Methodenartikel

Röntgendiffractie van intact Murine skeletspieren als een instrument voor het bestuderen van de structurele basis van spierziekte

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59559

⸱

18 juli 2019

 , 
1BioCAT, Dept. of Biological Sciences, Illinois Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van Small-angle röntgendiffractie experimenten met behulp van intact muis skeletspieren. Met de brede beschikbaarheid van transgene muismodellen voor menselijke ziekten, kan dit experimentele platform een nuttig testbed vormen om de structurele basis van genetische spierziekten te verhelderend

Samenvatting

Transgene muismodellen zijn belangrijke hulpmiddelen geweest voor het bestuderen van de relatie van genotype tot fenotype voor menselijke ziekten, waaronder die van de skeletspieren. Muis skeletspier is aangetoond dat het produceren van hoge kwaliteit X-Ray diffractie patronen op de derde generatie Synchrotron lijnen bieden de mogelijkheid om veranderingen op het niveau van het genotype te koppelen aan functionele fenotypes in gezondheid en ziekte door te bepalen de structurele gevolgen van genetische veranderingen. We presenteren gedetailleerde protocollen voor de bereiding van specimens, het verzamelen van de Röntgen patronen en het extraheren van relevante structurele parameters uit de Röntgen patronen die kunnen helpen bij het begeleiden van onderzoekers die dergelijke experimenten voor zichzelf willen uitvoeren.

Inleiding

Synchrotron Small-angle X-Ray diffractie is de methode van keuze voor het bestuderen van de nm-schaal structuur van actieve contracterende spier preparaten onder fysiologische omstandigheden. Belangrijk is dat structurele informatie van levende of gevilde spier preparaten kan worden verkregen in Synchrony met fysiologische gegevens, zoals spierkracht en lengte veranderingen. Er is steeds meer belangstelling voor het toepassen van deze techniek om de structurele basis te bestuderen van erfelijke spierziekten die hun basis hebben in puntmutaties in sarcomerische eiwitten. De spier biofysica Gemeenschap is zeer actief in het genereren van transgene muismodellen voor deze menselijke ziekte omstandigheden die ideale test bedden voor structurele studies kunnen bieden. Recente publicaties van onze groep1,2,3 en andere4,5 hebben aangegeven dat de Röntgen patronen van de muis extensor digitorum Longus (EDL) en soleus-spieren alle diffractie informatie beschikbaar van meer traditionele model organismen zoals kikker en konijn Fes skeletspieren. Een voordeel van de muis skeletspieren voorbereiding is het gemak van dissectie en het uitvoeren van elementaire membraan-intact, hele spier fysiologische experimenten. De afmetingen van de ontleed spier hebben voldoende massa om zeer gedetailleerde spier patronen te leveren in zeer korte blootstellings tijden van röntgenstralen (~ milliseconde per frame) op de derde generatie X-Ray beamlines.

Spier röntgendiffractie patronen bestaan uit de equatoriale reflecties, de Meridionale reflecties en de laag lijn reflecties. De equatoriale intensiteits ratio (ratio van de intensiteit van de 1, 1 en 1,0 equatoriale reflecties, I11/i10), is nauw gecorreleerd met het aantal bijgevoegde dwars bruggen, dat evenredig is aan de kracht die wordt gegenereerd in de skeletspieren van de muis 2. de Meridionale reflecties die de periodenheid van de dikke en dunne filamenten rapporteren, kunnen worden gebruikt om de filament uitbreidbaarheid te schatten1,3,6,7. Diffractie-functies die niet op de meridiaan en de evenaar staan, worden laag lijnen genoemd, die voortvloeien uit de ongeveer helisch geordende myosin-koppen op het oppervlak van dikke filament ruggengraat, evenals de ongeveer helisch geordende dunne filamenten. De intensiteit van myosin laag lijnen is nauw verwant aan de mate van ordening van myosin hoofden onder verschillende omstandigheden2,8. Al deze informatie kan worden gebruikt onderzoek het gedrag van sarcomeric eiwitten in situ in gezondheid en ziekte.

Synchrotron röntgendiffractie van de spier is historisch gedaan door teams van zeer gespecialiseerde deskundigen, maar vooruitgang in de technologie en de beschikbaarheid van nieuwe datareductie tools geven aan dat dit niet altijd het geval hoeft te zijn. De BioCAT Beamline 18ID bij de Advanced photon source heeft het Argonne National Laboratory toegewijde staf-en ondersteuningsfaciliteiten voor het uitvoeren van spier röntgendiffractie-experimenten die nieuwkomers in het veld kunnen helpen om aan de slag te gaan met het gebruik van deze technieken. Veel gebruikers kiezen formeel samen te werken met BioCAT-medewerkers, maar een toenemend aantal gebruikers vindt dat ze de experimenten en analyses zelf kunnen uitvoeren om de lasten op beamline-medewerkers te verminderen. Het primaire doel van dit artikel is om training te bieden die potentiële experimenteurs voorziet van de informatie die ze nodig hebben om experimenten op het skeletspier systeem van de muis te plannen en uit te voeren, hetzij op de biocat beamline of bij andere hoge flux lijnen rond de wereld waar deze experimenten mogelijk zouden zijn.

Protocol

Alle dier experimenten protocollen werden goedgekeurd door het Illinois Institute of Technology institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (protocol 2015-001, goedkeuringsdatum: 3 november 2015) en volgde de NIH "gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren"9 .

1. voorbereiding vooraf experiment

  1. Bereid 500 mL Ringer's Solution (bevat: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CACL2, 10,0 mm Hepes, 11 mm glucose, pH 7,4) vers voor elke dag van het experiment.
  2. Vul 200 mL Ringer's Solution in een spray fles en bewaar op een koelkast van 4 °C. Vul een Petri schaaltje (10 cm in diameter) met Ringer-oplossing en parfumeer met 100% zuurstof door de buis van een zuurstofcilinder aan te sluiten op een aquarium lucht steen. De Petri schalen ("dissecting dishes") waren eerder bekleed met een elastomeer verbinding om pennen te kunnen inbrengen tijdens de dissectie.
  3. Maak metalen montage haken. Snijd twee stukken roestvrijstaal draad, 0,5 mm in diameter, naar de juiste lengte en buig de draad aan beide uiteinden om haken te vormen. Rangschik alle ontkoppelende gereedschappen, scharen, hecht bindmiddel Tang, micro-schaar handig voor gebruik.
    Opmerking: Het haak gedeelte moet ongeveer 3 mm lang zijn. De langere draad (eindigend in een haak) moet ongeveer 5 cm lang zijn, en de kortere draad (ook eindigend in een haak) moet ongeveer 1 cm lang zijn om te passen in de aangepaste kamers die worden gebruikt bij biocat en een voldoende bewegingsbereik voor de transducer arm mogelijk te maken.
  4. Verbind en zet alle apparatuur aan. Dit omvat een gecombineerde motor/kracht transducer, motor/kracht transducer controller een High-Power bi-phasic stroom stimulator, en een computergestuurde data-acquisitie/controlesysteem.
    1. Schakel het systeem voor gegevensverzameling in en Kalibreer het voordat u begint met het experiment10. Kort, het kalibreren van de kracht door het toevoegen van een set van bekende gewichten, die tot 50% van de maximale kracht gemeten door de kracht transducer in een lineaire progressie, op de kracht transducer en het vastleggen van de uitgangsspanning veranderingen. Kalibreer de lengte door een set bekende uitgangsspanning op de hefarm toe te passen en de lengte wisseling van de arm te meten.
    2. Sluit de slangen van het thermische blok op de monsterhouder aan op een koel Circulerend bad en stel de temperatuur in om de gewenste temperatuur in de kamer te behouden tot tussen 10 °C en 40 °C. Bepaal dit empirisch van tevoren door het circulerende bad in te stellen op een bereik van temperaturen en de temperatuur in de kamer te meten met een thermokoppel.

2. spier bereiding

  1. Euthanatatie van de muis
    1. Euthaniseer de muis door koolstofdioxide inademing, gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Spray de huid op het achterste ledemaat met Cold Ringer-oplossing om te voorkomen dat het haar in de voorbereiding waait. Verwijder de huid door het te snijden rond de dij met behulp van fijne dissectie schaar en trek de huid snel omlaag met behulp van #5 tang om de spieren bloot te leggen.
    3. Laat het achterste ledemaat amputeren en breng het over in een ontleed gerecht dat is gevuld met de oplossing van oxygenized Ringer en plaats het vervolgens onder een verrekijker ontleed Microscoop.
  2. Het bereiden van een soleus spier
    1. Speld de achterste ledemaat in de ontsnij schotel met de gastrocnemius-spier naar boven. Snijd de distale pees van de gastrocnemius/soleus muscle Group en til de spieren zachtjes en langzaam op door de fascia aan weerszijden van de gastrocnemius-spier weg te knippen met behulp van een fijne schaar. Isoleer de gastrocnemius/soleus muscle Group van de ledemaat na het vrijmaken van de proximale pees van de soleus spier.
    2. Speld de spiergroep met de gastrocnemius-spier en de distale pees naar beneden in de ontleden Dish. Til de soleus-spier zachtjes op via de proximale pees en scheid deze van de gastrocnemius-spier en laat zo veel mogelijk van de soleus distale pees intact.
  3. Voorbereiding van een extensor digitorium Longus (EDL) spier
    1. Speld de achterste ledemaat in de ontleden Dish met de tibialis anterieure spier naar boven. Snijd de fascia langs de tibialis voorste (TA) spier en trek het duidelijk met behulp van een tang. Identificeer en snijd de distale pees van de TA-spier. Til de TA-spier op en snijd deze voorzichtig uit zonder aan de EDL-spier te trekken.
    2. Snijd de laterale zijde van de knie open en stel de twee pezen bloot. Snijd de proximale pees, verlaten zo veel van de pees mogelijk nog steeds gehecht aan de spier, en til de EDL spier (mediale spier) door zachtjes trekken de pees. Snijd de distale pees nadat deze is blootgesteld.
  4. De spier monteren
    1. Speld de spier via de pezen, en trim alle extra vet, fascia en pees weg zo veel mogelijk. Steek een pees in een vooraf gebonden knoop en bind de hecht goed met hechtdraad BIND Tang. Bind de tweede knoop rond de metalen haak.
    2. Herhaal dezelfde procedure met de lange haak aan de andere kant van de pees. Zorg ervoor dat geen van de body van de spier wordt benaderd door de hechtingen. Dit zal het preparaat beschadigen.
    3. Bevestig de korte haak aan de onderkant van de experimentele kamer en de lange haak aan de dual-mode kracht transducer/motor. Bel de oplossing in de experimentele kamer met 100% zuurstof.
  5. Optimaliseren van stimulatie protocollen en spier lengte
    1. Strek de spier door het aanpassen van de micro manipulatoren bevestigd aan de transducer/motor om een baseline spanning te genereren tussen 15 aan 20 mN voor het vinden van de beste stimulus parameters. Stel de stimulatie spanning in op 40 V. De stimulatie stroom wordt systematisch verhoogd tot er geen extra toename in twitch-kracht is. De hoogste stroom die wordt gevonden, wordt met ongeveer 50% verhoogd om een supra-maximale activering te garanderen.
    2. Vind de optimale lengte, L0, gedefinieerd als de spier lengte die maximale twitch kracht geven, door het verhogen van de spier lengte en het activeren van de spier met een enkele twitch totdat de actieve kracht (piekkracht minus Baseline kracht) stopt met verhogen.
    3. Voer een korte tetanic contractie (1 s activering) om de montage te testen en strek de spier terug naar optimale basislijn kracht indien nodig. Noteer de spier lengte in mm met een digitale remklauw.

3. röntgendiffractie

Opmerking: De volgende beschrijving is voor röntgendiffractie-experimenten uitgevoerd met behulp van het kleine hoek röntgendiffractie-instrument op de biocat beamline 18id bij de Advanced photon source, het Argonne National Laboratory maar vergelijkbare methoden kunnen worden gebruikt op andere lijnen zoals ID 02 bij het ESRF (Frankrijk) en BL40XU op SPring8 (Japan). Beamline 18ID wordt bediend met een vaste X-Ray Beam-energie van 12 keV (0,1033 nm golflengte) met een incident flux van ~ 1013 fotonen per seconde in de volle straal.

  1. Kies een preparaat naar detector afstand (camera lengte). Gebruik een 1,8 m camera lengte voor experimenten met de 2,7 nm actine en High-order myosin reflecties zoals 2,8 nm Meridionale reflecties. Gebruik een 4-6 m camera voor andere experimenten, waarbij men primair geïnteresseerd is in fijn detail op de meridiaan en laag lijnen
  2. Het optimaliseren van de positie van het monster in Beam
    1. Bepaal de stralings positie met behulp van een stukje Röntgen gevoelig papier dat een donkere vlek produceert als reactie op röntgenstralen ("een brandwond"). Gebruik vervolgens een video cross-Hair generator om een kruis haar te maken dat is uitgelijnd met de brand markering op het papier of maak gewoon een markering op het videoscherm met een marker pen.
    2. Gebruik de BioCAT meegeleverde grafische gebruikersinterface van de sample Positioner om de spier te bewegen om gecentreerd te worden op de stralings positie. Oscilleren de bemonsterings kamer bij ~ 10-20 mm/s door de monster fase te bewegen om de Röntgen dosis over de spier te spreiden tijdens de blootstelling. Observeer het monster terwijl het beweegt om grote gebieden van fascia te vermijden (bevat collageen dat de diffractie patronen zal vervuilen) en om ervoor te zorgen dat het tijdens het hele traject van zijn reis verlicht blijft.
      Opmerking: De exacte stappen die nodig zijn in de paragrafen 3,3 en 3,4 om de vereiste instellingen en acties te maken met behulp van de door beamline geleverde grafische gebruikersinterface, zijn beamline en detector specifiek. Vraag beamline-medewerkers hoe u deze bewerkingen uitvoeren.
  3. Het instellen van de CCD (opladen gekoppeld apparaat) detector voor hoge resolutie patronen van spier in gedefinieerde statische toestanden (rusten, of tijdens isometrische contractie)
    1. Stel de belichtingstijd en belichtingsperiode in de grafische gebruikersinterface in op de besturingssoftware. Neem een donkere achtergrondafbeelding voordat u de belichting inneemt en herhaal deze procedure om de 2 uur of na het wijzigen van de belichtingstijd om eventuele drift in de uitlezen elektronica van de melder te corrigeren.
    2. De X-Ray-straal naar de gewenste waarde voor de belichting verzachten. Neem dan een foto. Het is niet mogelijk om sequenties van beelden te nemen met deze detector. De CCD-detector heeft ook enkele seconden nodig om een individueel beeld te lezen.
  4. De pixel array-detector instellen voor een tijd opgelost experiment
    1. Stel het aantal afbeeldingen, belichtingstijd, belichtingsperiode in de grafische gebruikersinterface in. De pixel array detector die hier wordt gebruikt, moet minimaal 1 MS uitlezen. De maximale framefrequentie voor foon teldetector is 500 Hz. gebruik het uitgangssignaal van de foton teldetector om de X-Ray sluiter te bedienen.
    2. De straal naar de gewenste intensiteit verzwakken. Arm de detector en wacht tot de trigger van het data-acquisitie systeem. Synchroniseer de mechanische en Röntgen gegevens door ze op hetzelfde moment te activeren. De Röntgen patronen worden continu verzameld gedurende het protocol a met een belichtingstijd van 1 MS en een blootstellingsperiode van 2 MS.
      Opmerking: De exacte blootstellingstijd en blootstellingsperiode moeten per geval worden bepaald voor de gewenste informatie en de waargenomen levensduur van het monster in de straal. De straal te verzachten om niet meer röntgenstraal te gebruiken dan nodig is om analyseerbaar gegevens te leveren in de gekozen blootstellingsperiode.

4. post-experiment spier behandeling

  1. Herstel en weeg de spier na elk mechanisch en Röntgen experiment. Bereken het dwarsdoorsnede gebied van de spier met behulp van de gemeten spier lengte en de spier massa11 uitgaande van een spier dichtheid van 1,06 g/ml12.
  2. Strek de spier tot de experimentele lengte en bevestig de spier in 10% formaline 10 min. Scheid de vaste spier in een reeks van vezelbundels geselecteerd uit locaties over de gehele spier doorsnede3.
  3. Meet de sarcomere lengte met behulp van een video sarcomere lengte meetsysteem.

Resultaten

Isometrische tetanische contractie. Elke vorm van klassieke spier mechanisch experiment, zoals isometrische of isotone contracties, kan worden uitgevoerd met gelijktijdige overname van Röntgen patronen. Figuur 1 A toont de experimentele Setup voor mechanische en Röntgen experimenten. Een voorbeeld van een Force trace voor een isometrische tetanische contractie wordt weergegeven in Figuur 1B. De spier werd gehouden in rust voor 0,5 s voordat geactiveerd voor 1 s. De mechanische opname stopt 1 s na de stimulus. De Röntgen patronen werden continu verzameld gedurende het protocol bij 1 MS belichtingstijd bij 500 Hz.

Diffractie patronen van röntgenstraling. De spier X-Ray diffractie patroon kan geven nanometer resolutie structurele informatie uit de structuren in de sarcomere. Spier röntgendiffractie patronen zijn samengesteld uit vier equivalente kwadranten gedeeld door de evenaar en de meridiaan. Het equatoriale patroon vloeit voort uit de myofilament pakking binnen de sarcomere loodrecht op de vezel as, terwijl de Meridionale patronen structurele informatie van de myofilamenten langs de spier as rapporteren. De overgebleven reflecties niet op de evenaar of de meridiaan worden laag lijnen genoemd. Laag lijnen (bijv. kenmerken met het label MLL4 en ALL6 in Figuur 2A) vloeien voort uit de ongeveer-spiraalvormige indeling van moleculaire subeenheden binnen de myosine die dikke filamenten bevat en de actine met dunne filamenten. De myosin-gebaseerde laag lijnen zijn sterk en scherp in patronen van rust spier (Figuur 2A), terwijl actin-gebaseerde laag lijnen prominenter zijn in patronen van contracterende spieren (Figuur 2B). Verschil patronen verkregen door het rust patroon af te trekken van het contract patroon (Figuur 2C) kan licht werpen op structurele veranderingen tijdens de ontwikkeling van de kracht in een gezonde en zieke spier. Door deze structurele veranderingen op de milliseconde tijdschaal van de moleculaire gebeurtenissen tijdens spiercontractie te volgen, kunnen de röntgendiffractie patronen substantiële structurele informatie onthullen (Figuur 2D).

Gegevensanalyse met behulp van MuscleX. Hier is een voorbeeld van equatoriale reflecties analyse met behulp van de "Equator" routine in het MuscleX-pakket (Figuur 3). MuscleX is een open-source analyse softwarepakket ontwikkeld bij BioCAT13. De equatoriale intensiteits ratio (I1, 1/i1,0) is een indicatie van de nabijheid van myosine tot actine in rust spier (Figuur 3A), terwijl het nauw gecorreleerd is met het aantal bijgevoegde dwars bruggen bij contracteren ( Figuur 3B) Murine skeletspier2. De intensiteit ratio, I1, 1/i1,0, is ongeveer 0,47 in rust spier en over 1,2 in de contracterende spier. De afstand tussen de twee 1,0-reflectie (2 * S1,0) is omgekeerd gerelateerd aan de afstand tussen de gloeidraden. Gedetailleerde documentatie en handleidingen voor MuscleX zijn online beschikbaar13.

figure-results-1
Figuur 1 : Mechanische en X-Ray experiment Setup en protocol. A) de spier is aan het ene uiteinde gemonteerd op een haak in de experimentele kamer en het andere uiteinde op een motor/kracht transducer met twee modi. Het wordt gehouden tussen twee Kapton film Vensters om de X-stralen te laten passeren. De kamer is gevuld met Ringer's oplossing geperfectiongebruikt met 100% zuurstof gedurende het experiment. B) het mechanische protocol voor Röntgen experimenten op een spier tijdens tetanische contractie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 : EDL X-Ray diffractie patronen. EDL spier X-Ray diffractie patroon van rust (a) en contracting (B) spier. C) het verschil patroon tussen rust-en contractpatroon. De blauwe regio geeft hoge intensiteit in rust patroon, terwijl de gele regio hoge intensiteit in het contract patroon vertegenwoordigt. D) röntgendiffractie patroon van een blootstelling van 1 MS met EDL-spier. MLL1 = eerste orde myosin laag lijn; MLL4 = vierde orde myosin laag lijn; ALL1 = eerste order actine Layer line ALL6 = zesde orde actine laag lijn; ALL7 = zevende orde actine laag lijn; TM = tropomyosine reflectie (aangegeven door een witte doos); M3 = derde orde Meridionale reflectie; M6 = zesde orde Meridionale reflectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3 : Gegevensanalyse van equatoriale patronen met behulp van MuscleX. De achtergrond van het equatoriale intensiteits ratio Profiel (terwijl gebied) en de eerste vijf orders (groene lijnen) waren geschikt om de intensiteit van elke piek te berekenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Recente publicaties van onze groep toonde aan dat Röntgen patronen van de muis skeletspieren kunnen worden gebruikt om licht te werpen op sarcomeric structurele informatie van spier in gezondheid en ziekte1,2,3 vooral met de toegenomen beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde Muismodellen voor verschillende myopathieën. Hoge resolutie mechanische studies op enkelvoudige vezels of kleine bundels gecombineerd met röntgendiffractie is best gedaan door experts. Als, echter, meer bescheiden mechanische informatie zal volstaan voor uw doeleinden, de hele spier voorbereiding maakt het verzamelen van gedetailleerde Röntgen patronen van een eenvoudige voorbereiding.

Een clean dissectie is de sleutel tot een succesvol gecombineerd mechanisch en Röntgen experiment. Het is zeer belangrijk niet te trekken op de doel-spier, alsmede andere spieren in verband met de soleus of EDL spieren tijdens dissectie omdat dit kan scheuren delen van de spier en leiden tot verminderde kracht. Het kan ook leiden tot beschadigde interne structuur die de Röntgen patronen zal degraderen. Aangezien alles in de röntgenstraal zal verstrooien, is het belangrijk om elk extra vet, het collageen in de fascia en alle haren of losse stukjes weefsel weg te poetsen terwijl u het volgende protocol doet. Om extra compliance in de spier bereiding te verminderen, is het ook belangrijk om de pezen veilig aan de haken te binden, zo dicht mogelijk bij het spier lichaam zonder het te beschadigen.

Verschillende X-Ray blootstellings tijden kunnen verschillende soorten informatie van dezelfde spier bevatten. Met behulp van de volledige bundel op 18ID, kan een analyseerbaar equatoriale patroon worden verkregen in een blootstelling van 1 MS (Zie Figuur 2D). Voor een analyseerbaar eerste myosin laag lijn reflectie, is een totale blootstellingstijd van 10 MS meestal vereist. Om een hogere orde Meridionale reflecties te verzamelen, zoals de M15 (2,8 nm myosin Meridionale reflectie) en de 2,7 nm actine Meridionale reflectie, is doorgaans ten minste 1 s totale blootstelling vereist, maar meer dan 2 s totale blootstelling wordt aanbevolen voor hoge nauwkeurigheid Metingen.

De keuze van de optimale Röntgen detector voor het experiment is belangrijk. Voor de meest gedetailleerde Röntgen patronen kan een op maat gemaakte CCD-detector, zoals die bij BioCAT met ca. 40 μm pixels en ~ 65 μm punt spreidings functies in de fosfor, patronen bieden met een hoog dynamisch bereik en een goede ruimtelijke resolutie, maar kan slechts één frame tegelijk duren. Voor tijd opgeloste experimenten kan de foton Counting pixel array detector bij biocat X-Ray patronen verzamelen bij 500 Hz. De pixelgrootte van 172 μm met deze detector biedt echter niet voldoende ruimtelijke resolutie voor gedetailleerde studies van het binnenste gedeelte van de meridiaan, maar is geschikt voor de meeste andere doeleinden. BioCAT verwierf een high-resolution fotonen teldetector met een reële resolutie van 75 μm met een maximale framesnelheid van 9.000 Hz. soortgelijke detectoren van dit type worden verwacht dat ze de huidige detectoren voor spier studies in de komende jaren te supplanten.

Met de zeer hoge fluxen van röntgenstralen bij de derde generatie synchrotrons is stralings schade een ernstige zorg. Het is altijd een goede keuze om de bundel te verzachten om geen straal meer te leveren dan nodig is om de gewenste diffractie-functies te observeren. Dezelfde totale blootstelling aan röntgenstraling kan worden bereikt door de belichtingstijd te verlengen van een verzwakte straal. Een voordeel van foton tellen pixel array detectoren is dat individuele frames samen kunnen worden opgeteld zonder geluidsoverlast. Zelfs dan is stralings schade mogelijk. Tekenen van stralings schade omvat een daling van de maximale kracht van contractie, het uitsmeren van de laag lijn reflecties, zelfs verandering van spier kleur.

Een van de beperkingen van de intacte muis skeletspieren voorbereiding is de moeilijkheid in het verkrijgen van sarcomere lengte van de intact spier tijdens de experimenten. De spieren zijn te dik voor video microscopie en laserdiffractie. Terwijl met toekomstige ontwikkelingen kan het mogelijk zijn om sarcomere lengte direct te schatten uit de diffractie patronen14, in de nabije toekomst is de enige optie om het te meten na het experiment zoals hier beschreven.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek gebruikte middelen van de Advanced photon source, een Amerikaanse afdeling van het ministerie van energie van de v.s., die voor het DOE-kantoor van de wetenschap door Argonne National Laboratory werd geëxploiteerd onder contract nr. DE-AC02-06CH11357. Dit project werd gesteund door Grant P41 GM103622 van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health. Gebruik van de Pilatus 3 1M detector werd geleverd door Grant 1S10OD018090-01 van NIGMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences of de National Institutes of Health.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#5 forcepsWPI500342
4/0 chirurgische hechtdraadBraintree SciSUT-S 108
Aquarium luchtsteenuxcelleen gewone luchtsteen uit een dierenwinkel zou prima zijn
CaCl2Sigma-AldrichC5670
CCD detectorRayonix IncMAR 165 CCD
Data-acquisitiesysteemAurora Scientific Inc610A
ElastomeerverbindingDow CorningSylgard 184
GlucoseSigma-AldrichG8270
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoge resolutie fotonteldetectorDectris IncEIGER X 500K
Krachtige bifasische stroomstimulatorAurora Scientific Inc701
Iris schaarWPI501263-G
KClSigma-AldrichP9541
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro schaarWPI503365
Motor/krachttransducerAurora Scientific Inc300C-LR
NaClSigma-AldrichS9888
PetrischaalSigma-AldrichCLS430167
FotonteldetectorDectris IncPilatus 3 1M
Roestvrijstalen draadMcMaster-carr8908K21
NaaihingklemmetjeWPI504498
Video sarcomeerlengtemeetsysteemAurora Scientific Inc900B

Referenties

  1. Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
  2. Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  3. Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
  4. Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
  5. Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
  6. Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
  7. Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
  8. Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  9. National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
  10. Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
  11. Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
  12. Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
  13. Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
  14. Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transgene muisstructurele analysesynchrotron beamlinespierpreparaatkrachttransducerr ntgenpatroonequatoriale reflecties

Gerelateerde artikelen