Het doel van dit protocol is het genotype van de zeeanemonen Nematostella vectensis tijdens de gastrulatie zonder het embryo op te offeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genotypering van zeeanemonen tijdens de vroege ontwikkeling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier beschreven is een PCR-gebaseerd protocol voor genotype de gastrulastadium fase embryo van de zacht cnidarian nematostella vectensis zonder de levensduur van het dier in te boeten. Na in-vitro fertilisatie en de-jellying mogen zygoten gedurende 24 uur bij kamertemperatuur worden ontwikkeld om de vroege-tot mid-gastrula-fase te bereiken. De gastrulastadium-embryo's worden vervolgens op een agarose-gelbed geplaatst in een Petri schaaltje met zeewater. Onder de ontleed Microscoop wordt een Wolfram naald gebruikt om een de weefsel fragment van elk embryo chirurgisch te scheiden. Na de operatie mogen embryo's genezen en verder ontwikkelen. Genomisch DNA wordt geëxtraheerd uit het geïsoleerde weefsel fragment en gebruikt als een sjabloon voor Locus-specifieke PCR. Het genotype kan worden bepaald op basis van de grootte van PCR-producten of de aanwezigheid/afwezigheid van allel-specifieke PCR-producten. Na de operatie worden embryo's gesorteerd volgens het genotype. De duur van het gehele genoom proces hangt af van het aantal te screenen embryo's, maar het minimaal vereist 4 – 5 uur. Deze methode kan worden gebruikt om Knockout mutanten te identificeren uit een genetisch heterogene populatie embryo's en maakt analyses van fenotypes mogelijk tijdens de ontwikkeling.
Inleiding
Cnidarianen vertegenwoordigen een gevarieerde groep dieren, waaronder kwallen, koralen en zeeanemonen. Ze zijn diploblasten, samengesteld uit Ectoderm en endoderm die worden gescheiden door een extracellulaire matrix (mesoglea). Cnidaria is een zustergroep van de speciose bilateria, die traditionele diermodellen zoals Drosophila en Mus Belong1. Bovendien, de Cnidaria-bilateria divergentie is gedacht te hebben plaatsgevonden in de pre-Cambrium periode2. Als zodanig zijn vergelijkende studies van cnidarianen en bilaterialen essentieel voor het verkrijgen van inzicht in de biologie van hun meest recente gemeenschappelijke voorouder. Recentelijk heeft vergelijkende genomics onthuld dat cnidarianen en bilaterialen veel ontwikkelingtoolkit genen zoals inkepingen en bhlh delen, wat impliceert dat hun gemeenschappelijke voorouder al deze genen3had. Echter, de rol van deze ontwikkelings Toolkit genen in de laatste gemeenschappelijke voorouder van Cnidaria en bilateria is relatief minder goed begrepen. Om dit probleem aan te pakken, is het van cruciaal belang om te bestuderen hoe deze diep geconcregeerde genen in cnidarianen functioneren.
Een van de opkomende cnidarische genetische modellen is de zacht nematostella vectensis. Het genoom is gesequentieerd3, en een verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen, waaronder morfolino-gemedieerde Gene knockdown, meganuclease-gemedieerde Transgenese, en Crispr Cas9-gemedieerde genen knockins en Knockouts, zijn nu beschikbaar voor gebruik in dit dier. Daarnaast is de ontwikkeling van Nematostella relatief goed begrepen. Tijdens de embryo genese treedt de gastrulatie op door invaginatie4, en het embryo ontwikkelt zich tot een vrij-zwemmend planula larve. De planula transformeert vervolgens in een Sessile poliep met een mond en circumoreel tentakels. De poliep groeit en bereikt seksuele volwassenheid.
Crispr Cas9-gemedieerde gerichte mutagenese wordt nu routinematig gebruikt om de genfunctie in nematostella vectensis5,6,7,8,9te bestuderen. Om Knockout mutanten in Nematostellate genereren, wordt eerst een cocktail met Locus-specifieke enkelvoudige rna's en het endonuclease Cas9-eiwit in onbevruchte of bevruchte eieren geïnjecteerd om F0-oprichter dieren te produceren die doorgaans mosaicisme. F0 dieren worden vervolgens tot seksuele volwassenheid verheven en met elkaar gekruist om een F1-populatie te produceren, waarvan een subset van de mutanten6kan zijn. Als alternatief kunnen seksueel volwassen F0 dieren worden gekruist met wild type dieren om F1 heterozygoot dieren te genereren, en F1-heterozygoten die een knock-outallel dragen in de Locus van belang kunnen vervolgens met elkaar worden doorkruist om F2-nakomelingen te produceren, een kwart waarvan wordt verwacht dat ze Knockout mutanten5. Beide benaderingen vereisen een methode om knock-outmutanten van een genetisch heterogene populatie te identificeren. Polyp tentakels kunnen worden gebruikt voor het uitpakken van genomisch DNA voor genotype6,7. Echter, in gevallen waarin de ontwikkelings functie van het gen van belang wordt onderzocht en Mutant embryo's de poliep fase niet bereiken (d.w.z. vanwege de larvale letaliteit die gepaard gaat met de mutatie), moeten knock-outmutanten vroegtijdig in ontogenie worden geïdentificeerd. Hier beschreven is een PCR-gebaseerd protocol voor genotype-individuele dieren in het gastrulastadium-stadium zonder het dier op te offeren, waardoor de identificatie van uitfaserende mutanten uit een genetisch heterogene populatie embryo's mogelijk is. De duur van het gehele genoom proces hangt af van het aantal te screenen embryo's, maar het minimaal vereist 4-5 h.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. inductie van paaien, in vitro fertilisatie en de-jellying
- Handhaaf Nematostella vectensis in zeewater met een zoutgehalte van 12 delen per duizend (ppt) in duisternis bij 16 °c, dagelijks voeden Artemia .
- Op de dag voor de paai-inductie, plaats dieren in een incubator met temperatuur en licht controle. Program meer de incubator zodat de dieren worden blootgesteld aan 8 uur licht bij 25 °C. Optioneel: Voer een klein stukje (< 1 mm3) oester aan individuele dieren voordat u ze in de incubator plaatst om het paaien te verbeteren.
- Laat de dieren in de broedstoof voor 1 uur bij 16 °C.
- Haal de dieren uit de incubator en laat ze op een tafel met licht bij kamertemperatuur (RT) staan om te paaien. Paaien gebeurt meestal binnen de volgende 1.5 – 2 h.
- Als mannetjes en vrouwtjes zich in afzonderlijke recipiënten bevinden, plaats dan Eier pakketten van de vrouwelijke container in een sperma bevattende mannelijke container met behulp van een pipet waarvan de punt is gesneden om de opening te vergroten, zodat de eieren niet door mechanische belasting worden beschadigd tijdens Overdracht. Laat eieren bevruchte worden door ze gedurende ten minste 15 minuten in de mannelijke container te laten.
- De-Jelly de Eier pakketten in zeewater bevattende 3% cysteïne (pH 7,4) op een Petri schaaltje of in een buis van 15 mL. Zachtjes te agiteren op een shaker gedurende 12 min.
- Gebruik een plastic pipet om klontjes op te breken en nog steeds 2-3 min tot een volledig de-Jellied te blijven trillen.
- Verwijder cysteïne door het vervangen van de media met zoet zeewater voor ten minste 5x.
- Bewaar de bevruchte eieren op een glazen Petri schaal bij 16 °C of RT.
2. chirurgische verwijdering van een de weefsel uit een gastrulastadium embryo
- Maak een DNA-extractiebuffer, bestaande uit 10 mm tris-HCl (pH 8), 50 mm KCl, 1 mm EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 en 1 mg/ml proteïnase K. gebruik 20 ml van de extractiebuffer per embryo. Meng goed door grondig en aliquot de buffer in PCR-buisjes.
- Los 1% agarose op in zeewater en giet het in een Petri schaaltje om de bodem te bedekken. Koel op een tafelblad om een gelbed te maken. Giet zoet zeewater om het gelbed in de Petri schaal te bedekken.
- Breng 24 uur na de bevruchting (HPF) embryo's (vroeg-tot mid-gastrula stage) over in de Petri schaal met een agarose-gelbed.
- Steek een wolfraam naald in een naald houder en steriliseren door het dippen van de naaldpunt in alcohol (70% of hoger) en het plaatsen van het in vlam te verbranden van de alcohol.
- Gebruik onder een ontleed Microscoop (bij een vergroting van 20x tot 40x) de wolfraam naald om een depressie te maken op het agarose-bed door het verwijderen van een stukje oppervlak agarose over de grootte van een embryo dat moet worden gemanipuleerd, en plaats het embryo op de depressie met zijn laterale zijde naar beneden gericht om de beweging van het embryo voor microchirurgie te beperken.
- Gebruik de wolfraam naald te chirurgisch accijns een stukje de weefsel tegenover de mondelinge blastoporal opening. Een de één derde tot een kwart van het embryonale weefsel langs de orale-de as is meestal voldoende.
- Gebruik een P20-pipet om het geïsoleerde aborale weefsel (in < 2 mL) over te brengen naar een PCR-buis met 20 mL DNA-extractiebuffer.
- Breng het embryo na de operatie over in een put met ten minste 500 mL zoet zeewater in een 24-of 96-waterput.
- Herhaal de stappen 2.4 – 2.8 voor het aantal embryo's waar nodig.
- Plaats de goede plaat die na de operatie embryo's bevat, in een incubator bij 16 °C of RT totdat de genotypering is voltooid.
3. genomische DNA-extractie en genotypering PCR
- Draai kort de PCR-buisjes met de DNA-extractiebuffer en geïsoleerde embryonale weefsels met behulp van een mini centrifuge (bijv. bij 2.680 x g voor 10 s).
- Om genomisch DNA uit enkele embryo's te extraheren, incuberen de PCR-buisjes bij 55 °C gedurende 3 h. Vortex voor 30 s om de 30 minuten om breuk van celklonters te voorkomen en cellysis te verbeteren.
- Incuberen de PCR-buisjes bij 95 °c gedurende 5 minuten om proteïnase K te deactiveren.
- De gDNA-extracten bij 4 °C of op ijs bewaren en onmiddellijk overgaan tot PCR.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd door gDNA-extracten in een vriezer van a-20 °C te plaatsen. - Stel een PCR-reactie op met geëxtraheerd gDNA als een sjabloon om de genomische locus van belang te versterken.
- Als verschillende allelen op de Locus van belang verschillen in grootte, zodat de grootte verschil kan worden gedetecteerd door agarose gel elektroforese, ontwerp een enkele set van primers om de hele Locus te versterken.
- U ook allel-specifieke primers gebruiken die alleen PCR-producten genereren in aanwezigheid van het specifieke allel; bijvoorbeeld door het ontwerpen van de primer die bindt aan een regio met invoeging/deletie mutaties.
- Gebruik een typische PCR-reactiemix van 20 mL als volgt: 5 mL gDNA-extracten, 8 mL Nuclease-vrij water, 4 mL PCR-buffer, 0,2 mL 10mM Dntp's, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM voorwaartse primer, 1 mL 10 mM reverse primer en 0,2 mL DNA-polymerase (Zie tabel met materialen).
Opmerking: meerdere primers kunnen worden gebruikt in een PCR-reactie. Eén universele voorwaartse primer en twee allel-specifieke reverse primers kunnen bijvoorbeeld worden gecombineerd, zolang de twee reverse primers zijn ontworpen om PCR-producten van verschillende groottes te genereren, zodat de aanwezigheid/afwezigheid van de twee allelen ondubbelzinnig kan worden worden bepaald door elektroforese van de gel (zie sectie representatieve resultaten).
- Voer agarose gel elektroforese uit om de grootte en aanwezigheid/afwezigheid van PCR-producten te bepalen. Pas de conditie aan van agarose-gel elektroforese (bijv. agarose-gel percentage, V/cm en duur), afhankelijk van de verwachte grootte van PCR-producten.
- Gebruik de resultaten van PCR met betrekking tot de grootte en aanwezigheid/afwezigheid van PCR-producten om een genotype toe te wijzen aan elk embryo na de operatie. Als er bijvoorbeeld verschillende allelen worden verwacht om PCR-producten van verschillende groottes te genereren, gebruik dan de informatie over de grootte om het genotype toe te wijzen voor elk embryo. Als allel-specifieke primers worden gebruikt, moeten de gegevens over de aanwezigheid/afwezigheid van PCR-producten worden gebruikt om een genotype aan elk embryo toe te wijzen.
- Sorteer embryo's volgens genotype.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De Nematostella genoom heeft een enkele Locus die een precursor eiwit codeert voor de neuropeptide GLWamide. Drie Knockout Mutant allelen bij deze Locus (GLW glij-a, GLW glij-ben GLW glij-c) zijn eerder gemeld5. Vier heterozygoot mannetjes die een wild-type allel (+) en een knock-outallel GLW glij-cop de glwamide Locus (genotype: +/GLW-c) dragen, werden gekruist met ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven een PCR-gebaseerd protocol voor genotype een enkele zeeanemonen embryo zonder het dier op te offeren. Na het paaien en de-jellying mogen de bevruchte eitjes zich ontwikkelen tot gastrulae. Het de-gebied van elk gastrulastadium-embryo wordt chirurgisch verwijderd en het geïsoleerde de-weefsel wordt gebruikt voor daaropvolgende genomische DNA-extractie, terwijl de overgebleven embryo's na de operatie genezen en doorgaan met de ontwikkeling. De gDNA-extracten worden vervolgens gebruikt voor een PCR-test om h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur heeft niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken anonieme reviewers voor opmerkingen over de eerdere versie van het manuscript, waardoor het manuscript is verbeterd. Dit werk werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Arkansas.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Gebruikt voor het induceren van spawnen |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
Referenties
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742(2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377(2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486(2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694(2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734(2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555(2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
