Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.
Methodenartikel
SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gene Editing nucleasen, vertegenwoordigd door CRISPer-geassocieerde proteïne 9 (Cas9), worden steeds mainstream tools in biomedisch onderzoek. De succesvolle levering van SCHERPEr/Cas9 elementen in de doelcellen door transfectie is een voorwaarde voor efficiënte gen het uitgeven. Dit protocol toont aan dat Tube Electroporation (TE) machine-gemedieerde levering van CRISPer/Cas9 ribonucleoproteã (RNP), samen met single-gestrande oligodeoxynucleotide (ssODN) donor sjablonen voor verschillende soorten zoogdiercellen, leidt tot robuuste precieze gen Editing evenementen. Eerste, te werd toegepast om te leveren SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs te induceren ziekte-veroorzakende mutaties in de interleukin 2 receptor subeenheid gamma (IL2RG) gen en sepiapterin reductase (SPR) gen in konijn fibroblast cellen. Precieze mutatie percentages van 3.57%-20% werden bereikt, zoals bepaald door bacteriële TA klonen sequencing. De zelfde strategie werd toen gebruikt in menselijke iPSCs op verscheidene klinisch relevante genen met inbegrip van epidermale de receptor van de groeifactor (EGFR), myosine bindende proteïne C, hart (Mybpc3), en hemoglobine subeenheid bèta (HBB). Consequent, zeer nauwkeurige mutatie tarieven werden bereikt (11.65%-37,92%) zoals bepaald door diepe sequencing (DeepSeq). Het huidige werk toont aan dat Tube Electroporation van CRISPer/Cas9 RNP een efficiënt transfectie protocol vormt voor het bewerken van genen in zoogdiercellen.
Inleiding
CRISPer/Cas9 is de meest gebruikte programmeerbare Nuclease voor het bewerken van genen. Het werkt door enige gids RNA (sgRNA)-bemiddelde erkenning van beide doel opeenvolgingen en een aangrenzende protospacer aangrenzende Motif (PAM) opeenvolging in het genoom. De Cas9 Nuclease genereert een twee-stranded DNA-break (DSB) gelegen drie nucleotiden stroomopwaarts van de PAM-sequentie1. De DSBs worden gerepareerd, hetzij door middel van foutgevoelige niet-homologe einde toetreden (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR) paden. Voor het bereiken van precieze gen bewerken door middel van de HDR-route, donor sjablonen zijn vaak voorzien in het formaat van plasmide DNA (pDNA) of single-gestrande oligodeoxynucleotide (ssODN).
De scherper/Cas9 en sgRNA kunnen aan de cellen in drie formaten worden geleverd: ribonucleoproteã (RNP) complex van Cas9 proteïne en gRNA2,3; Cas9 mRNA en sgRNA4,5; of plasmide DNA (pDNA) dat de noodzakelijke promotors, gedreven sgRNA, en Cas9 codages gebied6,7,8bevat. Vele groepen hebben aangetoond dat wanneer de SCHERPEr/Cas9 als RNP wordt geleverd, de het bewerkings efficiency van het gen vaak overtreft die bereikt in pDNA of mRNA formaten, toe te schrijven aan de veel kleinere grootte van RNP in vergelijking met Nucleic zuren9. Bovendien is eerder aangetoond dat een nieuwe Tube Electroporation (TE) machine is bijzonder effectief in het bewerken van genen toepassingen in verschillende soorten cellen9.
Gepresenteerd in het huidige werk is een stap-voor-stap protocol in het gebruik van TE voor de levering van SCHERPEr/Cas9 RNP aan zoogdiercellen van verschillende soorten op verschillende klinisch relevante plaatsen. Deze roman TE transfectie techniek en hoge HDR-tarief fenomeen kan vinden brede toepassingen in biomedisch onderzoek.
Protocol
Alle dieren onderhouds-, zorg-en gebruiksprocedures werden herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van de cellen
-
Acquire Human iPSCs (ACS-1030) van de American Type Culture Collection (ATCC). De iPScs van de cultuur op kunstmatige extracellulaire matrijs met voeder-vrij de cultuurmiddel van de cel (zie lijst van materialen) in een incubator van de cel cultuur (5% CO2 bij 37 °c) naar aanleiding van de instructies van de leverancier.
- 2 h voorafgaand aan transfectie, behandel de iPSCs met 10 µ M Rho-geassocieerde, coiled-Coil met eiwitkinase (ROCK) remmer Y27632 (gebruik van die vermindert apoptosis van gescheiden menselijke hiPSCs en verhoogt de overleving en het klonen van de efficiëntie van hiPSCs zonder van invloed zijn op hun pluripotentie).
- Wanneer transfecting, scheidt iPSCs met de oplossing van de detachement van de cel (Zie lijst van materialen) aan enige cellen bij 37 °c 5 min. Tel het aantal van de cel.
-
Vast te stellen een konijn fibroblast Cell cultuur met behulp van een primaire cultuur van konijn oor huidweefsel biopten, zoals eerder beschreven10.
- Een 0,5 cm x 0,5 cm oor huid biopsie wordt verkregen uit het puntje van het konijn oor. Scheer het haar uit het oor weefsel.
- Spoel 2x met Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 5% penicilline-streptomycine. Breng het oor weefsel naar een nieuwe 6 cm weefselkweek schaal, dan snijd het weefsel in kleine stukjes (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Voeg een paar druppels foetale boviene serum om het weefsel te voorkomen uitdrogen.
- Verspreid het versnipperde weefsel naar een 10 cm weefselkweek schaal, voeg dan 10 mL kweekmedium toe. Konijn fibroblast cellen worden gekweekt in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) met 10% foetale boviene serum. Zet het weefselkweek gerecht in de cel kweek incubator (5% CO2 bij 37 ° c).
- Drie tot vijf dagen na het plateren, gebruik trypsine-EDTA om cellen te verteren bij 37 °C voor 2 min. Tel het aantal cellen.
2. ontwerp en synthese van gRNAs en donor oligos
- Voor elk gen, ontwerp gids RNA gebaseerd op de opeenvolging van de gerichte Locus met behulp van een online tool (bijvoorbeeld < http://crispor.tefor.net/>).
- Deeg in de opeenvolging van DNA van belang.
- Selecteer een genoom-en protospacer motief (PAM). Mogelijke gids sequenties in input DNA-sequenties zal worden weergegeven op de outputpagina. Het wordt aanbevolen om gRNA te selecteren met een hoger voorspelde efficiëntie en een lagere off-target potentialen.
- Synthetiseren DNA door een commerciële verkoper voor het transcriberen van gRNAs. Voer in vitro transcriptie van gRNA met behulp van een gRNA synthese Kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuiver de gRNA met behulp van een RNA zuivering microkolom opgenomen in de gRNA synthese Kit. Meet de concentratie en bewaar de gRNAs bij-80 °C.
- Ontwerp een ssODN donor sjabloon voor elke mutatie site. De ssODNs kan worden gesynthetiseerd door commerciële leveranciers zoals IDT. In het algemeen, elke ssODN is 120-160 nucleotiden (NT) in lengte, bestaande uit 60-80 NT in de linker homologie arm en 60-80 NT in de juiste homologie arm. Om het herknipsel van het bewerkte DNA te verhinderen, zou een stille verandering bij PAM in de ssODN moeten worden geïntroduceerd waar mogelijk. De KROKANT gesneden site moet zo dicht mogelijk bij de beoogde genomische verandering worden geplaatst.
3. tube Electroporation van Cas9 RNP en ssODNs
- Bereid de cellen voor zoals beschreven in punt 1.
- Hersuspend 2-3 x 105 cellen in 20 µ l van Electroporation buffer. Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om een enkelvoudige cel suspensie te produceren.
- Voor Cas9 RNP transfectie, premix 2 µ g van Cas9-NLS proteïne met 0,67 µ g van gRNA bij kamertemperatuur (RT) voor 10-15 min. Daarna, meng zacht het gevormde RNP complex samen met 2 µ g van ssODN met cellen.
- Breng de cel mengsel naar een 20 µ L Electroporation buis met behulp van universele pasvorm pipet tips die door de tube Electroporation Kit. Om betere Electroporation te bereiken, probeer om de vorming van luchtbellen tijdens overdracht te vermijden.
- Plaats de Electroporation buis in de sleuf van de electroporator en druk op "Go" om te eindigen. Volg de voorgestelde parameters van de fabrikant voor elk type cel. Bijvoorbeeld, voor menselijke iPSCs en konijn fibroblast cellen, is de voltage reeks 420 V en de impulstijd is 30 Mej. een succesvolle Electroporation cyclus wordt vermeld door het impuls rapport op het vertoningsscherm van electroporator.
- Na de electroporation, de overdracht van de menselijke iPS cellen naar 1 mL van voorverwarmde Y-27632-bevattende cultuurmedium beschreven in cel cultuur deel. Voor konijn fibroblast cellen, breng ze naar DMEM met 10% foetale boviene serum.
- De opnieuw opgeschorte cellen van de plaat aan één goed van een 12 goed de cultuur plaat van de cel.
- Verander de cultuurmedium elke dag. Y-27632 wordt verwijderd uit de menselijke iPSC cultuurmedium 24 h post-Electroporation.
4. analyse van Gene Editing Events
- Oogst cellen 72 h na Electroporation. Verteren cellen van de cultuur plaat met behulp van trypsine-EDTA voor konijn fibroblast cellen of cel detachement oplossing voor menselijke iPSCs. Na centrifugeren, opnieuw op te schorten cellen met 350 mL lysis buffer (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, Voeg 20 µ L van 20 mg/mL proteïnase K voorraad per 1 mL lysis buffer), dan Incubeer bij 55 °C 's nachts.
- Uittreksel het genomic DNA met fenol-chloroform gebruikend standaardprocedures.
- Versterken 100-200 BP DNA-fragmenten met gerichte regio met behulp van High-Fidelity DNA-polymerase, dan zuiveren de DNA-fragmenten van gels met behulp van een gel extractie Kit of rechtstreeks uit PCR producten met behulp van een PCR SV Mini Kit.
- Om te bepalen Gene Editing efficiency door bacteriële kolonie sequencing, ligase de gezuiverde PCR-producten in een pCR4-TOPO vector met behulp van een TOPO TA klonen Kit. Willekeurig pick-up bacteriële klonen, dan volgorde van de inserts met behulp van een universele sequencing primer die door de TOPO TA klonen Kit.
- Om de efficiency van het het bewerken van het gen door het diepe rangschikken te bepalen, verzend de gezuiverde PCR producten (~ 100-200 BP) van stap 4,3 voor het SCHERPEr amplicon rangschikken in een het rangschikken van DNA kern.
Resultaten
Te van Cas9 RNP en ssODNs aan konijn fibroblast cellen
Het algehele proces van TE-gemedieerde levering van Cas9 RNP aan zoogdiercellen wordt geïllustreerd in Figuur 1. Eerste, C231Y en Q235X mutaties werden geproduceerd in het IL2RG gen, en de R150G mutatie werd geproduceerd in de SPR gen in konijn fibroblast cellen. Verlies-van-functie mutaties in IL2RG en SPR genen is bekend dat de primaire immunodeficiëntie11 en motor en cognitieve tekorten veroorzaken12, respectievelijk.
De specifieke sgRNA ontwerpen worden geïllustreerd in Figuur 2a. De primers gebruikt om de beoogde gebieden te versterken zijn opgenomen in tabel 3. Sequenties van ssODNs worden weergegeven in tabel 1. De gene Editing tarieven werden bepaald door bacteriële TA klonen (Figuur 2b). Op de IL2RG C231 Locus, uit de 28 klonen die werden gesequenced, een (3,57%) droeg de nauwkeurige C231Y mutatie, vier (14,28%) verwerkte insertie of schrapping (indeel) mutaties, en de overige 23 (82%) waren wild-type. Op de IL2RG Q235 Locus, van de 27 klonen die werden gesequenced, twee (7,41%) droeg de precieze Q235X mutatie, drie gedragen indeel mutaties (11,11%) en de resterende waren wild-type. Op de SPG R150 Locus, van de 20 gesequenced klonen, vijf (25%) droeg de nauwkeurige R150G mutatie, 10 (50%) gedragen indeel mutaties, en de resterende waren wild-type.
Te van Cas9 RNP en ssODNs aan menselijke iPSCs
Te werd vervolgens gebruikt om Cas9 RNP en ssODNs te leveren aan de menselijke iPSCs en target klinisch relevante plaatsen in EGFR, Mybpc3, en HBB genen. Puntmutaties in de EGFR T790 proximale regio verleent weerstand tegen EGFR tyrosine kinase remmers bij patiënten van niet-kleine cel longkanker (NSCLC) harboring activerende mutaties van EGFR13. Een frame Shift mutatie in Exon 16 in Mybpc3 is betrokken bij Hypertrofische cardiomyopathie14. De E6V punt mutatie in het HBB gen leidt tot Sickle Cell Disease15.
De specifieke sgRNA ontwerpen worden geïllustreerd in Figuur 3a. De primers gebruikt om de beoogde gebieden te versterken zijn opgenomen in tabel 3. Sequenties van ssODNs worden weergegeven in tabel 1. De het bewerken van het gen tarieven werden bepaald door DeepSeq (Figuur 3b). Op de EGFR plaats, 15,68% van allelen droeg de precieze puntmutaties (6.315 leest), 22,75% uitgevoerd indeel mutaties (9.162 leest), en de resterende 61,57% waren wild-type (24.797 leest). Op de Mybpc3 Locus, 37,92% droeg de precieze 4-BP TGAA schrapping (11.654 leest), 2,24% uitgevoerd indeel mutaties (410 leest) en de resterende 59,84% waren wild-type (18.692 leest). Op de HBB Locus, 11,65% droeg de precieze E6V Mutatie (6.565 leest), 23,35% uitgevoerd indeel mutaties (13.163 leest) en de resterende 65% waren wild-type (36.644 leest).
Figuur 1: stroomschema van buis ELECTROPORATION van Cas9 rnp.
Figuur 2 : Gene editing van konijn fibroblast cellen. A illustratie vandedoel sequenties. De dozen wijzen op gerichte plaatsen. De onderstreepte brieven corresponderen met gRNA opeenvolgingen. Rood gekleurde letters geven PAM sequenties. (B) het klonen van Ta resultaten van het bewerken van genen gebeurtenissen. Dozen geven precies gemuteerde plaatsen aan. De getoonde volgorde van indeel is slechts representatief voor één allel type. Andere indeel sequenties worden niet getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Gene editing van menselijke iPSCs. A illustratie vandedoel sequenties. De dozen wijzen op gerichte plaatsen. De onderstreepte brieven corresponderen aan gRNA opeenvolging. Rood gekleurde letters geven PAM sequenties. (B) Deepseq resultaten van Gene Editing Events. Dozen geven precies gemuteerde plaatsen aan. Rood gekleurde letters geven stille mutaties die werden ingevoerd in de donor sjablonen. De getoonde volgorde van indeel is slechts representatief voor één allel type. Andere indeel sequenties worden niet getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Locus |
Oligo sequentie | |||||||
| (gerichte mutatie) | ||||||||
| Konijn IL2RG (C231Y) | AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT | |||||||
| Konijn IL2RG (Q235X) | AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT | |||||||
| Konijn SPR | gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg cgctgtac | |||||||
| (R150G) | ||||||||
| Menselijke EGFR | ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC | |||||||
| (De veranderingen naburige van het punt aan T790) | ||||||||
| Menselijke Mybpc3 | GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT | |||||||
| (4-BP schrapping) | ||||||||
| Menselijke HBB | TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG | |||||||
| (E6V) | ||||||||
Tabel 1: sequenties van ssODNs.
| Stap | Probleem | Mogelijke redenen | Oplossingen |
| 2,1 | Lage indeel rate | Het slechte ontwerp van RNA van de gids, gids de voorraden van RNA > 6 maanden, lage gids de concentratie van RNA | Redesign gids RNA, produceren/bestellen nieuwe gids RNA. |
| 2,3 | Lage PGE efficiency | het slechte ontwerp van DNA van de donor, lage efficiënte gids RNA, onjuiste hoeveelheid donor DNA of slechte kwaliteits DNA | Verhoging homologie wapenlengte, Introduceer PAM mutatie, Introduceer stille mutaties aan de donor DNA, gebruik een efficiëntere gids RNA, Optimaliseer de verhouding van Cas9 proteïne over gids RNA. |
| 3,4 | Mislukte transfectie | Luchtbellen gevormd tijdens de overdracht van cellen-buffer mengsel naar Electroporation buis, onjuiste spanning/duur instelling | Probeer de vorming van luchtbellen te voorkomen, aanpassen van de spanning/duur instelling. |
| 3,6 | Low Cell levensvatbaarheid na Electroporation | Lage overleving van enige menselijke IPSC | Voeg ROCK remmer na electroporation, toename van het aantal cellen. |
| 4,1 | Ontbroken PCR | Hoge GC inhoud, of herhaalde opeenvolging | Optimaliseer PCR voorwaarde, voeg DMSO aan PCR systeem toe. |
Tabel 2: problemen met hulplijnen voor frequente problemen oplossen.
| Primer naam | Volgorde | Opmerking |
| RB-IL2RG-F | CATGACAGTGACAGGGTCCC | Voor het versterken van het fragment van het konijn IL2RG DNA |
| RB-IL2RG-R | TGCCAGAGACACAAGCGAAC | |
| RB-SPR-F | GTACTTTGGAGGGACAGAGG | Voor het versterken van konijn SPR DNA fragment |
| RB-SPR-R | CTCAGCACCCTGACACTGGG | |
| H-EGFR-F | TGATGGCCAGCGTGGACAAC | Voor het versterken van menselijk EGFR DNA fragment |
| H-EGFR-R | ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG | |
| H-Mybpc3-F | ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC | Voor het versterken van menselijk Mybpc3 DNA fragment |
| H-Mybpc3-R | TCAGGGGAGCCAACCCTCAT | |
| H-HBB-F | TAACCTTGATACCAACCTGC | Voor het versterken van menselijk HBB DNA fragment |
| H-HBB-R | CATTTGCTTCTGACACAACT |
Tabel 3: primers gebruikt in stap 4,3.
Discussie
De tube Electroporation methode was effectief in het leveren van SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs aan konijn en menselijke cellen, wat leidt tot robuuste precieze gen editing (PGE). Het primaire verschil tussen TE en andere conventionele Electroporation apparaten is het gebruik van een buis, waarin twee elektroden op de boven-en onderkant van de buis en het monster wordt geladen in volle dan verzegeld op Electroporation (Figuur 1). In een conventioneel Cuvette zijn de elektroden daarentegen aan de zijkanten en wordt het monster niet volledig afgedicht tijdens de Electroporation. Dit nieuwe ontwerp vermindert luchtbellen generatie en comprimeert luchtbellen grootte, die bijgevolg verbetert gelijkmatige verdeling van elektrische spanning, en als gevolg leidt tot verminderde celdood en hoge transfectie efficiëntie9. In het huidige werk, hoge PGE tarieven (15%-37%) werden bereikt gericht op EGFR, Mybpc3 en HBB genen in de menselijke iPSCs. Deze resultaten zijn in overeenstemming met een voorafgaand rapport waarin hoge PGE tarieven werden bereikt in menselijke stamcellen9.
De ziekte-veroorzakende veranderingen werden gericht in IL2RG en SPR genen in konijn cellen. Onlangs, IL2RG-knock-out konijnen zijn geproduceerd als modellen voor menselijke X-gebonden ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID-x1)16,17. De huidige werk toont aan dat de patiënt IL2RG mutaties (bijv. C231Y en Q235X) efficiënt kan worden gegenereerd in konijn cellen, waaruit blijkt dat de haalbaarheid van het creëren van SCID-x1 konijn modellen die patiënt mutaties. Het was ook aangetoond dat SPR R150G mutaties efficiënt kan worden gemaakt in konijn cellen. Deze mutatie veroorzaakt motorische en cognitieve tekorten bij kinderen12. Deze IL2RG en SPR mutatie konijn modellen, eenmaal gegenereerd, kunnen dienen als waardevolle preklinische modellen voor translationele studies. Zij kunnen ook worden gebruikt om Gene Editing-based therapeutische voor deze monogene ziekten vast te stellen.
Een zorg voor SCHERPEr/Cas9-gemedieerde gen editing toepassingen is de off-target Editing evenementen. Indeel tarieven werden geanalyseerd op voorspelde top off-target sites voor sgRNAs gebruikt in deze studie (tabel S1), met behulp van methoden eerder beschreven9. In totaal, zeven potentiële top off-target plaatsen werden geanalyseerd voor SG-rb-IL2RG-01, vijf voor SG-rb-SPR, Seven voor SG-hEGFR, vijf voor SG-hMybpc3, en Seven voor SG-hHBB), met behulp van de primers vermeld in tabel S2. Geen off-target indels werden onthuld door de T7E1 assays (figuur S1), met vermelding van minimale off-target Risico's voor de scherper/Cas9-gemedieerde gen bewerken met behulp van deze sgRNAs. Het geeft ook aan dat de tube Electroporation methode zelf niet veroorzaken of te verhogen off-target bewerkingen. Toch moeten inspanningen worden besteed aan het verminderen of elimineren van ongewenste off-target bewerkingen. Whole-genoom sequencing kan nodig zijn om dergelijke gebeurtenissen voor cellen die bestemd zijn om te worden gebruikt in klinische toepassingen uit te sluiten.
Op technisch niveau, worden de volgende beschouwd als belangrijke factoren aan het bereiken van efficiënte nauwkeurige genoom het uitgeven door SCHERPEr/Cas9 RNP buis Electroporation. Ten eerste wordt geadviseerd om een efficiënte sgRNA met voorspelde lage off-target potentieel te selecteren. Het is belangrijk om de inder efficiency van de geselecteerde sgRNA te valideren alvorens het voor PEG toepassingen te gebruiken. Het is niet zeldzaam dat een software voorspelde goede sgRNA faalt bij de validatie stap.
Ten tweede, om hoge PGE te bereiken, wordt het geadviseerd om een PAM verandering aan de ssODN donor waar mogelijk te veroorzaken. De reden is dat door dit te doen, SCHERPEr/Cas9 re-Cutting na donor template integratie wordt voorkomen. In bepaalde gevallen introduceert de PGE zelf PAM mutaties. In andere gevallen is het mogelijk om stille mutaties te introduceren in de PAM volgorde. In het geval dat een PAM mutatie niet mogelijk is, is het raadzaam om verschillende stille mutaties in de donor die overeenkomt met de sgRNA sequentie op te nemen.
Ten derde, bijzonder relevant voor te, is het belangrijk om de vorming van luchtbellen te vermijden wanneer het overbrengen van cellen en RNP mengsel aan de Electroporation buis. Terwijl het ontwerp van een TE buis al minimaliseert luchtbellen vorming, zal zorgvuldige behandeling verder te verminderen en kan zelfs volledig te voorkomen luchtbellen vorming. Een Trouble Shooting gids voor frequente problemen die kunnen worden aangetroffen bij de toepassing van Tube Electroporation voor de SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã gemedieerde nauwkeurige verwerking van genen is voorzien in tabel 2.
Tot slot wordt hier aangetoond dat Tube Electroporation een effectief middel is voor de levering van SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs aan zoogdiercellen om hoge PGE tarieven te bereiken. Deze nieuwe TE transfectie techniek en zijn robuuste precieze Gene Editing rate kan vergemakkelijken de ontwikkeling van Gene editing toepassingen.
Openbaarmakingen
J. C. de werken bij Celetrix LLC, fabrikant van de buis electroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C., en J. X. verklaar geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid (R21OD023194 aan JX). Dit werk gebruikt kerndiensten ondersteund door het centrum voor geavanceerde modellen voor translationele wetenschappen en therapeuten (CAMTraST) aan de Universiteit van Michigan Medical Center.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Celdetaching oplossing voor humane iPSC's, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1.2. |
| Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 eiwit, voor het eerst gebruikt in Stap 3.3. |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.3. |
| DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | Voor het bereiden van celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.2. |
| EDTA | Lonza | 51201 | Voor het maken van lysisbuffer, voor het eerst gebruikt in Stap 4.1. |
| Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | De elektroporatiebuffer, voor het eerst gebruikt in Stap 3.2. |
| Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | De elektroporatiebuis, voor het eerst gebruikt in Stap 3.4. |
| Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | De buiselektroporatiemachine, voor het eerst gebruikt in Stap 3.5 |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.2. |
| Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1. |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | Voor gelzuivering, voor het eerst gebruikt in Stap 4.3. |
| Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Humane iPSC's, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1. |
| Matrigel | Corning | 354277 | Kunstmatige extracellulaire matrix; voor het voorcoaten van celkweekplaat, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1. |
| mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-vrij celkweekmedium voor humane iPSC's, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1. |
| PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | Voor PCR-productzuivering, voor het eerst gebruikt in Stap 4.3. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | Voor het bereiden van celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.2. |
| Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | Voor DNA-extractie, voor het eerst gebruikt in Stap 4.2. |
| Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | Voor de generatie van volledige gRNA (geleid RNA), voor het eerst gebruikt in Stap 2.4. |
| Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | Voor DNA-extractie, voor het eerst gebruikt in Stap 4.1. |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | Voor PCR-amplificatie, voor het eerst gebruikt in Stap 4.3. |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Voor het maken van lysisbuffer, voor het eerst gebruikt in Stap 4.1. |
| TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | Voor TA-kloneringssequencing, voor het eerst gebruikt in Stap 4.4. |
| Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.3. |
| Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 3.7. |
| Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | Voor celkweek, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2.2. |
| Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | Voor het maken van lysisbuffer, voor het eerst gebruikt in Stap 4.1. |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | Voor celdigestie, voor het eerst gebruikt in Stap 1.2. 4. |
| Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | Voor elektroporatie, voor het eerst gebruikt in Stap 3.4. |
| Y27632 | LC Labs | Y-5301 | De apoptose-inhibotor, voor het eerst gebruikt in Stap 1.1.1. |
Referenties
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
- Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
- Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
- Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
- Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).
- Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
- Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
- Friedman, J., et al. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
- Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
- Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).
- Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).
Herprints en machtigingen
