Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 april 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

In dit artikel

Samenvatting

We demonstreren eencellige cultuur van bacteriën in gigantische blaasjes (GVS). Gv's met bacteriële cellen werden bereid door de druppel overdrachtsmethode en werden geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat voor directe observatie van bacteriële groei. Deze aanpak kan ook worden aangepast aan andere cellen.

Samenvatting

We ontwikkelden een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen gigantische blaasjes (GVS). Bacteriële celcultuur is belangrijk voor het begrijpen van de functie van bacteriële cellen in de natuurlijke omgeving. Vanwege de technologische vooruitgang kunnen verschillende bacteriële celfuncties op het eencellige niveau in een besloten ruimte worden onthuld. Gv's zijn sferische micro-sized compartimenten samengesteld uit amfifiele lipide moleculen en kan verschillende materialen, met inbegrip van cellen houden. In deze studie werd een enkele bacteriële cel ingekapseld in 10 – 30 μm GVs door de druppel overdrachtmethode en werden de Gv's die bacteriële cellen bevatten geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat. Onze methode is nuttig voor het observeren van de real-time groei van enkele bacteriën binnen GVs. We gekweekte Escherichia coli (E. coli) cellen als een model binnen GVS, maar deze methode kan worden aangepast aan andere celtypen. Onze methode kan worden gebruikt in de wetenschap en industriële gebieden van microbiologie, biologie, biotechnologie, en synthetische biologie.

Inleiding

De cultuur van bacteriële cellen op het eencellige niveau heeft steeds meer aandacht gekregen. Het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau in een besloten ruimte kan een verheldende werking van bacteriële functies zoals fenotypische variabiliteit1,2,3,4, Celgedrag5, 6 , 7 , 8 , 9, en antibioticaresistentie10,11. Door de recente ontwikkelingen in cultuur technieken kan de cultuur van enkele bacteriën worden bereikt in een besloten ruimte, zoals in een goed-chip4,7,8, gel druppel12,13 en water-in-olie (W/O) druppel5,11. Om het begrip of gebruik van enkele bacteriële cellen te bevorderen, zijn verdere technische ontwikkelingen van teelttechnieken nodig.

Blaasjes die de biologische celmembraan nabootsen zijn sferische compartimenten bestaande uit amfifiele moleculen en kunnen verschillende materialen vasthouden. Blaasjes zijn geclassificeerd op grootte en omvatten kleine blaasjes (SVs, diameter < 100 nm), grote blaasjes (LVs, < 1 μm), en reuzen blaasjes (GVs, > 1 μm). SVs of Lv's worden vaak gebruikt als medicijn dragers vanwege hun affiniteit met het biologische celmembraan14. Gv's zijn ook gebruikt als een reactor systeem voor de bouw van protocellen15 of kunstmatige cellen16. Inkaping van biologische cellen in GVS is gemeld17,18, en dus GVS tonen potentieel als een celkweek systeem in combinatie met het reactor systeem.

Hier beschrijven we samen met een video van experimentele procedures hoe Gv's kunnen worden gebruikt als nieuwe celkweek schepen19. Gv's met bacteriën werden gemaakt door de druppel overdrachtsmethode20 en werden vervolgens geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een afdekglas. We gebruikten dit systeem om bacteriële groei op het eencellige niveau binnen GVs in real-time te observeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van Gv's die bacteriële cellen bevatten door middel van de overdrachtsmethode druppel

  1. Bereid lipide stamoplossingen van 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) en 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000] (Biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in chloroform/ methanoloplossing (2/1, v/v) en bewaar de kolf bij-20 °C.
  2. Bereiding van een lipide-bevattende olie oplossing
    1. Giet 20 μL van de POPC-oplossing en 4 μL van de Biotine-PEG-DSPE-oplossing in een glazen buis (Figuur 1b (i)).
    2. Damp het organische oplosmiddel door de luchtstroom in om een lipide-film te vormen en plaats de film in een exsiccator voor 1 uur om het organische oplosmiddel volledig te verdampen (Figuur 1b (II)).
      Opmerking: Het is noodzakelijk om het organische oplosmiddel in een rook afzuigkap te verdampen.
    3. Voeg 200 μL minerale olie (0,84 g/mL, tabel met materialen) toe aan de glazen injectieflacon (Figuur 1b (III)).
    4. Wikkel het openings gedeelte van de glazen flacon met film en soniceren het in een ultrasoon bad (120 W) gedurende ten minste 1 uur (Figuur 1b (III)). De uiteindelijke concentraties van POPC en biotine-PEG-DSPE zijn respectievelijk 1 mM en 0,002 mM.
  3. Pre-cultuur van bacteriële cellen
    1. Inoculeren E. coli in 1x lb medium (1 g gistextract, 2 g bacto Tryptone en 2 g natriumchloride in 200 ml gedeïoniseerd water) van een lb-plaat en incuberen bij 37 °c gedurende 12 – 14 uur ('s nachts).
    2. Na incubatie, verzamel 20 μL van de cultuur oplossing en breng over naar 1,98 mL vers 1x LB medium, en kweek de cellen opnieuw voor 2 uur.
    3. Controleer de extinctie op 600 nm (OD600) waarde van de pre-cultuur oplossing (bereid in stap 1.3.2). Er moet een pre-cultuur oplossing van OD600 = 1,0 – 1.5 worden gebruikt.
  4. Bereiding van de buitenste en binnenste waterige oplossingen van GVs
    1. Los glucose op in 1x LB medium om een buitenste waterige oplossing van GVs te bereiden. bereid 20 mL van een Stock glucoseoplossing (500 mM).
    2. Verdun de Stock glucoseoplossing met 1x LB medium tot 200 mM (tabel 1).
    3. Los sucrose op in 1x LB medium om een innerlijke waterige oplossing van GVs te bereiden. bereid 20 mL van een voorraad sacharoseoplossing (500 mM).
    4. Meng de pre-cultuur oplossing (OD600 = 1,0 – 1.5), sacharoseoplossing (500 mm) en 1x lb medium (tabel 1). De uiteindelijke OD600 waarde van de kweek oplossing moet 0,01 – 0.015 zijn en de uiteindelijke sacharose concentratie moet 200 mm bedragen.
      Opmerking: Wees voorzichtig om osmotische druk te vermijden. Het is noodzakelijk om de concentratie tussen de binnenste en buitenste waterige oplossing in evenwicht te brengen.
  5. Bereiding van water-in-olie (W/O) druppeltjes met bacteriële cellen
    1. Voeg 2 μL van de binnenste waterige oplossing van GVs (bereid in stap 1.4.4) toe aan 50 μL van de olie oplossing met lipiden (minerale olie met POPC en biotine-PEG-DSPE) in een 0,6 mL hard plastic buis (Figuur 1b (IV)).
    2. Emulgeer de twee componenten in de plastic buis door de buis met de hand te tikken (Figuur 1b (v)).
  6. Vorming van Gv's die bacteriële cellen bevatten
    1. Voeg 50 μL van de buitenste waterige oplossing van GVs (bereid in stap 1.4.2) toe in een 1,5 mL hard plastic buisje (Figuur 1b (VI)) en 150 laag de olie oplossing met lipiden (minerale olie met popc en BIOTINE-Peg-dspe) zachtjes op het oppervlak van de buitenste waterige oplossing (Figuur 1b (VII)). Incuberen dit monster bij kamertemperatuur (RT, 25 °C) gedurende 10 – 15 minuten. Controleer of de interface van de olie-en waterige oplossingen plat is.
    2. Voeg met behulp van een pipet (Figuur 1b (VIII)) 50 μL van de oplossing met een druppel (in stap 1.5.2 bereid) toe aan de interface van de olie-en waterige oplossing.
    3. Centrifugeer de 1,5 mL hard plastic buis (van stap 1.6.2) gedurende 10 min bij 1.600 x g bij RT in een desktop centrifuge (Figuur 1b (IX)). Na centrifugeren, zuig de olie (bovenste laag) uit de 1,5-mL hard plastic buis met behulp van een pipet, en het verzamelen van de GVs met bacteriële cellen (Figuur 1b (x)).

2. bereiding van een GV-observatiesysteem (bacterieel celkweek systeem)

  1. Bereiding van kleine blaasjes (Sv's) voor constructie ng a ondersteund dubbelmembraan
    1. Giet 20 μL van de POPC-oplossing en 4 μL van de Biotine-PEG-DSPE-oplossing in een glazen buis (met gebruikmaking van dezelfde lipidesamenstelling als gebruikt voor GV-voorbereiding in stap 1,1).
    2. Damp het organische oplosmiddel door de luchtstroom in om een lipide-film te vormen en plaats dit monster in een exsiccator voor 1 uur om het organische oplosmiddel volledig te verdampen.
    3. Voeg 200 μL 200 mM glucose toe in 1x LB medium (de buitenste waterige oplossing van GVs) op de glazen injectieflacon.
    4. Wikkel het openings gedeelte van de glazen flacon met film en soniceren het in een ultrasoon bad (120 W) gedurende ten minste 1 uur.
    5. Bereid SVs door de extrusiemethode21 met behulp van een mini-extruder en polycarbonaat membraan met 100 nm poriegrootte.
  2. Voorbereiding van een handgemaakte kamer
    1. Boor een gat van 7 mm met een holle stoot op een dubbel-geconfronteerd zegel (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Plak de dubbel-geconfronteerd afdichting met het gat op een afdekglas (30 mm x 40 mm, dikte 0,25 – 0,35 mm).
  3. Bereiding van een ondersteund dubbelmembraan op het afdekglas in het gat van de kamer
    1. Voeg 30 μL van de SV-oplossing toe aan het gat van de kamer (bereid in punt 2,2) en incuberen bij RT gedurende 30 minuten.
    2. Was het gat voorzichtig tweemaal met 20 μL 1x LB medium met 200 mM glucose (de buitenste waterige oplossing van GVs) door pipetteren.
  4. Immobilisatie van Gv's op de ondersteund dubbelmembraan op het afdekglas in het gat van de kamer
    1. Introduceer 10 μL neutravidin met de buitenste waterige oplossing van GVs (1 mg/mL) in het gat en inincuberen bij RT gedurende 15 minuten.
    2. Was het gat voorzichtig tweemaal met 20 μL 1x LB medium met 200 mM glucose (de buitenste waterige oplossing van GVs) door pipetteren.
    3. Voeg alle oplossing met GVs (bereid in stap 1.6.3) toe aan het gat van de kamer en sluit af met een afdekglas (18 mm x 18 mm, dikte 0,13 – 0.17 mm) (Figuur 2b).
  5. Microscopische observatie van bacteriële celgroei binnen GVs
    1. Stel een microscopisch verwarmingssysteem in met een omgekeerde Microscoop uitgerust met een 40x/0.6 numerieke diafragma (NA) objectief lens met een lange werkafstand (Figuur 2b).
    2. Plaats de kamer op het microscopische verwarmingssysteem (Figuur 2b). Inbroed de GVs met bacteriële cellen in de kamer in een statische toestand gedurende 6 uur bij 37 °C.
    3. Vastleggen en opnemen van Microscoop beelden van bacteriële celgroei binnen GVs elke 30 min met behulp van een wetenschappelijke complementaire metaaloxide Semiconductor (sCMOS) camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We presenteren een eenvoudige methode voor het genereren van GVs met enkele bacteriële cellen met behulp van de druppel methode (Figuur 1). Figuur 1a toont een schematisch beeld van de neerslag van GVS die bacteriën bevatten. W/O druppels met bacteriën worden overgebracht over de olie-water (lipide monolayer) interface door centrifugeren te vormen GVs. Het verschil in dichtheid tussen sucrose (binnenste waterige oplossing) en glu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen GVs. Deze eenvoudige methode omvat het vormen van gv's met bacteriële cellen op het eencellige niveau door gebruik te maken van de druppel overdrachtsmethode. Vergeleken met andere benaderingen voor het verkrijgen van Gv's die bacteriële cellen bevatten, heeft deze methode twee voordelen: (i) het is gemakkelijk te ontwikkelen en (II) een klein volume (2 μL) van de monsteroplossing is nodig om de GVs te bereiden. De drupp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een toonaangevend initiatief voor uitstekende jonge onderzoekers (LEADER, No. 16812285) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan, een subsidie-in-Aid voor onderzoek jonge wetenschappers (nr. 18K18157, 16K21034) van Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) tot M.M., en subsidie-in-Aid van MEXT naar K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Dekglas (18 × 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181dikte 0.13–0.17 mm
Dekglas (30 × 40 mm)Matsunami Glass Ind.custom-orderdikte 0.25–0.35 mm
BureaucentrifugeHi-Tech Co.ATT101slinger rotor type
Dubbelzijdige afdichting (10 × 10 × 1 mm)NitomsT4613
Glazen flaconAS ONE6-306-01Durham fermentatiebuis
GlucoseWako Pure Chemicals049-31165
Omgekeerd microscoopOlympusIX-73
MethanolWako Pure Chemicals133-16771
Microscopische verwarmingstrapTOKAI HITTP-110R-100
MineraalolieNacalai Tesque23334-85
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
ObjectieflensOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
PolycarbonaatmembraanAvanti Polar Lipids610005porengrootte 100 nm
sCMOS cameraAndorZyla 4.2 plus
NatriumchlorideWako Pure Chemicals191-01665
SucroseWako Pure Chemicals196-00015
UltrasoonbadAS ONEASU-3D
GistextractBD Biosciences212750
0.6 mL plasticbuis met dekselWatson130-806C
1.5 mL plasticbuis met dekselSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholineAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-di-stearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleenglycol)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotin-PEG-DSPE

Referenties

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Escherichia colidruppeloverdrachtmethodeondersteund membraanmicroscopische beeldvormingvesikelvormingcelinkapselingreal time groei
Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.