Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

36K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59519

⸱

16 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Gekweekte primaire of gevestigde cel lijnen worden vaak gebruikt om fundamentele biologische en mechanistische vragen als een eerste aanpak aan te pakken voor het gebruik van dierlijke modellen. Dit protocol beschrijft hoe u hele cel extracten en subcellulaire fracties voor de studies van zink (Zn) en andere sporenelementen met atomaire absorptiespectroscopie voor te bereiden.

Samenvatting

Overgang metalen zijn essentiële micronutriënten voor organismen, maar kan giftig zijn voor cellen bij hoge concentraties door te concurreren met fysiologische metalen in eiwitten en het genereren van redox stress. Pathologische omstandigheden die leiden tot uitputting van metaal of accumulatie zijn oorzakelijke agentia van verschillende ziekten van de mens. Enkele voorbeelden zijn anemie, acrodermatitis enteropathica, en Wilson en Menkes ' ziekten. Het is daarom belangrijk om de niveaus en het vervoer van overgangsmetalen in biologische monsters met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te kunnen meten om onderzoek te vergemakkelijken om te onderzoeken hoe deze elementen bijdragen tot normale fysiologische functies en Toxiciteit. Zink (Zn), bijvoorbeeld, is een cofactor in veel zoogdieren eiwitten, participeert in signalering gebeurtenissen, en is een secundaire boodschapper in cellen. In overmaat, is Zn giftig en kan absorptie van andere metalen remmen, terwijl in tekort, het tot een verscheidenheid van potentieel dodelijke voorwaarden kan leiden.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectroscopie (GF-AAS) biedt een zeer gevoelige en effectieve methode voor het bepalen van Zn en andere overgang metaal concentraties in diverse biologische monsters. Elektrothermische verneveling via GF-AAS kwantificeert metalen door atomiseren kleine hoeveelheden monsters voor de daaropvolgende selectieve absorptie analyse met behulp van golflengte van excitatie van het element van belang. Binnen de grenzen van de lineariteit van de bier-Lambert wet, de absorptie van licht door het metaal is direct evenredig aan de concentratie van de analyt. Vergeleken met andere methoden om Zn content te bepalen, detecteert GF-AAS zowel vrije als gecomplexeerde Zn in eiwitten en mogelijk in kleine intracellulaire moleculen met een hoge gevoeligheid in kleine sample volumes. Bovendien, GF-AAS is ook gemakkelijker toegankelijk dan inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of synchotron-based X-Ray fluorescentie. Bij deze methode wordt de systematische monstervoorbereiding van verschillende gekweekte cel lijnen voor analyses in een GF-AAS beschreven. Variaties in dit spoorelement werden vergeleken in zowel hele cel lysaten en subcellulaire fracties van proliferatie en gedifferentieerde cellen als bewijs van principe.

Inleiding

Overgang en zware metalen, zoals Zn, Cu, MN, en Fe, zijn van nature in het milieu gevonden in zowel voedingsstoffen in voedsel en verontreinigende stoffen. Alle levende organismen vereisen verschillende hoeveelheden van deze micronutriënten; echter, blootstelling aan hoge niveaus is schadelijk voor organismen. Metal acquisitie is voornamelijk door het dieet, maar metalen kunnen ook worden ingeademd of geabsorbeerd door de huid1,2,3,4,5. Het is belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van metalen in atmosferische deeltjes neemt toe en is grotendeels geassocieerd met gezondheidsrisico's. Wegens antropogene activiteiten, zijn de verhoogde niveaus van zware metalen zoals AG, zoals, cd, CR, Hg, ni, Fe, en PB ontdekt in atmosferische deeltjes kwestie, regenwater, en grond6,7. Deze metalen hebben het potentieel om te concurreren met essentiële fysiologische sporenelementen, met name Zn en Fe, en ze veroorzaken toxische effecten door het inactiveren van fundamentele enzymen voor biologische processen.

Het spoorelement Zn is redox neutraal en gedraagt zich als een Lewis zuur in biologische reacties, waardoor het een fundamentele cofactor die nodig is voor eiwit vouwen en katalytische activiteit in meer dan 10% van zoogdieren eiwitten8,9, 10; Bijgevolg is het essentieel voor diverse fysiologische functies8,11. Echter, net als vele sporenelementen, is er een delicaat evenwicht tussen deze metalen vergemakkelijken van de normale fysiologische functie en het veroorzaken van toxiciteit. Bij zoogdieren, Zn tekortkomingen leiden tot anemie, groeivertraging, hypogonadisme, huidafwijkingen, diarree, alopecia, smaakstoornissen, chronische ontsteking, en verminderde immuun-en neurologische functies11,12, 13,14,15,16,17,18. In overmaat, Zn is chemo en schaadt de absorptie van andere essentiële metalen zoals koper19,20,21.

Bovendien, sommige metalen zoals Cu en FE hebben het potentieel om deel te nemen aan schadelijke reacties. Productie van reactieve zuurstof soorten (Ros) via Fenton chemie kan interfereren met de assemblage van ijzerzwavel cluster eiwitten en Alter lipide metabolisme22,23,24. Om deze schade te voorkomen gebruiken cellen metaal-bindende chaperones en transporteurs om toxische effecten te voorkomen. Ongetwijfeld, metaal homeostase moet strak worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat specifieke soorten cellen te handhaven goede niveaus van metalen. Om deze reden, is er een significante behoefte om technieken voor nauwkeurige meting van spoormetalen in biologische steekproeven vooruit te gaan. Bij het ontwikkelen en rijpen van organismen bestaat er een differentiële biologische behoefte aan sporenelementen op cellulair niveau, in verschillende ontwikkelingsstadia, en in normale en pathologische omstandigheden. Daarom, nauwkeurige bepaling van weefsel en systemische metaal niveaus is noodzakelijk om organisch metaal homeostase te begrijpen.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectrometrie (GF-aas) is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor kleine monster volumes, waardoor het ideaal is om de overgang en zware metalen aanwezig zijn in biologische en milieu-monsters te meten25,26 , 27 , 28. Bovendien is het vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek aangetoond dat het geschikt is voor het bestuderen van de fijne transport eigenschappen van na+/K+-ATPase en maag H+/K+-ATPase met behulp van Xenopus oöcyten als modelsysteem29. In GF-AAS, absorberen de verstoven elementen binnen een steekproef een golflengte van straling die door een lichtbron wordt uitgezonden die het metaal van belang bevat, met de geabsorbeerde straling evenredig aan de concentratie van het element. Elementaire elektronische excitatie vindt plaats bij absorptie van ultraviolette of zichtbare straling in een gequanteerd proces uniek voor elk chemisch element. In een enkel elektron proces, de absorptie van een foton gaat om een elektron verplaatsen van een lager energieniveau naar een hoger niveau binnen het Atoom en GF-AAS bepaalt de hoeveelheid fotonen geabsorbeerd door het monster, dat evenredig is aan het aantal straling absorberen elementen verstoven in de grafiet buis.

De selectiviteit van deze techniek berust op de elektronische structuur van de atomen, waarin elk element een specifieke absorptie/emissie spectrale lijn heeft. In het geval van Zn, de absorptie golflengte is 213,9 nm en kan precies worden onderscheiden van andere metalen. Globaal, kan GF-AAS worden gebruikt om Zn met adequate grenzen van opsporing (LOD) en hoge gevoeligheid en selectiviteit25te kwantificeren. De veranderingen in de geabsorbeerde golflengte zijn geïntegreerd en gepresenteerd als pieken van energie-absorptie op specifieke en geïsoleerde golflengten. De concentratie van de Zn in een bepaald monster wordt meestal berekend op basis van een standaardkromme van bekende concentraties volgens de wet bier-Lambert, waarbij de absorptie direct evenredig is met de concentratie van Zn in het monster. Echter, de toepassing van de beer-Lambert vergelijking met GF-AAS analyses presenteert ook een aantal complicaties. Bijvoorbeeld, variaties in de verneveling en/of niet-homogene concentraties van de monsters kan invloed hebben op de metalen metingen.

De metalen verneveling vereist voor GF AAS Trace Elemental Analysis bestaat uit drie fundamentele stappen. De eerste stap is desolvatie, waar het vloeibare oplosmiddel wordt verdampt; het verlaten van droge verbindingen na de oven bereikt een temperatuur van rond 100 °C. Vervolgens worden de verbindingen verdampt door ze te verwarmen van 800 tot 1.400 °C (afhankelijk van het te analyseren element) en een gas te worden. Tot slot, de verbindingen in de gasvormige staat zijn verstoven met temperaturen die variëren van 1.500 tot 2.500 ° c. Zoals hierboven besproken, zal het verhogen van de concentraties van een metaal van belang evenredige stijgingen van de absorptie gedetecteerd door de GF-AAS, maar de oven vermindert het dynamisch bereik van de analyse, dat is het werkbereik van concentraties die kunnen worden bepaald door het instrument. Zo, de techniek vereist lage concentraties en een zorgvuldige bepaling van het dynamisch bereik van de methode door het bepalen van de LOD en de grens van lineariteit (LOL) van de beer-Lambert wet. De LOD is de minimumhoeveelheid die nodig is om een stof te kunnen detecteren, gedefinieerd als drie maal de standaarddeviatie van Zn in de matrix. De LOL is de maximale concentratie die kan worden gedetecteerd met behulp van bier-Lambert wet.

In dit werk beschrijven we een standaardmethode om de niveaus van Zn te analyseren in hele cel extracten, cytoplasma en nucleaire fracties, en in het verspreiden en differentiëren van gekweekte cellen (Figuur 1). We hebben de snelle isolatie van kernen protocol aangepast aan verschillende cellulaire systemen om metaal verlies te voorkomen tijdens het monster voorbereiding. De gebruikte cellulaire modellen waren primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, muizen neuroblastoma cellen (N2A of Neuro2A), muizen 3T3 L1 adipocyten, een menselijke niet-tumorigenic borst epitheel cel lijn (MCF10A), en epitheel Madin-Darby de Honds nier ( MDCK) cellen. Deze cellen werden gevestigd van verschillende lineages en zijn goede modellen voor het onderzoeken van Lineage specifieke variaties van metaal niveaus in vitro.

Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen vormen een goed geschikt in vitro model om skeletspier differentiatie te onderzoeken. De proliferatie van deze cellen is snel wanneer gekweekt onder hoge serum voorwaarden. Differentiatie in de gespierde afstamming wordt vervolgens geïnduceerd door lage serum condities30. De muizen neuroblastoma (N2A) gevestigde cel lijn werd afgeleid van de muis neurale kuif. Deze cellen aanwezig neuronale en amoeboid stamcel morfologie. Bij differentiatie stimulus, de N2A cellen presenteren verschillende eigenschappen van neuronen, zoals neurofilaments. N2a cellen worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te onderzoeken, neuriet uitgroei, en neurotoxiciteit31,32,33. De 3T3-L1 muizen pre-adipocyten gevestigde cel lijn wordt vaak gebruikt om de metabole en fysiologische veranderingen in verband met adipogenesis te onderzoeken. Deze cellen presenteren een fibroblast-achtige morfologie, maar eenmaal gestimuleerd voor differentiatie, ze presenteren enzymatische activering geassocieerd met lipide synthese en triglyceriden accumulatie. Dit kan worden waargenomen als morfologische veranderingen te produceren cytoplasma lipide druppeltjes34,35. MCF10A is een niet-tumor borstklier epitheel cel lijn afgeleid van een premenopauzale vrouw met borstkanker fibrocystische ziekte36. Het is op grote schaal gebruikt voor biochemische, moleculaire, en cellulaire studies met betrekking tot borst carcinogenese zoals proliferatie, cel migratie, en invasie. De Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheel cel lijn is uitvoerig gebruikt om de eigenschappen en moleculaire gebeurtenissen in verband met de oprichting van de epitheel fenotype te onderzoeken. Bij het bereiken van samenvloeiing, deze cellen worden gepolariseerd en vast te stellen cel-cel adhesies, kenmerken van zoogdier epitheelweefsels37.

Om het vermogen van AAS te testen om de niveaus van Zn in zoogdiercellen te meten, analyseerden we hele en subcellulaire fracties (cytosol en Nucleus) van deze vijf cel lijnen. AAS metingen toonden verschillende concentraties van Zn in deze cel types. De concentraties waren lager in het vermenigvuldigen en het onderscheiden van primaire myoblasten (4 tot 7 nmol/mg van proteïne) en hoger in de vier gevestigde cel lijnen (die zich van 20 tot 40 nmol/mg van proteïne uitstrekken). Een kleine niet-significante stijging van Zn niveaus werd ontdekt in het onderscheiden van primaire myoblasten en neuroblastoma cellen in vergelijking met het vermenigvuldigen van cellen. Het tegenovergestelde effect werd ontdekt in onderscheiden adipocyten. Nochtans, vertoonden de vermenigvuldigende 3T3-L1 cellen hogere concentraties van het metaal in vergelijking met onderscheiden cellen. Belangrijk, in deze drie cel lijnen, subcellulaire fractionering toonde aan dat Zn is gedifferentieerd verdeeld in de cytosol en de kern volgens de metabole toestand van deze cellen. Bijvoorbeeld, in het verspreiden zich myoblasten, N2A cellen, en 3T3-L1 pre-adipocyten, is een meerderheid van het metaal gelokaliseerd aan de kern. Bij de inductie van differentiatie met behulp van specifieke cel behandelingen, Zn gelokaliseerd om de cytosol in deze drie soorten cellen. Interessant is dat beide epitheelcellen hogere niveaus van Zn toonden tijdens de proliferatie in vergelijking met bij het bereiken van samenvloeiing, waarin een karakteristieke strakke monolayer werd gevormd. In de proliferatie van Epitheelcellen, de borstklieren cel lijn MCF10A had een gelijke Zn verdeling tussen de cytosol en de kern, terwijl in de nier-afgeleide cel lijn, het grootste deel van het metaal was gelegen in de kern. In deze twee cellen, toen de cellen samenvloeiing bereikten, was Zn voornamelijk gelegen aan de cytosol. Deze resultaten tonen aan dat GF-AAS is een zeer gevoelige en accurate techniek voor het uitvoeren van elementaire analyse in lage opbrengst monsters. GF-AAS in combinatie met subcellulaire fractionering en kan worden aangepast aan de niveaus van sporenmetalen elementen in verschillende cellen en weefsels te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. zoogdiercellen cultuur

  1. Algemene overwegingen
    1. Volg de aseptische technieken voor zoogdiercellen cultuur eerder beoordeeld38.
    2. Handhaaf alle cel lijnen in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °c. De voorwaarden voor de cultuur van cellen verschillen per type cel. Het is belangrijk om de juiste cultuur voorwaarden te handhaven voor elke gebruikte cel lijn, als variaties van deze procedures zal leiden tot afwijkende fenotypes en falen van de cel cultuur.
    3. Zorg ervoor dat kennis met de cel lijn van belang, en volg de protocollen die voor elk type cel geselecteerd voor specifieke experimenten (zie enkele voorbeelden hieronder).
  2. Algemene procedure voor trypsinization en het doorgeven van aanhangende cellen
    1. Verwijder de cel cultuurmedia van de kweek plaat door aspiratie.
    2. Was de cellen voorzichtig met behulp van PBS zonder calcium en magnesium (5 mL per 10 cm2 cultuur oppervlakte). Voeg de Wash oplossing aan de zijkant van de plaat om te voorkomen dat ontkoppelen cel monolayer; Swirl de plaat om dekking van de oplossing te maximaliseren. Voor Epitheelcellen, is het noodzakelijk om de cellen incuberen voor 10 tot 15 min in de incubator op 37 ° c in PBS om de dissociatie van cellen te vergemakkelijken in de volgende stappen.
    3. Verwijder de wassen oplossing door aspiratie.
    4. Voeg voldoende dissociatie reagens (0,25% trypsine) toe aan de plaat (ongeveer 0,7 mL per 10 cm2). Zachtjes wervelen de plaat om volledige dekking van de cel monolayer te krijgen.
    5. Incubeer de cultuur bij kamertemperatuur voor 2 tot 5 min. De werkelijke incubatietijd varieert met de gebruikte cel lijn, in het geval van epitheelcellen wordt aanbevolen om incuberen voor 10 tot 15 min in de incubator op 37 ° c. Observeer de cellen onder de Microscoop voor cel loslating.
    6. Wanneer de meeste cellen zijn losgemaakt, herstelt u de cel schorsing in 5 mL van de voorverwarmde plating of groeimedium (zie hieronder voor enkele voorbeelden). Mechanisch scheiden cel bosjes door het pipetteren over de cel monolayer meerdere malen.
    7. Breng de schorsing van de cel over op een conische buis van 15 mL en centrifugeer ze bij 1.000 x g voor 2 tot 5 minuten. De snelheid van de centrifuges en de tijd variëren op basis van het type cel. Verwijder de media door zachte aspiratie, die oppassen niet aan de cel pellet touch. Hersuspendeer de cel pellet in 5 tot 10 mL van de juiste voorverwarmde groeimedium en verwijder een monster voor het tellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
    8. Gebruik maken van de juiste volume van de cel schorsing om de aanbevolen dichtheid zaad voor elke specifieke cel lijn (zie hieronder voor enkele voorbeelden). Supplement met het voldoende volume van de cultuurmedia volgens de grootte van de cultuur schotel en plaats de cellen terug in de incubator.
  3. Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen
    1. Voor de aanvang, bereid collageen-gecoate platen voor primaire Myoblast groei. Een oplossing met 0,02% collageen, en 0,05 M azijnzuur in deioniseerde water moet worden gesteriliseerd door filtratie met een 0,22 µm steriel filterapparaat. Incubeer de kweek platen met de collageen oplossing overnachting bij 37 °C.
    2. Op de volgende dag, aspireren de collageen oplossing, laat de platen aan de lucht drogen in de steriele kast en op te slaan bij 4 ° c tot het gebruik.
      Nota: de minimale volumes van collageen zijn: voor 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Zaad primaire myoblasten op 1 x 104 cellen/cm2 in 55 cm2 collageen-gecoate kweek platen. De proliferatie media is Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)/Ham F12 nutriënten mengsel cultuurmedia met 20% foetale boviene serum (FBS), 25 ng/mL van recombinant Basic fibroblastic growth factor (FGF), en 100 U/mL van penicilline/streptomycine.
      Opmerking: proliferatie en Stock cellen moeten worden gehandhaafd onder 50% van de confluentie. Het contact van de cel veroorzaakt verplichting van de cellen aan myogene differentiatie en schaadt de de groei capaciteiten van de cultuur.
    4. Voor het differentiëren van de primaire myoblasten, laat de cellen te bereiken 80% tot 100% confluentie, die normaliter optreedt na 48 h van plating. Dan, verandering in differentiatie media (DMEM, 2% het serum van het paard, 1% insuline, transferrin, selenium een supplement, en 100 U/mL van penicilline/streptomycine). Vernieuw de media dagelijks tot de oogst.
  4. Muizen neuroblastoma (N2A)
    1. Plaat N2A cellen met een dichtheid van 2 x 104 cellen/cm2 in de groeimedia, met een mengsel van verminderde serum medium/DMEM met hoge glucose en L-glutamine (1:1, v:v), aan te vullen met 10% FBS en 100 U/ml van penicilline/streptomycine. Behoud van de voorraad cultuur onder 50% confluentie.
    2. Induceren differentiatie van N2A cellen eenmaal confluentie bereikt 25% tot 40%. Verandering in differentiatie media die een mengsel van verminderd-serum middel/DMEM, 1% FBS, en 20 µ M retinol zuur 7 tot 10 dagen bevatten. Vernieuw de media om de andere dag tot cel oogst.
      Nota: aangezien de N2A cellen onderscheiden, worden sommige cellen rond, losmaken gemakkelijk, en kunnen apoptosis ondergaan. Wees voorzichtig bij het opzuigen en het toevoegen van de cultuurmedia aan de platen.
  5. 3T3 L1 muizen pre-adipocyten
    1. Handhaaf muis 3T3/L1 cellen in DMEM met hoge glucose, aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL van penicilline/streptomycine. Het adipogenic proces is afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen; Daarom, laat de voorraad cultuur groeien meer dan 50% confluentie, als een hogere samenvloeiing zal het vermogen van de cellen te differentiëren schaden.
    2. Plaat de cellen op 2 x 104 cellen/cm2. Bij deze dichtheid, zullen de cellen samenloop in 3 dagen bereiken.
    3. Induceren adipogenic differentiatie twee dagen na de cellen te bereiken 100% confluentie. De media van de inductie bestaat uit DMEM bevattend 10% FBS, 10 μg/mL insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine, 1 μM dexamethason, en 10 μM troglitazone.
    4. Vervang de inductie media na 48 h incubatie naar differentiatie media (DMEM met 10% FBS, en 5 μg/mL insuline). Vernieuw de media om de andere dag tot de oogst. Representatieve monsters van volledige differentiatie worden normaalgesproken verzameld tussen 7 en 10 dagen na adipogenic inductie.
      Nota: aangezien adipogenesis vordert, worden de cellen rond en neigen gemakkelijk los te maken. Wees voorzichtig bij het opzuigen en het toevoegen van de cultuurmedia aan de platen.
  6. MCF10A cellen
    1. Plaat MCF10A cellen in DMEM/F12 (1:1, v:v), aangevuld met 5% FBS, 100 U/mL penicilline/streptomycine, 0,5 µ g/mL hydrocortison, 10 µ g/mL insuline, en 20 ng/mL epidermale groeifactor (EFG). Aanbevolen zaai dichtheid is 1 x 105 cellen/cm2. Onder deze omstandigheden zullen de cellen bereiken 100% confluentie binnen 4 dagen. Vernieuw de media om de 2 tot 3 dagen tot de oogst.
      Opmerking: MCF10A cellen zijn moeilijk los te maken. Het wordt aanbevolen om de cellen incuberen voor 10 tot 15 min bij 37 ° c in PBS vrij van calcium met 0,5 mM EDTA voorafgaand aan trypsinization.
  7. Michielsen-Darby Canine nier cellen (MDCK)
    1. Plaat MDCK cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL van penicilline/streptomycine. Aanbevolen zaaien dichtheid is 1 x 105 cellen/cm2, waar de cellen zal bereiken 100% confluentie binnen 3 dagen. Vernieuw de media om de 2 dagen tot de oogst.
      Opmerking: MDCK cellen zijn moeilijk los te maken. Het wordt aanbevolen om de cellen incuberen voor 5 tot 10 min bij 37 ° c in PBS vrij van calcium en magnesium voorafgaand aan trypsinization. Om te voorkomen dat cel klonteren niet roeren de platen door te raken of schudden van de kolf tijdens het wachten voor de cellen te ontkoppelen.

2. zoogdiercellen cultuur sample voorbereiding voor AAS: hele cel en subcellulaire fractionering

  1. Cultuur de cellen van belang in 55 cm2 platen. Het gebruik van kleinere cultuur platen kan opleveren monsters met een niveau van metalen onder de detectiegrenzen van de GF-AAS.
  2. Hele cel extract
    1. Aspireren de cultuurmedia met behulp van een vacuüm val. Zorg ervoor dat alle sporen van de media te verwijderen. Spoel de cellen van de gewenste tijdpunten of cultuur voorwaarden drie keer met ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium.
    2. Schraap onmiddellijk de cellen van de plaat met behulp van een nieuwe plastic cel schraper in 1 mL PBS vrij van calcium en magnesium. Breng het monster over naar een 1,5 mL micro centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.000 x g en aspireren de bovendrijvende. Het protocol kan hier worden onderbroken. Store pellet monsters bij-20 ° c of ga verder met stap 2,4.
  3. Subcellulaire fractionering
    1. Aspireren de cultuurmedia met behulp van een vacuüm val. Zorg ervoor dat alle sporen van de media te verwijderen. Spoel de cellen van de gewenste tijdpunten of cultuur voorwaarden drie keer met ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium. Schraap de cellen van de plaat met 1 mL ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium.
    2. Breng de monsters naar een 1,5 mL micro centrifugebuis en houden op ijs. Centrifugeer voor 10 s bij 10.000 x g. Doorgaan snelle isolatie van kernen als metaalanalyse van cytoplasma en kern fracties gewenst is. Deze procedure zal het potentiële verlies van metalen als gevolg van de extractie van cellen39, 40te minimaliseren.
    3. Verwijder de bovendrijvende door aspiratie en hersuspendeer de cel pellet in 400 l van ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium, bevattende 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), een niet-ionische wasmiddel. Breng 100 l naar een nieuwe micro centrifugebuis en beschouw het als de hele cel monster. Deze hoeveelheid vertegenwoordigt 25% van het monster.
    4. Isoleren kernen door het pipetteren van de cel schorsing 5 tot 10 keer op het ijs met een P1000 micropipet tip. Kernen isolatie van epitheelcellen vereist een concentratie van 0,5% NP-40. Bereik cel dissociatie door het passeren van de cel schorsing door middel van een 26 ¾ G naald 10 tot 15 keer, gevolgd door 10 tot 15 passages door middel van een 30 ½ G naald.
      Opmerking: Controleer de kernen integriteit door Lichtmicroscopie met behulp van een 40x doelstelling.
    5. Centrifugeer de resterende cel lysate suspensie (300 l) voor 10 s bij 10.000 x g. De bovendrijvende zal de cytosolische Fractie bevatten. Breng de 300 l over naar een nieuwe micro centrifugebuis.
    6. Spoel de pellet met de kern Fractie in 500 l, zonder calcium en magnesium, met 0,1% NP-40, centrifugeer vervolgens voor 10 s bij 10.000 x g. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet met de kernen in 100 l van dezelfde oplossing.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° c.
  4. Lyse de cellen door drie sonische cycli (30 s op/30 s weg, bij 50 kHz, 200 W) 5 min. kwantificeren totaal eiwitgehalte in de steekproef door Bradford41.
  5. Voer kwaliteitscontrole van de zuiverheid van de fracties door westelijke vlek uit gebruikend antilichamen specifiek voor of kern (histonen, chromatin remodellerers, kern matrijs proteïnen) of cytosolische fracties (β-tubulin, β-actine) (Figuur 2).
    Opmerking: gebruik geen sonicators met een metalen tip. Deze kunnen de steekproef met metalen vervuilen.

3. Zn content analyse van hele cel en subcellulaire fracties van zoogdiercellen culturen door atomaire absorptiespectroscopie

  1. Mineraliseren de monsters van de cel cultuur (gehele cel of kern fracties) door zure spijsvertering gebruikend een gelijk volume van geconcentreerde HNO3 de rang van het spoor metaal (voorzichtigheid) voor 1 h bij 80 °c, dan overnachten bij 20 °c.
  2. Stop de reactie door 30% van het reactievolume van H2O 2 toe te voegen. Breng het sample volume naar 500 l met 18 MΩ gezuiverd water.
    Opmerking: HNO3 behandeling moet worden gedaan dragen van chemische veiligheidsbril, een gezicht schild voor spatbescherming, handschoenen, en een goedgekeurde damp masker als adequate ventilatie (rook kap) is niet beschikbaar. Het protocol kan hier worden onderbroken. Monsters kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT).
  3. Bereid standaard oplossingen en experimentele monsters voor Zn metingen door AAS uitgerust met een grafietoven.
    1. Gebruik 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water, afkomstig uit dezelfde partij gebruikt voor de standaard curve als de blanco oplossing voor kalibratie in. Gebruik analytische graad normen verdund in 18 MΩ gezuiverd water.
    2. Maak een standaard van 1.000 ppb van Zn uit een commercieel verkrijgbare 1.000 ppm Zn stockoplossing met 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water. Bereid werk standaard oplossingen van de 100 ppb standaard door het te verdunnen tot 5, 8, 10, 15, 20, en 25 ppb direct met 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water. Bereid de Zn normen en de blanco met een 0,1% (1 g/L) mg (nr.3)2 matrix modifier.
      Opmerking: de LOD van Zn is 0,01 ppb (µ g/L). Door de concentratie van de normen te verhogen, werd de grens van de lineariteit van Zn vastgesteld op 20 ppb (Figuur 3).
    3. Meetnorm en steekproeven onder de zelfde geoptimaliseerde voorwaarden: het tarief van de stroom van inleiding van 250 mL/min, injectie temperatuur van 20 °C, en GF temperatuur van 1.800 °C.
      Opmerking: de GF temperatuur werd verhoogd tot 2450 ° c voor cleanout stappen, voorafgaand aan de injectie van een nieuw monster of standaard.
    4. Optimaliseer de lamp (C-HCL) tot een stroom van 20 A, golflengte van 213,9 nm, en spleet van 0,7 nm.
    5. Meet de minerale monsters met behulp van de Zn standaard curve om metalen inhoud te bepalen. Aangezien de kleine volumes worden gemeten, kunnen de steekproeven verdampen als de metingen lange tijdspannes vergen. Daarom is het raadzaam om water toe te voegen aan de monsters. Verdun de monsters met 18 MΩ gezuiverd water behandeld met 0,01% HNO3 (analytische rang) indien de verkregen gegevens buiten de LOD.
      Opmerking: typisch, monsters worden verdund tot een volume van 500 µ L, geplaatst in de geautomatiseerde automatische sampler van de AAS te worden gemeten direct na de standaard curve is vastgesteld. Het vereiste volume moet door de gebruiker worden bepaald en moet rekening houden met de uiteindelijke berekeningen van de concentraties. Het afronden van de Zn-bepalingen door AAS van een compleet experiment in één poging wordt aanbevolen. Het onderbreken van de metingen kan leiden tot grote experimentele variaties en inconsistenties.
  4. Zet de ppb metingen om in de Kies vorm, verkregen uit Zn gemeten via AAS. Beschouw de massa van Zn (65,39 UAM). Verdeel de hoeveelheid ppb verkregen door AAS door 63.390.000. In cellen variëren de Zn-concentraties van eenheden van pmol tot µmol.
    1. Verdeel de concentratie van Zn (pmol of µmol) door de initiële massa van eiwitten in het monster bepaald door Bradford (stap 2,4). Deze berekening maakt de hoeveelheid metaal (pmol of µmol Zn) opgenomen per mg eiwit van het monster.
      Nota: het is belangrijk om de verdunningsfactoren te overwegen die tijdens de metaal bepalingen worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We testten het vermogen van de GF-AAS om de minieme niveaus van Zn in zoogdiercellen op te sporen (Figuur 1). Zo hebben we gekweekt primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, en de gevestigde cel lijnen N2A (neuroblastoma afgeleid), 3T3 L1 (adipocyten), MCF10A (borst epitheel), en MDCK cellen (hond nier epitheel). Eerst, isoleerden wij gehele cel, cytosolische, en kern fracties van al deze cel types en evalueerden de zuiverheid van de fracties doo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Atomaire absorptiespectroscopie is een zeer gevoelige methode voor Zn kwantificering in kleine volume/massa biologische monsters. De beschreven optimalisatie van Zn meting maakt toepassing van deze methode eenvoudig en garandeert ideale analytische condities. Hier, met behulp van GF-AAS, hebben we bepaald de concentratie van Zn in hele cellen, en in cytosolische en nucleaire fracties, uit verschillende cellen lijnen. De resultaten tonen aan dat deze techniek vergelijkbaar is met die verkregen door tl-sondes en ICP-MS. Bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Diversity Scholars Award van de Universiteit van Massachusetts Medical School aan T.P.-B. N.N.-T. wordt ondersteund door SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N wordt ondersteund door de National Science Foundation Grant DBI 0959476. De auteurs zijn dankbaar Dr Daryl A. Bosco voor het verstrekken van de N2A Cell line en aan Daniella Cangussu voor haar technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma AldrichI5879
Acetic AcidSigma Aldrich1005706
Anti Brg1-antibody (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
DexamethasoneSigma AldrichD4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma AldrichE9644
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
Horse serumThermoFischer-Gibco16050122
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
Hydrogen Peroxide (H2O2)Sigma Aldrich95321
InsulinSigma Aldrich91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-AThermoFischer51300044
Nitric Acid (HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (Reduced Serum Media)ThermoFischer-Gibco31985070
Penicillin-StreptomycinThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (Collagen)Advanced BioMatrix5005
Retionic AcidSigma AldrichPHR1187
TroglitazoneSigma Aldrich648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermoFischer-Gibco25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Established Cell Lines
3T3-L1American Type Culture CollectionCL-173
MCDKAmerican Type Culture CollectionCCL-34
MCF10AAmerican Type Culture CollectionCRL-10317
N2AAmerican Type Culture CollectionCCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometerPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200

Referenties

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201(2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614(2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542(2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

AtoomabsorptiespectroscopieZinkanalyseCelfractioneringSubcellulaire fractiesWestern blot-validatieSalpeterzuuroplossingGrafietovenSpoormetaaldetectieCelcultuurvoorbereiding
Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.