie in de spuit met de naald nog steeds op totdat deze soepel door de naald kan passeren.
   5. Trek ten slotte de tumor suspensie terug in de spuit en maak de 23 G naald los.
   6. Bevestig een 27 G naald en teken een gelijk volume (~ 100 – 150 μL) van kunstmatige extracellulaire matrix (Zie tabel met materialen) in de spuit.
   7. Voeg een gelijk volume van kunstmatige extracellulaire matrix langzaam in de 1,5 mL spin buis met de tumor/HBSS^-/- suspensie, voorzichtig te voorkomen dat de vorming van bubbels.
   8. Trek een laatste keer terug in de spuit en de kern biopsie tumorweefsel is nu klaar voor muis injectie.
3. FNA-weefsel verwerking
   1. Plaats de spuit met de FNA-monsters (gevangen in de naald) op het ijs.
   2. Scheid de naald (met FNA-weefsel) uit de spuit en verwijder de zuiger uit de spuit, Voeg ~ 150 – 200 μL HBSS^-/- aan de bovenkant van de spuit toe.
   3. Plaats de zuiger opnieuw in de spuit en de naald (met FNA-weefsel) en duw de HBSS^-/- door de naald in een spin buis van 1,5 ml. Deze stap verwijdert de FNA-tumor uit de naald.
   4. Herhaal stap 2.3.3 met de HBSS^-/-/Fna-suspensie tweemaal met dezelfde spuit om het ophalen van tumorweefsel van de naald te maximaliseren.
   5. Voeg een gelijk volume (~ 100 – 150 μL) van kunstmatige extracellulaire matrix toe aan de 1,5 mL spin buis die de HBSS/FNA-suspensie bevat.
   6. Adequaat mengen door langzaam de kunstmatige extracellulaire matrix/HBSS^-/-/Fna-suspensie terug in de 23 G-naald te tekenen en tweemaal te herhalen.
   7. Teken het volledige kunstmatige extracellulaire matrix/HBSS^-/-/Fna-volume terug in de spuit, vervang de 23 g-naald door een naald van 27 g en het Fna-monster is nu klaar voor injectie met de muis.

3. tumor implantatie en injectie bij muizen

1. Implantatie van chirurgische excisie of chirurgisch biopsie weefsel
   Opmerking: Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten steriel zijn door Autoclaveren of het gebruik van voorgesteriliseerde wegwerpinstrumenten.
   1. Scheerhaar uit de onderrug van NSG 6-8 week mannelijke of vrouwelijke muizen verlaten een ongeveer 1,5 cm x 3 cm gebied zonder haar. Anesthetiseren muizen met behulp van isoflurane, en Bevestig door zachtjes knijpen de voet als een test van responsiviteit. Gebruik vet zalf op hun ogen om droogheid te voorkomen.
   2. Plaats individuele muizen op een warmte pad in de neuskegel van de anesthesie machine, schrobben het geschoren gebied met chloorhexidine. Vervolgens Blus met 70% ethanol en laat verdampen.
   3. Bereid brokken of verdeel tumor slurrie in een Petri schaaltje in individuele heuvels voor chirurgische implantatie (d.w.z. in drie gelijke heuvels als het in 3 muizen moet worden geïmplanteerd).
   4. Met behulp van de scalpel Blade, maak een incisie van ongeveer 5 mm lang op het midden van de achterkant van de muis, neem een paar van de Tang en til de huid aan de zijkant van de incisie tegenover de operator.
   5. Neem de schaar in de andere hand en scheid de huid van de spierlaag door het fasciale membraan voorzichtig te snijden met kleine schaar sneden, waardoor een "zak" ontstaat voor het tumorweefsel.
   6. Pick-up een tumor Brok of één individuele heuvel van tumor slurry weefsel met het scalpel mes en plaats voorzichtig weefsel in de gecreëerde zak.
   7. Dien 100 μL kunstmatige extracellulaire matrix toe op de tumorweefsel heuvel in de zak.
   8. Met behulp van twee paren van Tang, trek de incisie aan beide uiteinden zodat de wondranden komen dicht bij elkaar, en sluit de wond door het toepassen van een of twee wond clips.
   9. Subcutaan injecteren 1-5 mg/kg Meloxicam als pijnstiller bij muizen na de operatie.
   10. Neem de muis uit de neuskegel en plaats hem terug in zijn originele kooi, observeer de muis terwijl je wakker wordt. Ga niet terug naar een kooi totdat deze volledig hersteld is.
   11. Verwijder wond clips na ongeveer 7 dagen. Als de genezing na 7 dagen niet voltooid is, laat de wond clip dan een extra of twee dagen in.
       Opmerking: als u een enkele cel suspensie van chirurgische excisie of chirurgische biopsie weefsel verwerking, het zal mengen met kunstmatige extracellulaire matrix (bij 1:1 ratio) voor muizen injectie.
2. Injectie van FNA-of kern biopsie weefsel
   1. Plaats een NSG-muis op een stalen raster Rack, houd de muis stevig vast door de staart en trek de muis voorzichtig terug. Het zal het rooster met zijn voorste benen stevig vastgrijpen. U ook een muis in de niet-dominante hand rebelasten en het flank gebied zichtbaar laten.
   2. Desinfecteer de huid van de flank met alcohol prep swabs, langzaam en gestaag Injecteer de inhoud van de spuit onder de huid van de muis.
   3. Trek de naald eruit en plaats de muis terug in de kooi.

4. monitor tumorgroei

1. Monitor muizen eenmaal per week om te controleren op palpabele tumoren.
2. Zodra tumoren zijn op een meetbare grootte (ongeveer 50 mm³), gebruik een remklauw voor het opnemen van de afmetingen van de tumor. Gebruik de volgende formule voor het berekenen van tumor volumes: (breedte x breedte x lengte)/2.
3. Oogst tumor zodra het tumor volume ongeveer 1,5 cm³ (ongeveer 4 – 10 weken) bereikt. De tumor heet nu muis passage 1 (MP1).

5. oogst tumor voor Bank weefsel, reimplantage, en experiment/karakterisering

1. Euthanaseer de muis in een CO₂ -kamer, Controleer de vitale functies om de dood te bevestigen en dompel de muis vervolgens onder in een virkon-oplossing om de huid voor 30 s in de bio-kast te steriliseren.
2. Gebruik gebogen schaar en chirurgische tang om de huid naast de tumor op te tillen en een horizontale snede te maken.
3. Gebruik een stompe scheidingstechniek om de huid aan beide zijden van de tumor te mobiliseren en over de tumor, waardoor de tumor wordt blootgesteld.
4. Gebruik een schaar of een scalpel blad om de tumor van de fascia te scheiden.
5. Resect de tumor en breng de tumor over naar een steriele Petri schaal, snijd de tumor in kleine stukjes en verwijder necrotisch weefsel van de tumor.
6. Bank tumorweefsel voor toekomstige implantatie.
   1. Neem 2-3 kleine tumor stukken kleiner dan ~ 10 mm x 10 mm en gehakt ze in stukken kleiner dan ~ 1 mm x 1 mm.
   2. Breng al het fijngehakte weefsel over in een cryogene Injectieflacon van 2 mL, voeg 1 mL Vries medium (10% DMSO + 90% FBS) toe.
   3. Meng goed en plaats cryogene flesjes in een voorgekoelde, op isopropanol gebaseerde cel-Vries container op droogijs.
   4. Bewaar container in-80 ° c vriezer 's nachts en breng vervolgens cryogene flesjes over naar vloeibare stikstof (LN₂) opslag.
7. Snap-Freeze weefsel voor downstream assays (RNASeq, WES, etc.).
   1. Plaats tumorweefsel stukken (~ 3 mm x 3 mm) in een cryogene injectieflacon en zet de cryogene injectieflacon onmiddellijk in LN₂ . Bewaar flesjes in-80 °C vriezer.

6. PDX therapie proeven

Opmerking: het duurt twee uitbreidings fasen om voldoende tumorweefsel te kweken om het benodigde aantal PDX-lagermuizen voor de therapie proef te genereren.

1. Neem een cryoflacon met gestort PDX-weefsel van LN₂op en plaats de cryovial in een waterbad van 37 °c totdat het Vries medium dat het tumorweefsel bevat net begint te smelten.
2. Leeg de inhoud van de cryoflacon in voorverwarmde HBSS^-/- in een buis van 50 ml en was het wasweefsel.
3. Pelletweefsel door centrifugeren gedurende 5 min bij 1.200 rpm.
4. Verwijder HBSS^-/- van het tumor monster door vacuüm aspiratie met een Pasteur-pipet.
5. Schuif het PDX-weefsel van de 50 mL buis in een Petri schaaltje van 5 cm of 10 cm en plaats op nat ijs.
6. Volg het bovenstaande implantatie protocol om gestort weefsel te implanteren van een cryogene injectieflacon in 5 NSG-muizen voor de eerste ronde van de PDX-tumor uitbreiding.
7. Zodra tumoren bereiken ~ 600 – 800 mm³, oogst 1-2 tumoren te krijgen van een enkele cel schorsing met het bovenstaande protocol voor tumorweefsel verwerking: mechanische dissociatie, Collagenase spijsvertering dissociatie procedure.
8. Pellet cellen en respenderen in 6 ml HBSS^-/-/Wedding kunstmatige extracellulaire matrix (1:1 ratio), subcutaan injecteren ~ 50 NSG muizen, met 100 μL celmengsel per muis voor de tweede ronde van PDX tumor expansie.
9. Maatregel tumorgrootte met remklauwen Biweekly.
10. Wacht op een tumorgrootte van ~ 100 mm³ in 3-5 weken, randomiseren van muizen in groepen, en start de behandeling.
11. Wanneer Tumorgrootte het maximale IACUC-goedgekeurde volume bereikt, stop de behandeling.
12. Volg de bovenstaande oogst tumor protocol te verzamelen snap bevroren tumor stukken, tumor stukken voor paraffineblokken.

Resultaten

Tumor weefsel voor melanoom PDX modellen kan afkomstig zijn uit een verscheidenheid van verschillende bronnen en kan ook worden verwerkt per de groeidynamiek van individuele modellen en het gewenste gebruik van het PDX-weefsel. De prioriteit bij het opzetten van een PDX-model is dat er voldoende materiaal is voor de Bank voor toekomstig gebruik en DNA voor karakterisering (Figuur 1).

Zodra voldoende materiaal is banked, tumorweefsel kan worden uitgebreid in een va...

Discussie

We hebben hierin beschreven het genereren van PDX-modellen van melanoom met patiënt weefsel afgeleid van primaire en gemetastaseerde tumoren, kern biopsieën en Fna's. Wanneer rechtstreeks in NSG-muizen worden geënt, presenteren tumoren vergelijkbare morfologische, genomische en biologische eigenschappen aan die waargenomen bij de patiënt. In het geval dat slechts een kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar is voor onderzoekers, zoals vaak voorkomt bij Fna's, zorgt de PDX-techniek voor de uitbreiding van het tumorweefsel v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ of Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquoten bewaard bij –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2.000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	bereid in HBSS-/- uit Collagenase IV poeder stock (Worthington #4189, u/mg aangegeven op de fles en varieert per batch); bewaar 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethyleenglycol bis(2-aminoethylether)-N,N,N’N’-tetraazijnzuur)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicine	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isofluraan	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Kunstmatige extracellulaire matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH Requisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, als pijnstiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Muizen	The Wistar Institute, dierenvoorzieningen		fokkerij
PVA (polyvinylalcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X met L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wondklemmetjes	MikRon	Cat #427631