Methodenartikel

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

DOI:

10.3791/59570

⸱

8 augustus 2019

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een hoge doorvoer plasmide transfectie van zoogdiercellen in een 384-goed plaat met behulp van akoestische druppel ejectie technologie. De tijdrovende, foutgevoelige DNA-afgifte en multiplexing, maar ook de transfectie-reagens afgifte, zijn softwaregestuurd en worden uitgevoerd door een nanodispenser apparaat. De cellen worden vervolgens in deze voorgevulde putten gesest.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celtransfectie, onmisbaar voor veel biologische studies, vereist het beheersen van vele parameters voor een nauwkeurige en succesvolle prestatie. Meestal uitgevoerd bij lage doorvoer, het is bovendien tijdrovend en foutgevoelig, nog meer als multiplexing verschillende plasmiden. We ontwikkelden een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode om celtransfectie uit te voeren in een 384-well plate layout met behulp van Acoustic druppel uitwerp (ADE) technologie. De nano dispenser apparaat gebruikt in deze studie is gebaseerd op deze technologie en maakt nauwkeurige nano volume levering op hoge snelheid van een bron goed plaat naar een bestemming een. Het kan DNA-en transfectie-reagens verdelen en multiplex volgens een vooraf ontworpen spreadsheet. Hier presenteren we een optimaal protocol om op ADE gebaseerde plasmide transfectie met hoge doorvoer uit te voeren, wat het mogelijk maakt om een efficiëntie van maximaal 90% en een bijna 100% cotransfectie in cotransfection experimenten te bereiken. We breiden het initiële werk uit door een gebruiksvriendelijke macro op spreadsheet voor te stellen, die maximaal vier plasmiden/putten kan beheren uit een bibliotheek met maximaal 1.536 verschillende plasmiden en een Tablet-gebaseerde Pipetteer hulplijn toepassing. De macro ontwerpt de noodzakelijke template (s) van de bron plaat (en) en genereert de kant-en-klare bestanden voor de nano dispenser en Tablet-based applicatie. Het transfectie-Protocol van vier stappen omvat i) een verdunningsmiddel dat met een klassieke vloeistofhandler, II) plasmide distributie en multiplexing, III) een transfectie-reagens van de nano dispenser, en IV) celplating op de voorgevulde putten. De beschreven software-gebaseerde controle van ADE plasmide multiplexing en transfectie maakt het zelfs niet-specialisten in het veld mogelijk om een betrouwbare celtransfectie op een snelle en veilige manier uit te voeren. Deze methode maakt snelle identificatie van optimale instellingen voor een bepaald celtype mogelijk en kan worden omgezet naar een hogere schaal en handmatige benaderingen. Het protocol vergemakkelijkt toepassingen, zoals humaan ORFeome eiwit (set van open Lees kaders [Orf's] in een genoom) expressie of CRISPR Cas9 gebaseerde genfunctie validatie, in niet-gepoolde screening strategieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe DNA-plasmide multiplexing en transfectie in zoogdiercellen bij hoge doorvoer te voeren met behulp van een akoestische vloeibare nano dispenser in een 384-well plaat, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Deze onlangs gepubliceerde methode1 maakt het uitvoeren van zoveel 384 onafhankelijke plasmide DNA multiplexing en transfectie voorwaarden in één experiment, in minder dan 1 h. enkelvoudige of cotransfectie experimenten waren succesvol en bereikten een nabije 100% cotransfectie binnen de populatie van de getransfunteerde cellen. Dit protocol maakt transfectie gemakkelijker omdat de meeste vervelende, tijdrovende en foutgevoelige stappen nu software-gedreven zijn (Zie afbeelding 1 voor een algemeen overzicht). Er zijn verdere inspanningen geleverd om speciale instrumenten te ontwikkelen om het gebruiksgemak te verbeteren en tegelijkertijd menselijke fouten tijdens het algehele proces te voorkomen en om succesvolle Transfectie te bevorderen, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Het beschreven protocol bevat een "gebruiksvriendelijk" macro-spreadsheet dat we hebben ontwikkeld om 384 onafhankelijke transfectie condities te beheren met multiplexing mogelijkheden van maximaal vier plasmiden in elke put. De macro genereert automatisch sjablonen van de bron plaat (en) om het verwachte DNA-plasmide volume te laden bij het starten van voorraadoplossingen en de bestanden die nodig zijn om de nanodispenser software te best Epen op het experimentele ontwerp dat is ingevoerd. Omdat het handmatig doseren van DNA in een 384-bron plaat vervelend en foutgevoelig is, ontwikkelden we ook een speciale Tablet-gebaseerde applicatie om de gebruiker te begeleiden tijdens het doseren van de DNA-oplossing volgens de sjabloon.

figure-introduction-1
Figuur 1: experimentele workflow. Schematische weergave van het optimale geautomatiseerde omgekeerde transfectie protocol met hoge doorvoer (van experimenteel ontwerp tot aangepaste biologische assay). Handmatige stappen worden aangegeven door het hand symbool en de geschatte tijd voor elke stap wordt in een rood vak geschreven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Veel op cellen gebaseerde experimenten beginnen met plasmide DNA-transfectie, en zelfs als veel speciale reagentia zijn en nog steeds worden ontwikkeld om de transfectie-efficiëntie te verbeteren en/of de procedure te verlichten, moet er nog veel worden gedaan2,3 , 4. DNA plasmide celtransfectie omvat verschillende stappen om een hoog rendement te bereiken, zoals een initiële complexe opname, endosomale ontsnapping en cytoplasmisch transport naar de Nucleus5,6. Naast calcium neerslag of fysische technieken zoals elektroporation of Microinjection met behulp van speciale apparaten7, moderne chemische methoden hebben gericht op het verbeteren van DNA-cel levering terwijl het verlagen van de cel cytoxiciteit8, 9. Het gebruik van lipiden of kationische polymeren die liposomen-achtige complexen vormen en, meer recentelijk, nonliposomale polymere chemie systemen heeft transfectie gemakkelijker en efficiënter gemaakt10. Ondanks deze ontwikkelingen vereist celtransfectie nog steeds dat specifieke vaardigheden nauwkeurig worden uitgevoerd, omdat de meeste van deze fysische of chemische transfectie protocollen wetenschappers verplichten om handmatig elke DNA-transfectie reactie voorwaarde voor te bereiden, dus de doorvoer aantasten. Om dit probleem te omzeilen, zijn reverse transfectie-protocollen ontwikkeld met behulp van chemische transfectie reagentia11,12,13, waardoor de gebruiker meerdere plasmiden op een snellere manier kon testen of combineren. In deze protocollen worden nucleïnezuur complexen met transfectie reagentia gevormd voordat de cellen op de complexen worden zaaien. Deze omgekeerde protocollen worden echter nog steeds beperkt door de manuele behandeling van DNA-oplossingen en door de combinatie van elk van de onafhankelijke voorwaarden. Hoewel het haalbaar is om ze uit te voeren in een 96-goed plaat formaat, zullen de DNA-voorbereiding en-bedeling vervelend zijn en zullen er waarschijnlijk fouten zijn. Wanneer verschillende hoeveelheden van verschillende DNA plasmiden nodig zijn en Multiplexed met elkaar, wordt celtransfectie nog moeilijker te bereiken en meer tijdrovende, en menselijke fouten worden heel onvermijdelijk. Opschalen naar de 384-well plate formaat in een omgekeerde transfectie aanpak, ondanks enkele Multiplexed DNA transfectie omstandigheden, wordt een onmogelijke uitdaging om de volgende redenen. i) de DNA-bedragen, het transfectiereagens of het reactiemengsel dat moet worden beheerd, zijn voor elke put lager dan 1 μL. II) de multiplexing van plasmiden voor 384 onafhankelijke omstandigheden wordt uiterst ingewikkeld. De levering in elk van de 384 Wells is ook III) zeer tijdrovend en IV) foutgevoelig. Inderdaad, het doseren van de juiste oplossing in de verwachte putten is moeilijk te beheren omdat de lage volumes die al zijn gedoseerd geen visuele controle tussen de lege en reeds gevulde putten toestaan. v) ten slotte is er een hoog risico op het drogen van het mengsel door verdamping voordat de cellen worden toegevoegd als gevolg van de tijd die nodig is om de nodige doseerstappen uit te voeren. Samengevat, de beperkende factor voor het instellen van een hoge doorvoer DNA plasmide transfectie-assays lijkt de miniaturisatie van de assay te zijn, wat een laag volume multiplexing en beheer inhoudt dat niet meer handmatig kan worden afgehandeld, maar ook nauwelijks haalbaar is in een betrouwbare manier door klassieke peristatische vloeistof behandellers.

Als een bewijs van moeilijkheden om dergelijke testen te automatiseren en hoge doorvoer te krijgen, zijn er tot nu toe slechts een paar pogingen om Transfectie te automatisering gepubliceerd: a 96-well plate Format met behulp van een commerciële vloeistof handling apparaat en calciumfosfaat neerslag14 en, meer recentelijk, een lipoplex-reagens en een microfluïdische chip die 280 onafhankelijke transfecties mogelijk maakt15 , maar die gespecialiseerde vaardigheden op dit gebied vereisen. Een andere methode, acoustophoresis, die vloeistof levitatie mogelijk maakt en leidt tot vloeiende manipulatie en menging, werd gebruikt om DNA-transfectie uit te voeren in 24-tot 96-well plate formaten16. Hoewel haalbaar, deze aanpak lijdt aan een extreem lage doorvoer als het mengen van cellen met DNA-transfectie mengsel vereist een 60 s incubatie voor elk afzonderlijk punt voor het zaaien. Dit impliceert een duur van minstens 96 min voor een complete 96-well plaat. Bovendien is dit protocol verre van vatbaar voor het publiek van de algemene biologen, omdat dit werk werd gedaan met een in-House ontworpen en gefabriceerd apparaat dat momenteel niet op de markt verkrijgbaar is. Integendeel, in de afgelopen jaren is een eenvoudig te gebruiken software-gestuurde, op akoestiek gebaseerde doseertechnologie ontstaan met nano volume dispenser apparaten. Met behulp van gerichte akoestische energie, kunnen deze apparaten de strak gecontroleerde ejectie van kleine vloeibare volumes van 2,5 nL naar 500 nL van een bron plaat naar een bestemming één17. Deze technologie, genaamd Acoustic druppel uitwerp (ADE), heeft tal van voordelen: het is volledig geautomatiseerd, contactloos, tipless, nauwkeurig, nauwkeurig en zeer reproduceerbaar, en heeft een hoge doorvoer18. Voor het eerst gewijd aan het leveren van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) oplossingen, zijn de instellingen verbeterd om water buffers te doseren19. Akoestische nano dispensers lijken dan geschikt voor Reverse Cell transfectie protocols en kunnen de meeste van bovengenoemde handmatige beperkingen omzeilen. Omdat er voorheen geen plasmide transfectie pogingen werden beschreven met behulp van deze technologie, evalueerden we onlangs de geschiktheid van een akoestisch-gebaseerd doseersysteem om omgekeerde celtransfectie uit te voeren.

Door de doorvoer en het gebruiksgemak van de nano dispenser te benutten, hebben we een reverse transfectie-protocol voor HeLa-cellen geoptimaliseerd door verschillende parameters te cross-testen die de DNA-trans fectie op een 384-put, één plaat kunnen beïnvloeden, namelijk de totale DNA-hoeveelheid en Bron-DNA start concentratie, verdunnings vloeistofvolume, transfectie reagens, en aantal verspreidings cellen. Het ontwikkelde protocol omzeilt de hierboven beschreven handmatige beperkingen van celtransfectie en presenteert verschillende voordelen ten opzichte van andere geautomatiseerde transfectie pogingen. Ten eerste wordt het geminiaturiseerd, waardoor kostenbesparend transfectie-reagens kan worden bespaard door DNA-plasmide preparaten en transfectie-reagens op te slaan. Ten tweede, het is veel meer hoge doorvoer en reproduceerbare dan de handmatige Protocol (zelfs voor beginners), als transfectie van een hele 384-goed plaat kan worden bereikt in minder dan 1 h. Tot slot, het is software-gedreven, waardoor de controle van de gedoseerde DNA-hoeveelheid en de multiplexing van verschillende plasmiden. Inderdaad, dankzij de nano dispenser software (tabel van de materialen), kan de gebruiker een studie plan uitwerken om de volumes te controleren die van een gedefinieerde bron goed plaat naar een bestemming worden gedoseerd.

Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is vooral bedoeld voor diegenen die toegang hebben tot een nano dispenser en die transfectie experimenten willen opzetten met een hoge doorvoer, maar ook voor diegenen die hun transfectie parameters voor een bepaald celtype snel willen optimaliseren door Dit protocol toepassen om verschillende parameters bij hoge doorvoer te cross-testen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat geoptimaliseerde parameters geïdentificeerd met dit nanoschaal protocol kunnen worden omgezet in grotere schaal en handmatige transfectie experimenten. Ten slotte, aangezien het in dit Protocol gebruikte transfectie reagens DNA of siRNA transfectie toestaat volgens de fabrikant, is het protocol ook van belang voor diegenen die zich richten op het uitvoeren van array benaderingen voor genoverexpressie of knockdown. De bestemmings platen die met DNA zijn gevuld, kunnen tot 7 dagen voor gebruik in een transfectie test worden bewaard zonder verlies van werkzaamheid, wat een ander voordeel is van het volgende protocol voor dit soort toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereidingen

  1. Bereiding van de peristaltische vloeistofhandler Programma's
    Opmerking: voor de stappen van het verdunningsmiddel en de celdosering van het protocol moet een speciaal programma worden opgesteld, rekening houdend met de hoogte van de doseer kop tot de gebruikte plaat en de stap intentie.
    1. Monteer voor de 1 μL verdunnings vloeistof doseerstap een 1 μL cassette en bereid een programma voor met de instellingen zoals beschreven in de stappen 1.1.1.1 en 1.1.1.2.
      1. Pas de stroomsnelheid parameter op hoog voor de beste doorvoer als er geen biologische materiële schade wordt verwacht in deze stap. Stel de doseer hoogte in op 9,6 mm (afhankelijk van de gebruikte celkweek plaat, aanvullend figuur 1) zodat de druppel van 1 μL de bodem van de putjes tijdens de dispensatie kan aanraken.
        Opmerking: deze stap is cruciaal om te voorkomen dat de druppeltjes op de doseer kop worden vastgehouden totdat er voldoende volume is om te laten vallen.
      2. Stel de plaat duidelijke hoogte in op 14,4 mm om een vrije verplaatsing van de doseer kop over de plaat toe te laten na elke rij. Visuele controle van de juiste instellingen van de peristaltische vloeistof handler hoofd hoogte: Zorg ervoor dat er geen druppels worden vastgehouden op de doseer tips tijdens het doseren en controleer of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het doseren van elke rij.
        Opmerking: het vermijden van druppel retentie is een cruciale parameter omdat het de nauwkeurigheid van het volume van de dispensatie zal aantasten.
    2. Voor de afgifte van de celsuspensie van 40 μL, Monteer een cassette van 10 μL en bereid een programma voor met de instellingen zoals beschreven in de stappen 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Pas de stroomsnelheid parameter op laag om cellen te doseren met een lage snelheid om te voorkomen dat het bevorderen van potentiële schade aan de cellen door shear stress en hoge impact op de bodem van de putten. Stel de dispensatie hoogte in op 11,43 mm (volgens de gebruikte celkweek plaat, aanvullend figuur 1), hoog genoeg om de celimpact op de bodem van de putjes tijdens het doseerproces te verlagen, maar laag genoeg om retentie van de druppels op de Doseer kop. Stel de plaat met een duidelijke hoogte in op 16 mm, zodat de doseer kop vrij kan worden Verplaatsbaar na elke rij.
      2. Visuele controle van de juiste instellingen van de peristaltische vloeistof handler hoofd hoogte: Zorg ervoor dat er geen druppels worden vastgehouden op de doseer tips tijdens het doseren en controleer of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het doseren van elke rij.
        Opmerking: het vermijden van drop retentie is een cruciale parameter, omdat het zal leiden tot het doseren van een onbetrouwbaar celnummer.
  2. DNA plasmide preparaat (klassieke miniprep extractie Protocol)
    1. Groeien een getransformeerde DH5α bacteriestam in LB medium aangevuld met 125 μg/mL ampicillaire selectie antibioticum (tabel van de materialen) 's nachts bij 37 °c en onder zachte opwinding (200 rpm) op een rondschudapparaat (tabel van materialen).
    2. Oogst 2 mL van de cultuur, pellet de cellen door te centrifugeren gedurende 5 minuten bij 6.000 x g, en gooi de supernatant.
    3. Hervat de celpellet met 250 μL resuspensie buffer met RNase A (tabel metmaterialen). Voeg 250 μL lysisbuffer toe en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Stop de lysisreactie door het toevoegen van 300 μL neutralisatie buffer (tabel met materialen) en vortexting kort. Centrifugeer de buisjes gedurende 5 min bij 11.000 x g.
    5. Plaats een nieuw plasmide minicolumn (tabel met materialen) in een 2 ml opvang buisje en decanteer het supernatant in de kolom door gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 11.000 x g.
    6. Gooi de doorstroom weg en plaats de minicolumn terug in het opvang buisje.
    7. Was het plasmide minicolumn met 500 μL optionele wasbuffer (tabel met materialen) en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g, volgens de instructies van de fabrikant.
    8. Gooi de doorstroming weg en plaats het plasmide minicolumn terug in het opvang buisje.
    9. Voeg aan de hand van de instructies van de fabrikant 700 μL wasbuffer (tabel met materialen) toe, aangevuld met ethanol en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
    10. Gooi de doorstroming weg en Centrifugeer het plasmide minicolumn en zijn opvang buis 1x meer gedurende 2 minuten bij 11.000 x g om het silica membraan te drogen.
    11. Plaats het gedroogde plasmide minicolumn in een nieuwe tube van 1,5 mL en Voeg 30 μL gedistilleerd water toe, voorverwarmd bij 60 °C, inbroed het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en Centrifugeer het gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
    12. Gooi het plasmide minicolumn weg en houd het eluaat met het gezuiverde DNA plasmide.
    13. Meet de DNA-concentratie van het eluteerde DNA met behulp van een microvolume spectrofotometer (tabel met materialen).
      1. Schakel de spectrofotometer in en kies de instellingen voor de DNA-meting .
      2. Verhoog de monsternemings arm van de spectrofotometer en Pipetteer 1 μL water op het maat voetstuk om een blanco kalibratie uit te voeren.
      3. Verlaag de bemonsterings groep, start de lege meting en wacht tot de voltooiing is voltooid.
      4. Til de monsternemings-arm omhoog en veeg het monster af van de bovenste en onderste sokkels.
      5. Pipetteer 1 μL van de DNA-oplossing op het onderste voetstuk om het te meten.
      6. Verlaag de bemonsterings groep, start de meting van de DNA-concentratie en wacht tot de voltooiing is voltooid.
      7. Til de monsternemings-arm omhoog en veeg het monster af van de bovenste en onderste sokkels.
      8. Herhaal stap 1.2.13.5-1.2.13.7 voor verdere DNA-concentratiemetingen.
    14. Nadat de metingen zijn voltooid, bewaart u de DNA-oplossingen bij 4 °C tot het gebruik.

2. experimenteel ontwerp en generatie van de selectielijsten om de ade-gebaseerde afziet te stimuleren

Opmerking: een speciale "gebruiksvriendelijke" spreadsheet macro is ontwikkeld om DNA-bedragen te beheren en tot vier plasmiden te mengen in een 384-well plate-formaat. Op basis van het ingevoerde experimentele ontwerp genereert deze macro de benodigde bestanden om het op ADE gebaseerde DNA-transfectie Protocol van nano dispenser te stimuleren. Om deze bestanden te genereren, moeten verschillende velden worden ingevuld in het sjabloon blad zoals weergegeven in afbeelding 2.

figure-protocol-1
Figuur 2 : Het genereren van de selectielijsten om de ade-dispensatie te stimuleren met behulp van de werkblad macro. Er moeten verschillende parameters worden ingevuld, namelijk (1) het transfectiereagens (tr) en de minimale/maximale volumes die in de bron plaat moeten worden gebruikt (2) de aanvankelijke plasmide concentraties die in de bron plaat moeten worden afgeleverd, en (3) de geheel plaat ontwerp, met inbegrip van de verwachte plasmide bedragen en multiplexing in elk van de 384-Wells. (4) bij activering van selectielijsten kunnen de verschillende velden worden geverifieerd en, eenmaal correct ingevuld, piclijsten voor DNA-en TR-dispensatie en de noodzakelijke bron plaat sjabloon worden automatisch gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Voer de parameters voor het nanodispenser protocol in de roze velden in. Stel de waarde van het mengsel van transfectie reagens (tr) in op 500 nl. Stel de minimale volume waarde in de bron plaat putjes in op 4 μL. Stel het maximale volume in de bron plaat in op 11,25 μL.
    Opmerking: de hier gebruikte nano dispenser kan slechts een maximum van 500 nL in één run van ADE overdragen. Deze roze velden zijn vooraf gevuld met de aanbevolen waarden, maar kunnen worden aangepast volgens de behoeften van de gebruiker.
  2. Voer 100 ng/μL DNA start concentraties in de blauwe velden die overeenkomen met het onderliggende DNA.
    Opmerking: deze waarde is de optimale concentratie die eerder is gedefinieerd, maar kan echter worden aangepast voor verschillende gebruikersbehoeften.
  3. Voer de gewenste DNA-hoeveelheid in de grijze/groene velden in. Voer de hoeveelheden en plasmide namen in voor de 384 Wells en zorg voor dezelfde spelling als dezelfde plasmide in verschillende putjes wordt gebruikt.
  4. Genereer het bron plaat ontwerp, de picklijsten-bestanden en het Pipetteer hulplijn bestand. Klik op picklijsten genereren om toe te staan dat de macro de DNA-picklist. CSV, de T. R.-picklist. CSV en de 384-Wells-Pipetting-Guide. CSV-bestanden genereert van gegevens die zijn verzameld op het bijbehorende blad. Corrigeer desgevraagd de oranje gevulde celwaarden, omdat deze fouten of volumes aangeven die niet door de nano dispenser kunnen worden afgehandeld.
  5. Print de sjabloon (en) uit het blad van de bron plaat . Plasmide namen en minimaal volume om de putjes in te vullen zijn geïndiceerd. Evenzo, transfectie reagens mengsel volumes die volgende moeten worden ingevuld in de volgende putten worden aangegeven als tr en gemarkeerd in het groen.

3. DNA-bron plaat voorbereiding met behulp van de 384-well Pipetteer Guide applicatie

  1. Verdun het opgeslagen DNA plasmide van stap 1.2.14 tot 100 ng/μL met gedestilleerd water.
  2. Kalibreer de 384-well grid naar de afmetingen van de plaat: Open de toepassing 384-well Pipetteer Guide op een Tablet (Figuur 3). Plaats de bron plaat in het raster op het onderste scherm en klik in het kalibratiemenu linksboven op + of - (of gebruik de rode cursor) om de grootte van het raster en de putten te verbeteren of te verkleinen om de groene putjes aan te passen aan de vierhoek putten van de plaat .

figure-protocol-2
Figuur 3 : Gebruik van de 384-well Pipetteer Guide-applicatie. (1) kalibratie van de 384-well grid naar de plaatgrootte; (2)) bevestiging van een universele 3D-printed Plate adapter op de Tablet met behulp van dubbelzijdige tape; (3) plaatsing van de plaat op de adapter; (4) verplaatsing van het rooster om het op de gemonteerde plaat te centreren. (5) vergrendeling van de kalibratie stap. (6) opening van het 384 Wells Pipetteer Guide. CSV-bestand. (7) gezien de bestandslijst zal de aanvraag de verwachte naam van de bron plaat, het reagens (DNA-of transfectiereagens), de concentratie en het volume van de doel putten aangeven, die één voor één zullen worden verlicht. (8) met de linker-en rechter pijltjestoetsen kan de gebruiker de Pipetteer gids volgen om de reagentia eenvoudig te doseren volgens de template (s) van de werkblad macro bron plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Monteer met dubbelzijdige tape de 3D-geprinte plaat adapter op het scherm om bron plaat bewegingen tijdens het doseren te voorkomen. Verplaats indien nodig het gekalibreerde raster met behulp van de knoppen rotatie pijlen en omhoog/omlaag/rechts/links om het raster op het scherm aan te passen aan de plaat positie. Zodra het rooster en de goede maten goed zijn gekalibreerd en zich bevinden, vinkt u het vakje kalibratie vergrendelen aan.
  2. Klik op bestand en open het bestand 384 Wells Pipetteer Guide. CSV . Volg de instructies op het scherm om het aangegeven volume van het aangegeven plasmide bij de aangegeven concentratie in het witte, gemarkeerde goed dat overeenkomt met de juiste Doelbestemming van de verwachte plaat, handmatig te doseren. Gebruik - of + pijlen om terug te gaan of verder in het DNA-doseerproces. Stop met doseren bij het bereiken van de eerste Transfection reagens oplossing om te laden.
  3. Zodra de DNA-bedelingen zijn voltooid, verwijdert u de bron plaat van de adapter. Als er meerdere bron platen moeten worden gevuld, plaatst u een nieuwe bron plaat op de adapter en volgt u de doseer instructies. Zodra de DNA-dispensatie is voltooid, centrifugeer je de DNA-gevulde bron plaat (en) (bij 1.500 x g gedurende 2 minuten) om een goede vloeistof nivellering te garanderen en bubbels te verwijderen die leiden tot onnauwkeurigheid in de ade-gebaseerde transfers.

4. peristaltische vloeistofhandler-gebaseerde 1 μL verdunningsmiddel-dispensatie in de bestemmings plaat

Opmerking: Voer de stappen 4.1-4.5 in een biologische veiligheidskast uit.

  1. Desinfecteer de 1 μL-cassette kop door deze te spuiten met een sproei ontsmettingsmiddel (tabel met materialen) en laat deze oplossing de tiphouder binnengaan. Absorbeer het restant ontsmettingsmiddel op absorberend papier. Monteer de 1 μL-cassette op de peristaltische vloeistof handlerinrichting. Schakel het apparaat in en zorg ervoor dat de instelling van het cassette type correct is (1 μL), evenals het plaat formaat (384 Wells).
  2. Desinfecteer het gehele lumen van de slang: plaats de buis Organizer (die de acht buisjes bij elkaar houdt) in een steriel vat en vul deze met 5 mL 70% alcohol. Gebruik de priming-functie van de peristaltische vloeistof behandelaar, spoel eerst de alcohol in de slang en spoel het vervolgens door 5 mL gedestilleerd water en 5 mL serumvrij medium door te geven (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [DMEM] aangevuld met 100 U/mL penicillaire-streptomycine; Van het materiaal), opeenvolgend in hetzelfde vat vullen. Zorg ervoor dat geen van de tip is verstopt door visueel inspecteren van de vloeistof stroom van alle van hen.
  3. Prime de slang met serumvrij medium door het vullen van een nieuw steriel vat met 10 mL voorverwarmde serum-vrij medium en duiken de tube Organizer erin. Druk voor ongeveer 10 sec. op de Prime-knop van de peristaltische vloeistof behandelaar. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen tip is verstopt door het visueel inspecteren van de vloeistof stroom van alle van hen.
  4. Vul de plaat met 1 μL verdunningsmiddel. Plaats een steriele 384-put cultuur plaat (bestemming) op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel.
  5. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 1 μL te doseren in elke put van de 384-well plate. De doseer tijd is ongeveer 8 sec. Vervang dan de deksel van de 384-well plate.
    Opmerking: als alternatief kan deze stap handmatig worden afgehandeld, in een veiligheidskast, met behulp van een multichannel micropipet.

5. uitvoering van een enquête om de handmatig uitgebeerde volumes te beheren

Opmerking: Zie afbeelding 4voor meer informatie.

  1. Voer het nanodispenser programma uit, ga naar het tabblad diagnostisch, Vink het vakje bron plaat uit , laad de bron plaat op de plaathouder en vink aan om de plaat in te voeren. Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u 384Ldv_aq_b2 om de nano dispenser in te stellen op de waterbuffer Doseer modus en drukt u op OK.
  2. Selecteer enquête in het menu Diversen Klik op starten. Selecteer de vooraf ingevulde putten om te analyseren en klik op de knop Ga naar . Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte hoeveelheden en zorg ervoor dat er geen putjes zijn geladen met volumes van meer dan 12 μL, omdat dit overdrachten vermijdt.

figure-protocol-3
Figuur 4 : De parameters van de enquête software definiëren. (1) start het nanodispenser programma. (2) Open het tabblad Diagnostische gegevens . (3) Steek de bron plaat door het uittikken van de bron plaat en vervolgens, in. (4) Definieer het type bron plaat in het menu wanneer hierom wordt gevraagd. (5) Selecteer in het vak Diversen enquête in het vervolgkeuzemenu. (6) start het enquête programma door op startente klikken. (7) Selecteer de vooraf ingevulde putjes om te meten. (8) start de analyse door op Go te klikken. (9) zodra de enquête is uitgevoerd, worden de gemeten volumes in de desbetreffende geselecteerde putjes geschreven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. ADE-gedreven DNA-dispensatie in de bestemmings plaat

  1. Voer de selectielijst software uit, stel de 384-bron-en doelplaat typen in op respectievelijk 384_LDV en Greiner 384PS_781096 (Figuur 5). Stel het apparaat in op een waterige buffer Doseer modus door 384ldv_aq_b2te selecteren en vink "Optimaliseer overdrachts doorvoer" uit.

figure-protocol-4
Figuur 5 : Prestaties van de op selectielijst gebaseerde bedelingen. (1) start de nanodispenser software. Selecteer op het tabblad Protocol (2) het monster plaat formaat, (3) het type doelplaat en (4) "Optimaliseer overdrachts doorvoer". (5) Selecteer het tabblad picklijst . (6) Klik op importeren en selecteer het juiste *. CSV-bestand (DNA-picklist of T.R.-selectielijst). (7) eenmaal geselecteerd, klik op import. (8) Klik op afspelen en sla het protocol op. (9) Voer een dispensatie simulatie uit door te klikken op simuleren, of (10) start de geprogrammeerde dispensatie door te klikken op uitvoeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Selecteer het tabblad "picklijst", klik op importeren, selecteer het bestand DNA-picklist. CSV. Klik op afspelen en sla het protocol op. Klik op simuleren om een simulatie van de geprogrammeerde bedelingen uit te voeren om ervoor te zorgen dat de selectielijst overeenkomt met het verwachte experimentele ontwerp. Eenmaal voltooid, klikt u op sluiten.
  2. Klik op afspelenen vervolgens op uitvoerenom het Doseer programma te starten: wanneer u hierom wordt gevraagd, plaatst u de gevraagde bron plaat (DNA-oplossingen handmatig gevuld) en de bestemmings plaat (verdunningsmiddel gevuld) in de nano dispenser.
    Opmerking: de doseer tijd is ongeveer 5-20 min voor een complete 384-well plaat, afhankelijk van de geselecteerde volumes en het totale aantal bedelingen in het experimentele ontwerp.
  3. U het protocol ook hier pauzeren, omdat het verdunningsmiddel en de met DNA gevulde platen gedurende maximaal 7 dagen kunnen worden verwerkt in droge of bevroren opslag. Voor droge opslag, laat de platen op de Bank drogen op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens op dezelfde manier. Ontdooien en centrifugeren (bij 1.500 x g gedurende 2 min) bevroren opgeslagen platen voor gebruik in een transfectie stap (rubriek 7).
     

7. ADE-gedreven transfectie reagens dispensatie

  1. In een bioveiligheid Cabinet, extemporaal verdund lipopolyplex transfectie reagens in serumvrij medium tot een 1x eindconcentratie. Vortex en breng deze transfectie-reagens mengsel onmiddellijk aan volgens de vooraf gedefinieerde bron plaat (en) die door de macro is ontworpen en met behulp van de toepassing voor geprealibreerde 384-well Pipetteer Guide zoals beschreven in stap 3,4.
    Let op: Centrifugeer de bron plaat niet nadat deze met het reagens is geladen, omdat er na centrifugeren geen transfectie wordt opgemerkt.
  2. Voer het nanodispenser programma uit om een "onderzoek" uit te voeren zoals beschreven in punt 5, om de volumes van alle handmatig gevulde tr -putten van de bron plaat (en) te regelen om afgifte fouten te voorkomen als gevolg van een volume van meer dan 12 μL.
  3. Klik op resetten om de voorbeeld lijst van de DNA-selectie List in de selectielijst-software te wissen en controleer of de apparaatparameters nog steeds zijn ingesteld op waterige buffers en op de gebruikte bron-en bestemmings plaat typen, zoals in stap 6,1.
  4. Klik op importeren en kies het bestand tr-picklist. CSV. Klik op afspelen en sla het protocol op als hierom wordt gevraagd, en (optioneel maar sterk aanbevolen) Voer een simulatie uit van de geprogrammeerde transfectie reagens mengsel bedelingen om een goed ontwerp van de bedelingen te garanderen door te klikken op de Knop simuleren . Eenmaal voltooid, klikt u op sluiten.
  5. Klik op afspelenen vervolgens op de knop uitvoeren om het Doseer programma te starten: plaats, zoals gevraagd, de bron plaat (en) (tr-mengsel-gevuld) en de bestemmings plaat (verdunningsmiddel-en DNA-gevuld) in de nano dispenser.
    Let op: de doseer tijd is minder dan 20 min voor een complete 384-well plate bij afgifte 500 nL van TR mengsel.
  6. Incuberen 15-30 min bij kamertemperatuur na toevoeging van het TR aan het DNA zoals aangegeven door het Protocol van de fabrikant.

8. celdispensatie op basis van peristaltische vloeistof behandelaar

  1. Bereid de peristaltische vloeistof handler voor het doseren van cellen. Desinfecteer een cassette hoofd van 10 μL door het te spuiten met Aniospray Surf 29 desinfecterende middelen en het restant op papier te absorberen. Monteer de cassette op het apparaat van de peristaltische vloeistof handler, wijzig de cassette type-instelling in 10 μL en zorg ervoor dat het plaat formaat is ingesteld op 384 Wells.
  2. Desinfecteer de cassette slang van 10 μL zoals eerder beschreven in stap 4,2. Duik de tube Organizer in een steriel vat en spoel de slang met 5 mL 70% alcohol, vervolgens met 5 mL gedistilleerd water en ten slotte met 5 mL serumvrij medium, achtereenvolgens gevuld in hetzelfde vat en tot elke buis leeg is.
  3. Bereid de celsuspensie uit om te doseren. Was vanuit een confluente HeLa Cell B10-Culture Dish de cellen 1x met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en dissocier vervolgens de cellen met trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  4. Controleer de celdissociatie onder een microscoop en stop de trypsine/EDTA-actie door 10 mL volledig medium toe te voegen (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 U/mL penicillaire-streptomycine; Zie de materiaallijst) in de kweek schaal. Oogst cellen in een buis van 50 mL en Tel de cellen onder de microscoop met behulp van een Malassez-cel of een automatische celteller.
  5. Bereid ten minste 25 mL HeLa celsuspensie bij een concentratie van 37.500 cellen/mL in volledig medium (d.w.z. 1.500 cellen/40 μL) voor een volledige 384-goed plaat, om te zorgen voor het primen van de buis en 40 μL/put-dispensatie.
  6. Om de cellen te doseren, vult u een nieuw steriel vat met de bereide celsuspensie en roer het om sedimentatie te voorkomen die leidt tot onnauwkeurigheid in de celdichtheid van de dispensatie. Plaats de tube Organizer in deze oplossing en druk op de Prime -knop totdat de celsuspensie begint te spoelen vanaf de doseer kop. Zorg ervoor dat geen van de tip verstopt is door de vloeistofstroom van alle van hen visueel te inspecteren en ervoor te zorgen dat elke buis is geladen met celsuspensie.
  7. Laad het DNA en de TR-gevulde 384-put bestemmings plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 40 μL van de celsuspensie op de volledige 384-goed plaat te doseren (d.w.z. 1.500 cellen/goed). De doseer tijd is ongeveer 8 sec. Vervang de deksel van de 384-well plate.
    Opmerking: als alternatief kan de celsuspensie van 40 μL handmatig worden afgeleverd met behulp van een multikanaalmicropipet.

9. aangepaste biologische assay (Cell transfectie efficiency monitoring)

Opmerking: Volg de experimentele instellingen en intentie van het experiment, gebruik de vereiste methoden voor luminescentie, fluorescentie, High-content screening en omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR). In deze sectie van het protocol wordt de efficiëntie van de celtransfectie geëvalueerd door geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse.

  1. Inbroed de plaat bij 37 °C met 5% CO2 in een met water verzadigde atmosfeer en tot een juiste proteïne-expressie.
    Opmerking: hier wordt een incubatietijd van 48 uur gebruikt voor HeLa-cellen om de transfectie-efficiëntie te bewaken met behulp van tdTomato-en mVenus-uitdrukken plasmiden.
  2. Verwijder het kweekmedium 48 h na transfectie door de plaat om te inverteren, Voeg 30 μL/goed van 10% formaline toe met behulp van de peristaltische vloeistof behandelaar (10 μL cassette) en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de formaline door de plaat te inverteren; vervolgens incuberen de cellen 15 min bij kamertemperatuur met 0,1 ng/mL Hoechst verdund in 1x PBS-oplossing.
  4. Was de cellen 3x gedurende 15 minuten met 80 μL 1x PBS, aangepast aan pH = 8 om het hoge fluorescentie signaal te herstellen dat verloren gaat door de 6,9 pH van de incubatie stap van de formaline-oplossing.
  5. Met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende Microscoop, het verwerven van beelden van twee of drie fluorescerende kanalen (Hoechst, tdtomato, en mvenus) opeenvolgend met 10x doelstellingen en een juiste emissie filter set (4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI], dsred, en fluoresceïne respectievelijk isothiocyanaat [FITC]).
  6. Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, gebruikt u Image Analysis software om de transfectie-efficiëntie te bepalen met behulp van script analyse op basis van kernen-kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fIn order om te bepalen of de ade-technologie kan worden gebruikt voor een geautomatiseerd reverse transfectie-protocol, bewaken we de efficiëntie van de celtransfectie door fluorescentiemicroscopie, met behulp van een rood fluorescerende tdtomato die plasmide uitdrukt. Eerst gericht op het bepalen van de beste transfectie parameters, verschillende verdunnings vloeistofvolumes en totale hoeveelheden DNA werden Kruis getest. Het volume van het verdunningsmiddel werd gebruikt om de DNA-drup...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het opzetten en optimaliseren van een nauwkeurige hoge doorvoer transfectie methode voor een bepaalde cellijn vereisen wetenschappers om een aantal belangrijke parameters beschreven in deze sectie te volgen. We moedigen ten zeerste aan om te beginnen met de aanbevolen waarden in het Protocol, omdat deze instellingen die zijn geoptimaliseerd voor HeLa-cellen ook efficiënt bleken te zijn voor HEK-cellen. Aangezien de beste parameters echter afhankelijk kunnen zijn van de cellijnen en transfectie reagentia, kunnen optimale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs onthulde een ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel: INSERM, Universiteit van Lille, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, PRIM-HCV1 en 2 (Pôle de recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence nationale de la recherche (ANR-10-EQPX-04-01), de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). De auteurs willen Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément en Dr. H. Groult bedanken voor hun kritische beoordeling en correcties van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
384LDV MicroplateLabcyteLP-0200
384-well Microplate μClear BlackGreiner781906
AmpicilinSigmaA9393-5GSelectie-antibioticum voor bacteriën getransformeerd met een ampicilline-expresserend vector
Android TabletSamsungGalaxy Note 8wordt gebruikt om de gebruiker te begeleiden tijdens het handmatig doseren van de bronplaat
Aniospray Surf 29Anios2421073ontsmettingsmiddel om de MicroFlo-kop te reinigen
Columbus softwarePerkin Elmerbeeldanalysesoftware
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo Fisher Scientific10566032celkweekmedium
Echo Cherry Pick 1.5.3 softwareLabcyteSoftware die ADE-gebaseerde doseringen mogelijk maakt door het Echo550-apparaat vanuit een *.csv-bestand; nanodispenser software
Echo550LabcyteADE-gebaseerde dispenser
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000044om toe te voegen in celkweekmedium
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lom cellen te fixeren
HeLa cellsATCCHeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH357010 mg/mL-oplossing in water
INCell Analyzer 6000GE Healthcare29043323geautomatiseerde lasergebaseerde confocale beeldvormingsplatform
LB mediumThermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, poeder		12780052kweekmedium voor bacteriegroei
Lysis Buffer (A2) Macherey-Nagel740912.1Buffer uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
MicroFlo 10µL cassetteBiotek Instruments Inc7170013te gebruiken met de Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassetteBiotek Instruments Inc7170012te gebruiken met de Microflo Dispenser
MicroFlo DispenserBiotek Instruments Inc7171000peristaltische pomp-gebaseerd vloeistofhandelaarsapparaat
Microvolume spectrophotometerDenovixDS-11 SpectrophotometerMeet de DNA-concentratie van monsters
mVenus plasmidmVenus cDNA werd gekloond door enzymatische restrictiedigestie en ligatie in Age1/BsrG1-plaatsen van het tdTomato-N1-plasmideVectortype: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3) Macherey-Nagel740913.1Buffer uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
NucleoSpin Plasmid kitMacherey-Nagel740588.50wordt gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) MediumThermo Fisher Scientific31985070
optionele Wash bufferWash Buffer (A4)Macherey-Nagel740914.1Buffer uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
orbital shaker groot capaciteitsincubatie shaker444-7084Wordt gebruikt om bacteriën te laten groeien onder zachte agitatie en 37°C
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210.000 U/mL
Phosphate-Buffered SalineThermo Fisher Scientific10010001
Plasmid mini-columnsMacherey-Nagel740499.250Silica-membraan mini-kolom om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
Resuspension Buffer (A1) Macherey-Nagel740911.1Buffer uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
RNAse AMacherey-Nagel740505Enzym uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
tdTomato-N1 plasmidAddgenePlasmid #54642Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery SystemMirus BioMIR 6000
Wash Buffer (AW)Macherey-Nagel740916.1Buffer uit de NucleoSpin Plasmid kit gebruikt om plasmide uit bacteriecultuur voor te bereiden
3D printerCrealityCR10Swordt gebruikt om de plaatadapter af te drukken
Blender Software  https://www.blender.org/
Gratis software onder GNU General Public License (GPL).		versie 2.79bwordt gebruikt om de plaatadapter te ontwerpen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36(2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4(2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1(2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937(2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023(2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High throughput transfectieADE technologie384 wells plaatspreadsheet macronanodispenser protocolceltransfectieplasmidendistributietransfectiereagens

Gerelateerde artikelen