We demonstreren eencellige cultuur van bacteriën in gigantische blaasjes (GVS). Gv's met bacteriële cellen werden bereid door de druppel overdrachtsmethode en werden geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat voor directe observatie van bacteriële groei. Deze aanpak kan ook worden aangepast aan andere cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We ontwikkelden een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen gigantische blaasjes (GVS). Bacteriële celcultuur is belangrijk voor het begrijpen van de functie van bacteriële cellen in de natuurlijke omgeving. Vanwege de technologische vooruitgang kunnen verschillende bacteriële celfuncties op het eencellige niveau in een besloten ruimte worden onthuld. Gv's zijn sferische micro-sized compartimenten samengesteld uit amfifiele lipide moleculen en kan verschillende materialen, met inbegrip van cellen houden. In deze studie werd een enkele bacteriële cel ingekapseld in 10 – 30 μm GVs door de druppel overdrachtmethode en werden de Gv's die bacteriële cellen bevatten geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat. Onze methode is nuttig voor het observeren van de real-time groei van enkele bacteriën binnen GVs. We gekweekte Escherichia coli (E. coli) cellen als een model binnen GVS, maar deze methode kan worden aangepast aan andere celtypen. Onze methode kan worden gebruikt in de wetenschap en industriële gebieden van microbiologie, biologie, biotechnologie, en synthetische biologie.
Inleiding
De cultuur van bacteriële cellen op het eencellige niveau heeft steeds meer aandacht gekregen. Het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau in een besloten ruimte kan een verheldende werking van bacteriële functies zoals fenotypische variabiliteit1,2,3,4, Celgedrag5, 6 , 7 , 8 , 9, en antibioticaresistentie10,11
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van Gv's die bacteriële cellen bevatten door middel van de overdrachtsmethode druppel
- Bereid lipide stamoplossingen van 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) en 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000] (Biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in chloroform/ methanoloplossing (2/1, v/v) en bewaar de kolf bij-20 °C.
- Bereiding van een lipide-bevattende olie oplossing
- Giet 20 μL van de POPC-oplossing en 4 μL van de Biotine-PEG-DSPE-oplossing in een glazen buis (Figuur 1b (i)).
- Damp het organische oplosmiddel ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We presenteren een eenvoudige methode voor het genereren van GVs met enkele bacteriële cellen met behulp van de druppel methode (Figuur 1). Figuur 1a toont een schematisch beeld van de neerslag van GVS die bacteriën bevatten. W/O druppels met bacteriën worden overgebracht over de olie-water (lipide monolayer) interface door centrifugeren te vormen GVs. Het verschil in dichtheid tussen sucrose (binnenste waterige oplossing) en glu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen GVs. Deze eenvoudige methode omvat het vormen van gv's met bacteriële cellen op het eencellige niveau door gebruik te maken van de druppel overdrachtsmethode. Vergeleken met andere benaderingen voor het verkrijgen van Gv's die bacteriële cellen bevatten, heeft deze methode twee voordelen: (i) het is gemakkelijk te ontwikkelen en (II) een klein volume (2 μL) van de monsteroplossing is nodig om de GVs te bereiden. De drupp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door een toonaangevend initiatief voor uitstekende jonge onderzoekers (LEADER, No. 16812285) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan, een subsidie-in-Aid voor onderzoek jonge wetenschappers (nr. 18K18157, 16K21034) van Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) tot M.M., en subsidie-in-Aid van MEXT naar K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Dekglas (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | dikte 0.13–0.17 mm |
| Dekglas (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | dikte 0.25–0.35 mm |
| Bureaucentrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | slinger rotor type |
| Dubbelzijdige afdichting (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glazen flacon | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentatiebuis |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Omgekeerd microscoop | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopische verwarmingstrap | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineraalolie | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objectieflens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonaatmembraan | Avanti Polar Lipids | 610005 | porengrootte 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Natriumchloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasoonbad | AS ONE | ASU-3D | |
| Gistextract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL plasticbuis met deksel | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL plasticbuis met deksel | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-di-stearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleenglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
Referenties
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
