Methodenartikel

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

11.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59573

⸱

9 mei 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

In dit artikel

Samenvatting

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Samenvatting

Lipoprotein deeltjes zijn overwegend vervoerders van lipiden en cholesterol in de bloedbaan. Bovendien bevatten ze kleine hoeveelheden van niet-codering microRNA (miRNA). In het algemeen, verandert miRNA het eiwit uitdrukkings profiel toe te schrijven aan interactie met boodschapper-RNA (mRNA). Zo is kennis van het relatieve en absolute miRNA gehalte van lipoprotein deeltjes essentieel om het biologische effect van cellulaire deeltjes opname te schatten. Hier, een kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qPCR)-gebaseerde protocol wordt gepresenteerd aan de absolute miRNA inhoud van lipoprotein deeltjes te bepalen-geïllustreerd getoond voor native en miRNA-verrijkte lipoprotein deeltjes. Het relatieve miRNA-gehalte wordt gekwantificeerd met behulp van multigoed microfluidic array kaarten. Bovendien, dit protocol kunnen wetenschappers de raming van de cellulaire miRNA en, dus, de lipoprotein deeltjes opnamesnelheid. Een significante toename van de cellulaire miRNA niveau is waarneembaar bij het gebruik van high-density lipoprotein (HDL) deeltjes kunstmatig geladen met miRNA, overwegende dat incubatie met inheemse HDL-deeltjes levert geen significant effect als gevolg van hun vrij lage miRNA inhoud. In tegenstelling, de cellulaire opname van lage dichtheid lipoprotein (LDL) deeltjes-noch met native miRNA, noch kunstmatig geladen met het-heeft geen invloed op de cellulaire miRNA niveau.

Inleiding

Lipoprotein deeltjes zijn samengesteld uit een monolayer van amphiphilic lipiden en cholesterol die een kern van cholesteryl esters en triglyceride vetten insluiten. Het gehele deeltje wordt gestabiliseerd door membraan-ingebedde apolipoproteins, die de biologische functionaliteit van het deeltje bepalen. Lipoprotein deeltjes kunnen worden onderscheiden volgens hun respectieve toenemende dichtheid en, dus, afnemende grootte, namelijk als zeer lage dichtheid lipoprotein (VLDL), intermediaire-density lipoprotein (IDL), LDL, en HDL-deeltjes. Ondanks het vervoer van water-onoplosbare componenten in de bloedbaan, is aangetoond dat HDL-deeltjes dragen niet-codering strengen van Mirna1,2. Micro-ASE is een klasse van korte (gewoonlijk twee dozijn nucleotiden) de bundels van RNA, die intracellulair complementaire mRNA bundels afbreken en, daardoor, het uitdrukkings Profiel van bepaalde proteïnen3,4,5veranderen, 6. Bovendien zijn de veranderingen van het profiel van miRNA gevonden in een verscheidenheid van ziekten en, dus, is het profiel toepasselijk als biomarker voor diagnose en prognose. De extracellulaire transport van miRNAs tussen cellen via lipoprotein deeltjes kan dienen als een extra mechanisme voor intercellulaire mRNA niveau modulatie. Om het biologisch effect kwantitatief te schatten, is kennis over het absolute en relatieve miRNA gehalte van lipoprotein deeltjes nodig.

Kwantitatieve PCR in real time is een geschikte en vrij snelle methode om deze informatie te bereiken. Vandaar, kan de relatieve kwantificatie (ov) waarde worden berekend, en de relatieve verschillen tussen verschillende steekproeven en lipoprotein fracties zijn ramen. Multigoed microfluidic array kaarten zijn een snelle en makkelijk te gebruiken methode om de relatieve aanwezigheid te bepalen (komt overeen met de OV-waarde) van miRNAs in een sample. Multiwell-microfluidic array kaarten bestaan uit 96 of 384 individuele reactie kamers voor individuele qPCR reacties ingebed in een microvloeiend apparaat. Elke kamer bevat de vereiste hydrolyse sonde en specifieke qPCR primers voor een individuele miRNA. De voordelen zijn een korte verwerkingstijd als gevolg van standaardisatie, een eenvoudige workflow en een beperkt aantal pipetten stappen. Bovendien wordt het vereiste sample volume geminimaliseerd. In tegenstelling tot de relatieve kwantificering vereist het absolute miRNA-gehalte een vergelijking van qPCR steekproefresultaten met standaard krommen van bekende absolute nummers van miRNA strengen. Opgemerkt moet worden dat, vanwege hun relatief lage miRNA inhoud, standaard en bovendien zelfs single-molecule gevoelige beeldvormende technieken niet haalbaar zijn-de kunstmatige verrijking van lipoprotein deeltjes met miRNA is onvermijdelijk om cellulaire studie lipoprotein deeltjes interactie en miRNA Transfer. Ten aanzien van deze, delipidatie van het HDL-deeltje gevolgd met latere relipidation7 maakt de integratie van en, dus, verrijking met Mirna strengen. De gelijkaardige verrijking van LDL deeltjes met miRNA is niet haalbaar toe te schrijven aan de hydrophobicity van apoB-100 proteïne, die het belangrijkste bestanddeel van het deeltjes LDL is. Echter, door toevoeging van het polaire oplosmiddel dimethyl sulfoxide (DMSO), die in staat is te penetreren lipide membranen, LDL-deeltjes kunnen kunstmatig worden geladen met miRNA strengen ook.

High-Speed Atomic Force microscopie (HS-AFM) is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van biologische specimens met subnano meter ruimtelijke en subsecond temporele resolutie8. Vandaar, is het een goed-geschikte techniek voor de kwaliteitsbeheersing van gewijzigde lipoprotein deeltjes als inheems/opnieuw samengesteld/geëtiketteerde lipoprotein deeltjes kunnen onder een dichtbijgelegen-fysiologisch milieu worden afgebeeld.

Hier wordt een qPCR-gebaseerd protocol gepresenteerd stap voor stap om de absolute/relatieve miRNA inhoud van lipoprotein deeltjes en cel monsters te bepalen, die een schatting van de cellulaire lipoprotein deeltjes opnamesnelheid mogelijk maakt. Bovendien wordt een methode voor de verrijking van lipoprotein deeltjes met miRNA aangetoond. Deze methode kan worden aangepast voor de algemene manipulatie van lipoprotein inhoud en, vandaar, demonstreert de toepasselijkheid van lipoprotein deeltjes als doelstellingen voor druglevering.

Protocol

Bloeddonaties zijn goedgekeurd door de ethische Commissie, medische universiteit van Wenen (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016). De nomenclatuur is volgens de minimum informatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR experimenten (MIQE)9 richtlijnen.

1. lipoprotein deeltjes isolatie van menselijk bloed

  1. Precool een ultracentrifuge tot 4 °C. Teken bloed van gezonde vrijwilligers na overnachting vasten.
    Opmerking: typisch vereist zijn drie donoren, doneren 80 mL elk, en bloedafname buizen met ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) als antistollings.
  2. Centrifugeer bij 2.000 x g voor 20 min bij 4 °c en oogst plasma (hogere fase); Vermijd shear krachten. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Meet de massa van 1 mL 3x en bereken de gemiddelde dichtheid ρ.
  3. Bereken de vereiste hoeveelheid kaliumbromide (KBr) voor dichtheids aanpassing met de volgende vergelijking10 (voor de gewenste dichtheid in gram/milliliter, gebruik A = 1,019, en voor het specifieke volume van KBr, figure-protocol-1 gebruik = 0,364 ml/g). Voeg KBr toe aan het plasma en roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr is volledig opgelost.
    figure-protocol-2
  4. Meet de dichtheid zoals beschreven in stap 1,2 en pas, indien nodig, opnieuw aan door meer KBr toe te voegen. Vul en Seal centrifuge buizen geschikt voor ultracentrifugation met plasma. Vermijd luchtbellen; anders kan de buis instorten. Plaats de buizen in de rotor volgens de instructies van de fabrikant en centrifugeer bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c.
  5. Open de tubes volgens de instructies van de fabrikant en gooi de bovenste fase met VLDL en IDL weg. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS.
  6. Bepaal de dichtheid ρ van de onderste Fractie. Bereken de vereiste hoeveelheid KBr voor dichtheids aanpassing (gebruik A = 1,063). Roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr wordt opgelost. Herhaal stap 1,4.
  7. Verwijder en verzamel de bovenste fase met LDL-deeltjes. Bewaar de LDL-deeltjes oplossing onder een inerte gas-atmosfeer bij 4 °C. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS. Bepaal de dichtheid ρ van de onderste fractie zoals beschreven in stap 1,2.
  8. Bereken de vereiste hoeveelheid KBr voor dichtheids aanpassing (gebruik A = 1,220) en voeg het toe. Roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr wordt opgelost. Herhaal stap 1,4.
  9. Verwijder en verzamel de bovenste fase met HDL-deeltjes. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS. Bepaal de dichtheid ρ. Een tweede Centrifugeer stap van de hogere fase bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c wordt geadviseerd om albumine te verwijderen. Herhaal indien nodig stap 1,8. Verwijder en verzamel de bovenste fase met HDL-deeltjes.
  10. Bereid en precool ten minste 20 L dialyse buffer (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) tot 4 ° c. Prewet dialyse buizen (molecuulgewicht cut-off: 12 – 14 kDa) en voeg de LDL-en HDL-deeltjes oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Dialyze tegen 5 L dialyse buffer bij 4 °C en verander de buffer na 1, 2, en 4 h.
  11. Na 24 h, terug te vorderen van de lipoprotein deeltjes oplossingen van de dialyse buizen en bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford assay11 of een andere geschikte is. Bewaar de HDL en LDL particle oplossingen onder inert gas atmosfeer bij 4 °C.

2. synthetische miRNA-hoeveelheid

Nota: wanneer het behandelen van RNA oligonucleotides, werk ASE-vrij. Werk alleen met verse, wegwerp plastic verbruiksartikelen en draag altijd handschoenen, die moet regelmatig worden veranderd. Gebruik alleen Nuclease-gratis oplossingen. Altijd werken op ijs.

  1. Spin vaststelling van de flacon verkregen van de fabrikant bij maximale kracht om een pellet van de gelyofiliseerde synthetische miRNA te vormen. Voeg een passend volume toe van 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) buffer, pH 7,5, voor een eindconcentratie van 10 µ M (Stock concentratie) miRNA.
  2. Voorzichtig op en neer een paar keer pipet voor hersuspensie. Bereid de hoeveelheid van 100 µ L elk in steriele buizen. Bewaar ze bij-20 ° c indien niet onmiddellijk gebruikt. Voorkom herhaald ontdooien en invriezen.

3. reconstitutie van HDL-deeltjes

  1. Delipidatie
    1. Bereid buffer A voor (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM tris/HCl [pH 8,0]). Precool de centrifuge tot-10 °C. Precool 100 mL van een mengsel van ethanol: diethyl ether (3:2) bij-20 °C.
      Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rook kap tijdens het hanteren van diethyl ether omdat het zeer licht ontvlambaar en schadelijk voor de huid is.
    2. Meng een volume dat overeenkomt met 5 mg HDL-deeltjes met 50 mL van de voorgekoelde ethanol: diethyl ether (3:2) mengsel en incubeer voor 2 h bij-20 °C. Centrifugeer bij 2.500 x g voor 10 min bij-10 °c.
    3. Gooi de bovendrijvende, hersuspendeer de pellet in 50 mL van voorgekoelde ethanol: diethyl ether mengsel door vortexen, en broeden een tweede keer voor 2 uur bij-20 ° c. Centrifugeer opnieuw bij 2.500 x g voor 10 min bij-10 °c.
      Opmerking: indien gewenst, lyophilize de bovendrijvende voor een analyse van de miRNA-inhoud in de lipiden Fractie van de HDL-deeltjes.
    4. Droog de pellet onder N2 gas flow en opnieuw op te schorten in 250 µ l van buffer a (zie stap 3.1.1). Bepaal de eiwitconcentratie gebruikend de eiwitanalyse van Bradford of een andere aangewezen één en Verdun aan een definitieve concentratie van 1 mg van proteïne/250 µ L van buffer A.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar de oplossing 's nachts bij 4 °C onder inert gas atmosfeer.
  2. Reconstitutie
    1. Bereid een fosfatidylcholine (PC) stockoplossing met behulp van een mengsel van chloroform: methanol (2:1) bij een concentratie van 5,6 mg PC/mL. Evenzo, voor te bereiden stockoplossingen van cholesteryl OLEAAT (5 mg CO/mL) en cholesterol (5 mg C/mL). Bewaar alle oplossingen bij-20 °C.
    2. In een schone glazen buis, Meng 500 µ L van PC, 100 µ L van CO, en 13,5 µ L van C. Deze volumes corresponderen met een geschatte Kies verhouding van 100 PC: 22 CO: 4.8 C. droog het mengsel onder N2 gasstroom terwijl het roteren van de buis om een homogene oppervlakte laag op te leveren.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar de glazen flacon (indien gewenst, opslag is mogelijk) onder inert gas atmosfeer bij-20 °C.
    3. Bereid een verse 30 mM spermidinespermine oplossing in buffer A. Meng een hoeveelheid (100 µ L, 10 µ M) van synthetische miRNA (zie stap 2,2) met 100 µ L van spermidinespermine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.
      Opmerking: voor negatieve controle experimenten vervangt u de miRNA-en/of spermidinespermine-oplossing met hetzelfde volume buffer A.
    4. Ontbinden van een PC/CO/C Master Mix hoeveelheid in het mengsel van stap 3.2.3.
    5. Bereid een oplossing van 30 mg/mL natrium deoxycholate in buffer A en voeg 50 µ L toe aan de oplossing van stap 3.2.4. Roer bij 4 °C voor 2 uur.
    6. Voeg 250 µ L van de delipidated HDL oplossing van stap 3.1.4. Dit volume beantwoordt aan een geschatte Kies verhouding van 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL proteïnen. Roer bij 4 °C 's nachts.
  3. Dialyse
    1. Precool ten minste 15 L van PBS bij 4 °C. Voeg 50 g adsorbens kralen toe aan 800 mL dubbel gedistilleerd water (ddH2O) en roer 1 min. wacht 15 min, Decanteer de bovendrijvende en herhaal de procedure met PBS.
    2. Prewet dialyse cassettes (molecuulgewicht cut-off: 20 kDa) of geschikte dialyse buizen en voeg de oplossing van stap 3.2.6, met behulp van een spuit volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Voeg de adsorbens kralen toe van stap 3.3.1 tot 3 L PBS en dialyze bij 4 °C. Verander de buffer en de kralen na 1 h en 2 h.
    4. Na 24 h, terug te vorderen van de opnieuw samengestelde HDL (rHDL) deeltjes oplossing en bepalen de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford assay. Bewaar de rHDL particle oplossing onder inerte gas atmosfeer bij 4 °C.

4. etikettering van LDL-deeltjes

  1. Bereid 10x LDL buffer voor (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic zuur [EGTA, pH 7,4]) en bewaar het bij kamertemperatuur.
  2. Bereid een verse 30 mM spermidinespermine oplossing in de ASE-vrije water. Meng een hoeveelheid (100 µ L, 10 µ M) van synthetische miRNA (zie stap 2,2) met 100 µ L van spermidinespermine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.
    Opmerking: voor negatieve controle experimenten, vervang de miRNA en/of de spermidinespermine oplossing met hetzelfde volume van 1x LDL-buffer.
  3. Voeg 100 µ L van DMSO toe aan de miRNA/spermidinespermine oplossing van stap 4,2 en Verdun het verder met 1,2 mL van 1x LDL-buffer.
  4. Verdun de LDL-deeltjes oplossing tot een eindconcentratie van ongeveer 4 mg/mL met PBS en meng 450 µ L met 50 µ L van 10x LDL-buffer. Incubeer het voor 10 min op ijs.
  5. Combineer de LDL-particle oplossing van de vorige stap en de miRNA/spermidinespermine/DMSO oplossing (vanaf stap 4,3) en broed het uit voor 2 uur bij 40 °C.
  6. Voer dialyse soortgelijke zoals beschreven in punt 3,3 en sla het label LDL-deeltjes oplossing dienovereenkomstig.

5. kwaliteitscontrole van hervormde/gelabelde lipoprotein deeltjes

Opmerking: voor kwaliteitscontrole kunnen de diameter en de algemene vorm van lipoprotein deeltjes worden bepaald met behulp van bijvoorbeeld AFM of elektronenmicroscopie (EM). Hier, HS-AFM wordt gebruikt om de grootte verdeling van de native/resamengesteld/geëtiketteerd lipoprotein deeltjes te meten.

  1. Verdun de HDL/LDL-deeltjes oplossing in PBS (1:100 – 1:1000) en Incubeer het op vers gekloofd mica voor 5 min. Voor splijten de mica12, druk op plakband tegen het substraat en verwijder de bovenste mica lagen door het trekken van de tape uit.
    Opmerking: afhankelijk van het specifieke AFM-instrument, het observatie gebied en de initiële concentratie van deeltjes moet de verdunningsfactor worden aangepast om individuele deeltjes te observeren.
  2. Na incubatie, spoel het monster met PBS en uit te voeren HS-AFM imaging in PBS en in de tikken modus met cantilevers met de lente constanten van kcant ≪ 0,2 N/m. Het wordt aanbevolen om scan formaten te gebruiken < 1 µm2 en om de Imaging krachten zo laag mogelijk te houden.
  3. Bepaal de hoogte van de afgebeelde deeltjes met betrekking tot de mica oppervlak met geschikte software.
    1. Laad de gegevens in gwyddion (freeware), detecteren de deeltjes via graan analyse (Mark korrels door drempel) en zet de drempel boven de ondergrond achtergrond. De afbeelding afvlakken (veelterm achtergrond verwijderen) de optie gemaskeerde regio uitsluiten kiezen.
    2. Exporteer de hoogtewaarden van de gedetecteerde deeltjes (verdeling van de verschillende graan kenmerken) en herhaal deze stappen voor alle opgenomen beelden. Voer een statistische analyse uit door histogrammen te maken of de functies voor waarschijnlijkheidsdichtheid van de verkregen deeltjes hoogten te berekenen.
  4. Herhaal stap 5.1 – 5.3 met native en opnieuw samengestelde/gelabelde lipoprotein deeltjes en vergelijk de verkregen resultaten om de deeltjes kwaliteit te verifiëren. Als het observeren van puin en/of conglomeraten, gooi het monster.

6. de cultuur van de cel

  1. Grow aanhangende cellen volgens een vastgesteld protocol (bijvoorbeeld ldlA7-SRBI13) tot het bereiken van confluentie.
    Opmerking: verschillende onafhankelijke kamers, afhankelijk van het aantal experimenten (aanbevolen zijn twee kamers per experimentele setting) en negatieve controle experimenten (aanbevolen zijn twee kamers zonder toevoeging van lipoprotein deeltjes) nodig zijn. Bovendien, twee kamers zijn vereist voor de bepaling van de cel nummer.
  2. Wassen de cellen 3x met voorverwarmde Hank de evenwichtige zoutoplossing (Peeters) om cel puin te verwijderen en bedek de cel laag met een passend volume van serum-vrije groeimedium. Voeg een passend volume van lipoprotein particle oplossing om een definitieve concentratie van 50 µ g/mL lipoprotein deeltjes te bereiken. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 voor 16 h.
    Opmerking: afhankelijk van het experimentele ontwerp en de cel lijn, moet de incubatietijd worden aangepast aan een voldoende (dat wil zeggen, meetbare) verhoging van de cellulaire miRNA niveau te bereiken.
  3. Wast de cellen 3x met voorverwarmde (37 °C) Peeters om cel puin/lipoprotein deeltjes te verwijderen en de laag van de cel met een aangewezen volume van serum-vrij middel te behandelen.
  4. Bepaal de dichtheid van de cellen met behulp van een geschikte methode (bijv. hemocytometer, geautomatiseerde cel teller) in ten minste twee onafhankelijke kamers om het aantal cellen in het monstervolume te berekenen van stap 6,3. Dit nummer wordt gebruikt voor normalisatie.

7. de extractie van miRNA van cel en lipoprotein deeltjes steekproeven

Opmerking: de extractie van miRNA uit cellen wordt uitgevoerd met de miRNA extractie Kit met de volgende wijzigingen.

  1. Cel monsters
    1. Precool de centrifuge tot 4 °C. Voeg 350 µ L van lysis reagens elk aan twee kamers met cellen. Als een negatieve controle experiment, gebruik maken van een kamer zonder cellen.
      Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rook kap tijdens de behandeling van lysis reagens als het bevat fenol en AMMONIUMTHIOCYANAATOPLOSSING.
    2. Wacht 3 tot 5 min (afhankelijk van de cel lijn) voor cel loslating. Indien nodig, Controleer voor cel detachement met helderveld microscopie. Pool de inhoud van de twee kamers in een 1,5 mL buis.
    3. Met behulp van een 20 G naald en een 5 mL spuit, meng/verstoren het monster 5x-10x door aspiratie en incubeer voor 5 min. Voeg 140 µ L van chloroform (CHCl3), schud krachtig voor 15 s, en incubeer gedurende 3 minuten.
    4. Centrifugeer bij 12.000 x g voor 15 min bij 4 °c. Daarna, stoppen met het koelen van de centrifuge.
    5. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL Tube; Vermijd fase mengen/contaminatie als de Interphase bevat DNA en de lagere fase bevat eiwitten. Voeg 1,5 x het volume van 100% ethanol toe en meng door pipetten.
    6. Plaats een spin kolom in een 2 mL collectie buis en voeg 700 µ L van het mengsel van stap 7.1.5. Centrifugeer bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Gooi de flow-through en herhaal deze stap met het resterende monstervolume.
    7. Gooi de stroom door en voeg 700 µ L van de eerste Wash buffer aan de spin kolom. Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur.
    8. Gooi de stroom door en voeg 500 µ L van de tweede Wash buffer aan de spin kolom. Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Herhaal deze hele stap een tweede keer met 2 min van de centrifugeertijd.
    9. Plaats de spin kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en Centrifugeer het op volle snelheid voor 1 minuut om het membraan te drogen.
    10. Plaats de spin kolom in een 1,5 mL collectie buis. Voeg 30 µ L van ASE-vrij water in het centrum van het membraan voor elutie en Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 1 min. Herhaal deze hele stap een tweede keer met de eerste doorstroming als elutie oplossing. De omgekeerde transcriptie stap wordt gedaan onmiddellijk na de extractie; anders, bewaar de geëxtraheerde miRNA monsters bij-20 ° c.
  2. Lipoprotein deeltjes
    1. Stel het volume van het monster met de laagste eiwitconcentratie in op 100 µ L (= maximaal sample volume). Bereken de steekproef volumes van de andere steekproeven volgens deze normalisatie, omgekeerd aan hun concentratie. Voor negatieve controle experimenten, gebruik 100 µ L van ASE-vrij water.
      Nota: de normalisatie is niet vereist maar vereenvoudigt de directe vergelijking van resultaten tijdens de qPCR stap en de analyse.
    2. Precool de centrifuge tot 4 °C. Voeg 700 µ L van lysis reagens toe aan het sample volume van Step 7.2.1.
    3. Voer miRNA extractie uit volgens de stappen 7.1.3 – 7.1.10.

8. omgekeerde transcriptie

Opmerking: de omgekeerde transcriptie van miRNA wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde transcriptie Kit met de volgende wijzigingen.

  1. Ontdooi de kit reagentia en de omgekeerde transcriptie primers op het ijs. Bereid de volgende Master mix in een reactiebuis op het ijs: 45,7 µ L van de ase-Vrije H2O, 16,5 µ l van 10x omgekeerde transcriptie buffer, 11 µ l van omgekeerde transcriptie enzym, 2,1 µ l van ASE-remmer, en 1,7 µ l van dNTP mix. Meng zachtjes, niet Vortex.
    Opmerking: de weegschaal is afhankelijk van de steekproef hoeveelheid; Hier wordt het berekend voor 10 reacties.
  2. Label 0,2 mL tubes dienovereenkomstig en meng 7 µ L van de Master mix van stap 8,1 met 5 µ L van de geëxtraheerde monster uit stap 7.1.10 en 3 µ L van omgekeerde transcriptie primer. Meng zachtjes, centrifugeer kort, en bewaar het mengsel op ijs.
  3. Om het zelfde cel aantal voor elke cel lijn te gebruiken, Verminder het steekproef volume van de cel lijn met een hoger globaal cel aantal; Gebruik dit als restvolume om het totale steekproef volume van 5 µ L van ASE-vrij water te bereiken.
    Nota: de lipoprotein deeltjes steekproeven worden reeds genormaliseerd in stap 7.2.1. Verdun voor de standaard curve bereiding een hoeveelheid miRNA achtereenvolgens in het vrije-ASE water en bereken het aantal strengen per monstervolume. Vereist zijn ten minste vijf gegevenspunten binnen het bereik van de resulterende steekproef kwantificatie cyclus (cq) waarden. Meestal zijn de totale verdunningsfactoren, variërend van 102 tot 106 geschikt.
  4. Plaats buizen in de Thermocycler machine en start het volgende programma: 30 min bij 16 °C (gloeiende stap), 30 min bij 42 °C (omgekeerde transcriptie), 5 min bij 85 °C (smeltende stap), en pauze bij 4 °C (opslag). Voer de qPCR stap onmiddellijk na omgekeerde transcriptie uit; anders, bewaar de complementaire DNA (cDNA) gesynthetiseerd uit de miRNA monsters bij-20 ° c.

9. qPCR

  1. Voer een qPCR van de cDNA (omgekeerde getranscribeerd van miRNA) met behulp van een commercieel beschikbare assay (Zie de tabel van materialen) met de volgende wijzigingen.
  2. Dooi alle reagentia (Supermix, ASE-vrije H2O), cDNA steekproeven (van stap 8,4), en de inleidingen op ijs. Bereid de volgende meester mengeling in een reactiebuis op ijs voor: 75 µ L van Supermix, 47,5 µ L van ASE-vrij H2O, 7,56 µ l van inleiding. Meng zachtjes, niet Vortex.
    Opmerking: de weegschaal is afhankelijk van de steekproef hoeveelheid; Hier wordt het berekend voor 10 reacties.
  3. Label 0,2 mL buizen dienovereenkomstig en voeg 2 µ L van de cDNA monster tot 13 µ L van de Master Mix en meng voorzichtig. In het algemeen, meten elk monster 2x.
    Nota: minstens twee negatieve controle steekproeven worden vereist bovendien-gebruik ASE-vrij water als steekproef. Als de kalibratiecurve niet wordt bepaald in dezelfde uitvoering als het monster, is ook een monster van de kalibratiekromme meting vereist. Het wordt gebruikt om elke individuele looppas aan de zelfde reactie efficiency te kalibreren.
  4. Plaats de buizen in de PCR machine en begin het volgende programma: 2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 °C, 15 s bij 95 °C, en 60 s bij 60 °C. Herhaal de laatste twee stappen van het programma tot 50x.
  5. Voor een analyse van de waarden van cq met het de software pakket van de PCR machine, activeer DynamicTube normalisatie (voor de compensatie van verschillende achtergrondniveaus gebruikend het tweede derivaat van elk steekproef spoor) en lawaai helling Correctie (normalisering van het geluidsniveau).
    Opmerking: de cq waarde van de negatieve controle moet meerdere cycli hoger zijn dan de hoogste sample cq waarde.
    1. Voor een kalibratiecurve analyse, bepaal de drempel voor de berekening van de cq voor elke Mirna uit de standaard bochten van elke Mirna individueel, met behulp van de auto-Find drempel functie van het software pakket, en houd het constant voor elke specifieke miRNA.
    2. Voor monsteranalyse, indien nodig, compenseren voor de verschillende reactie-efficiëntie van het monster lopen met het gegevenspunt van de kalibratiecurve monster. De software berekent de cq waarden van de monsters van het drempelniveau van de respectieve kalibratiecurve meting.

10. berekening van de inhoud van miRNA

  1. Kalibratiekromme
    1. Bereken vanaf het aanvankelijke aantal miRNA-strengen per hoeveelheid (100 µ L van 10 µ M miRNA, molecuulgewicht uit de datasheet) en de daaropvolgende serie verdunnings stappen het aantal miRNA-strengen in het monstervolume (het 5 µ L-monstervolume van stap 8,3).
      Opmerking: uitgaande van een omgekeerde transcriptie efficiëntie van 1, dit aantal is gelijk aan het aantal cDNA strengen.
    2. Bereken het aantal cDNA strengen in het steekproef volume van 2 µ L van stap 9,3. Beschouw daardoor de extra verdunningsfactor van 7,5 (de 2 µ L sample volume van stap 9,4 van de 15 µ L sample volume van stap 8,4).
    3. Plot de cq waarde van stap 9.5.1 tegen het aantal strengen nstrengen berekend in stap 10.1.2 in een base-10 semilogaritmisch plot, en passen de gegevenspunten met de volgende regressie curve (M = de helling van de lineaire regressie kromme, B = offset).
      figure-protocol-3
      Bevestig dat de correlatiecoëfficiënt (R2) voor de lijn > 0,99 is.
  2. Lipoprotein deeltjes
    1. Bereken het aantal miRNA strengen per monstervolume met behulp van de gemeten monster cq waarde (Step 9.5.2) en de volgende vergelijking (M en B zijn de kalibratiecurve parameters van de specifieke Mirna).
      figure-protocol-4
    2. Bereken het overeenkomstige aantal lipoprotein deeltjes in het steekproef volume, beginnend van het volume in stap 7.2.1 (100 µ L), zijn bekende concentratie, en de verdere verdunnings stappen (100 µ L-> 30 µ L steekproef volume in stap 7.1.10-> 5 µ L [verdunning 1:6] monster in het totale volume van 15 µ L in stap 8,4-> 2 µ L [verdunning 1:7.5] in stap 9,4). Neem een molecuulgewicht van 250 kDa voor HDL-deeltjes en 3 MDa voor LDL-deeltjes en een 100% herstel van miRNA tijdens de miRNA-extractie stap (het negeren van een lipide bijdrage aan het molecuulgewicht levert een lichte overschatting van het aantal miRNA strengen per lipoprotein deeltje).
    3. Verdeel het aantal miRNA strengen van stap 10.2.1 door het aantal deeltjes berekend in de vorige stap om het aantal miRNA strengen per lipoprotein deeltje op te leveren.
  3. Cellen
    1. Bereken het aantal miRNA strengen per monstervolume volgens stap 10.2.1.
    2. Bereken het overeenkomstige aantal cellen in het steekproef volume volgens stap 10.2.2, beginnend met de aanvankelijke concentratie van het cel aantal die in stap 6,4 wordt gemeten.
    3. Verdeel het aantal miRNA-strengen van 10.3.1 door het aantal cellen dat in de vorige stap is berekend om het aantal miRNA-strengen per cel op te leveren.
    4. Bereken de opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes door de totale hoeveelheid miRNA strengen te delen van de vorige stap na correctie voor de achtergrond miRNA niveau van de cellen verkregen uit een negatieve controle experiment door de miRNA/particle ratio (stap 10.2.3 ) en de incubatietijd (16 uur, zie stap 6,2).

11. multigoed microvloeistoffen arrays

  1. de extractie van miRNA
    1. Voer de extractie van miRNA uit zoals beschreven in stap 7.
  2. Omgekeerde transcriptie
    1. Ontdooi de omgekeerde transcriptie primers, de omgekeerde transcriptie Kit componenten, en MgCl2 (25 mm) op ijs. Voor acht monsters, meng 8 µ L van omgekeerde transcriptie primers (10x), 2,25 µ L van dNTPs met dTTP (100 mM), 16,88 µ L van omgekeerde transcriptase (50 U/µ L), 9,00 µ L van 10x omgekeerde transcriptie buffer, 10,12 µ L van MgCl2, 1,12 µ l van de Inhibitor van ASE (20 U/µ l) , en 1 µ L van Nuclease water.
    2. Meng zachtjes en centrifugeer kort. Voeg 4,3 µ L van omgekeerde transcriptie reactie mix tot 3,5 µ L van geëxtraheerde miRNA in een buis en meng, spin down, en incubeer op ijs voor 5 min. plaats de buizen in een Thermocycler machine en start het volgende programma: 16 °C voor 2 min, 42 °C voor 1 min , en 50 °C voor 1 s herhaalde 40x in totaal, en dan, als stop reactie, 85 °C voor 5 min en houd bij 4 °C tot stopte.
  3. Voor versterking
    1. Ontdooi de primers op het ijs en draai en centrifugeer kort. Meng de preversterking Master Mix (2x) door het wervelen van de fles. Bereid de voorversterker reactie mix volgens de volgende instructie voor acht monsters: 112,5 µ L van preversterking Master Mix (2x), 22,5 µ L van preversterking primers, en 67,5 µ L van Nuclease-vrij water. Kort inverteren en centrifugeren.
    2. Mix 2,5 µ L van de omgekeerde transcriptie reactieproduct van stap 11.2.2 met 22,5 µ L van de voorversterker reactie mix van de vorige stap en omkeren en centrifugeren kort. Incubeer de monsters op ijs voor 5 min.
    3. Plaats de buizen in een Thermocycler machine en broed op de volgende instellingen: enzymactivering bij 95 °C voor 10 min, gloeien bij 55 °C voor 2 min, uitbreiding bij 72 °C voor 2 min, herhaalde 12x: denaturering bij 95 °C voor 15 s en gloeien/uitbreiding bij 60 °C voor 4 min , enzym inactivatie bij 99,9 °C voor 10 min, en 4 °C in de wacht.
    4. Spin down, voeg 7,5 µ L van 1x TE (pH 8,0) en 67,5 µ L van Nuclease-vrij water, omkeren, en centrifugeer kort. De monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 °C voor maximaal 1 week.
  4. qPCR
    1. Meng de Master mix door wervelende de fles. Bereid de PCR reactie mengeling voor één kaart voor: 450 µ L van meester mengeling, 441 µ L van Nuclease-vrij water, en 9 µ L van het voorversterker steekproef van stap 11.3.4. Kort inverteren en centrifugeren.
    2. Laad elke vulling reservoir van de multiwell-serie kaart met 100 µ L van bereid PCR reactie mix volgens de instructies van de fabrikant en centrifugeren 2x voor 1 min bij 3.000 x g. De versnelling tijdens de twee opeenvolgende centrifugeren stappen is belangrijk voor het goed vullen van de kaart. Sluit de kaart af volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Gebruik een PCR systeem met het volgende programma: de activering van het enzym bij 95 °C voor 10 min en dan, herhaalde 40x: het denatureren bij 95 °C voor 15 s en het ontharden/uitbreidt bij 60 °C voor 1 min.
    4. Importeer het resultaten bestand van het PCR-systeem en bereken de waarden van OV met behulp van het software pakket van het systeem met de volgende analyse-instellingen: een maximaal toegestane cq waarde van 40,0, maximum cq waarden in berekeningen inbegrepen, en uitlopers onder uitgesloten replicaties. Activeer de benjamini-Höchberg False Discovery rate als optie voor p-waarde aanpassing (correctie van het optreden van false positives14) en Global normalisatie als normalisatie methode (met behulp van een mediaan drempelwaarde voor alle monsters 15).

Resultaten

Een algemeen schema van lipoprotein deeltjes isolatie
Figuur 1 toont de algemene regeling van lipoprotein deeltjes isolatie beginnend van geheel bloed, gebruikend opeenvolgende oprichtings ultracentrifugation16. Indien gewenst kunnen andere lipoprotein deeltjes fracties zoals VLDL en IDL deeltjes worden geoogst tijdens dit protocol. De vaste-hoek Titanium rotor in combinatie met polypropyleen Quick-Seal buizen is geschikt om de centrifuge krachten te weerstaan. Om buis instorting te vermijden, is het belangrijk om luchtbellen in de buis te vermijden. De centrifugeren worden uitgevoerd bij 4 °C om eiwit degradatie te minimaliseren. Gewoonlijk beginnend van plasma (60-80 mL per donor) van gebundelde bloed schenkingen van drie vrijwilligers, kan een opbrengst van LDL en HDL deeltjes oplossings volumes van 3 mL elk met concentraties in de waaier van 1-3 mg/mL worden verwacht. De gehele procedure, die van bloedschenking begint, nam rond 7 dagen.

figure-results-1
Figuur 1: Stroomdiagram van lipoprotein isolatie. Centrifugeer bloed van gezonde vrijwilligers in vacuüm container buizen en verzamel plasma (hogere fase). Na de aanpassing van zijn dichtheid aan ρ = 1,019 g/ml gebruikend KBR, centrifugeer de oplossing bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c. Na de aanpassing van de dichtheid van de onderste Fractie aan ρ = 1,063 g/ml met behulp van KBR, centrifugeer de oplossing opnieuw bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c. Bewaar de bovenste fractie met LDL-deeltjes tijdelijk bij 4 °C. Na de aanpassing van de dichtheid van de onderste Fractie aan ρ = 1,220 g/ml met behulp van KBR, centrifugeer de oplossing tweemaal bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c. Verzamel de bovenste fractie met HDL-deeltjes, dialyze zowel de HDL-en LDL-deeltjes oplossingen en de uitwisseling van de buffer na 1, 2 en 4 h. Bepaal na 24 uur de eiwitconcentratie en bewaar de monsters onder inert gas bij 4 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Reconstitutie van HDL-deeltjes
De reconstitutie van HDL-deeltjes werd uitgevoerd volgens een protocol dat eerder werd gepubliceerd door Jonas7. De eerste stap was de delipidatie van HDL-deeltjes zoals weergegeven in Figuur 2a, gevolgd door de tweede stap van de relipidatie (dwz reconstitutie) zoals weergegeven in Figuur 2b, met behulp van lipid PC, Co, en C in aanvulling op een mengsel van Mirna en spermidinespermine. We kozen voor menselijke volwassen miR-223 en miR-155 omdat miR-223 toont een hoge overvloed en miR-155 is zeldzaam in lipoprotein deeltjes17. Meestal worden beide stappen uitgevoerd op twee opeenvolgende dagen. Tijdens de reconstitutie kunnen andere lipophilic en/of amphiphilic componenten desgewenst worden toegevoegd. De volledige verdamping van ethanol/diethyl ether en methanol/chloroform oplosmiddel van PC, CO, en C was kritisch. De laatste stap — zoals weergegeven in figuur 2c— was de dialyse procedure om opnieuw samengestelde HDL-deeltjes (rHDL) te scheiden van vrije lipiden/Mirna/detergent. Dit duurde een extra 1-2 dagen. De toevoeging van absorberende parels aan de dialyseoplossing hield de dichtheidsgradiënt langs de constante van de dialyse membraan. Een opbrengst van 50% van rHDL deeltjes kan worden verwacht.

figure-results-2
Figuur 2: Stroomdiagram van HDL-deeltjes reconstitutie. (A) delipidatie: Meng de HDL-deeltjes oplossing met voorgekoelde ethanol/diethyl ether en Incubeer bij-20 °c voor 2 uur. Na het weggegooid van de bovendrijvende, de pellet opnieuw op te schorten en herhaal de procedure. Droog de pellet met N2 gas en opnieuw op te schorten in buffer A. Na de bepaling van de concentratie, bewaar de delipidated HDL onder inert gas atmosfeer bij 4 °C. (B) reconstitutie: na het mengen van phosphatidyl-choline (PC), cholesteryl OLEAAT (CO), en cholesterol (C), verdampen het oplosmiddel met behulp van N2 gas tijdens het roteren van de buis. Incubeer de miRNA-hoeveelheid met spermidinespermine oplossing voor 30 minuten bij 30 °C, voeg natrium deoxycholate toe en hersuspendeer de gedroogde lipiden film. Roer de steekproef voor 2 h bij 4 ° c, voeg de delipidated HDL-oplossing, en roer het monster weer, dit keer 's nachts bij 4 ° c onder inert gas atmosfeer. (C) dialyse: Breng de oplossing van paneel B met hervormde HDL (rHDL) deeltjes naar een dialyse membraankamer (molecuulgewicht cut-off: 20 kDa) en dialyze tegen PBS en absorberende kralen bij 4 ° c. Wissel de buffer en de kralen na 1 h en 2 h. herstel de rHDL deeltjes oplossing na 24 uur, bepaal de concentratie en bewaar het monster onder inerte gas-atmosfeer bij 4 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Etikettering van LDL-deeltjes
De etikettering van LDL-deeltjes met miRNA (Figuur 3) zoals aangetoond voor HDL-deeltjes was niet haalbaar als gevolg van de hydrophobicity van de apoB-100-eiwit, dat is het belangrijkste bestanddeel van het LDL-deeltjes. DMSO werd gebruikt voor de penetratie van de lipide monolayer van het LDL-deeltje en bemiddelde daarmee de miRNA-vereniging. De gehele procedure nam 1-2 dagen met een opbrengst dicht bij 100%.

figure-results-3
Figuur 3: Stroomdiagram van LDL-deeltjes labeling. Incubeer de miRNA hoeveelheid met spermidinespermine oplossing voor 30 minuten bij 30 °C en voeg DMSO en LDL buffer toe. Incubeer LDL sample wit LDL-buffer voor 10 min op ijs en voeg miRNA/spermidinespermine/DMSO mengsel. Breng na incubatie bij 40 °C voor 2 h de oplossing over in een dialyse membraankamer (molecuulgewicht cut-off: 20 kDa) en dialyze tegen PBS en absorberende kralen bij + 4 °C. Exchange buffer en kralen na 1 & 2 h. Recover gelabeld LDL-deeltjes oplossing na 24 uur, bepalen de concentratie en de opslag onder inert gas atmosfeer bij + 4 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Kwaliteitscontrole van lipoprotein deeltjes
HS-AFM kan worden gebruikt om de grootte en de vorm van inheemse en hervormde/gelabelde lipoprotein deeltjes op mica te onderzoeken. Net voor gebruik, mica moet vers worden gekloofd (gebruik plakband om de bovenste laag te verwijderen [s]) om een schone en vlakke ondergrond te bieden. Bij het uitbroeden van HDL/LDL deeltjes op mica, moet de verdunningsfactor (en/of de incubatietijd) worden aangepast om individuele deeltjes te observeren. Clusters staan geen bepaling van deeltjesafmetingen toe. HDL-deeltjes zijn mobiel op mica. Bij het gebruik van conventionele AFM in plaats van HS-AFM, moet het immobilisatie protocol dienovereenkomstig worden aangepast (buffer, Surface coating) om de zijdelingse deeltjes mobiliteit te verminderen. Tijdens het scannen van het monster moet de Imaging kracht laag gehouden worden (tikken modus) om elke vervorming van de deeltjes te vermijden, wat de gemeten waarden bijgevolg zal beïnvloeden. Voor de analyse van gegevens werden deeltjes gedetecteerd via een drempel algoritme (bijv. in gwyddion: korrels > teken door drempel) en hun hoogte werd bepaald met betrekking tot het mica oppervlak. Het meten van de hoogte van de deeltjes is de meest precieze manier om de deeltjesgrootte te bepalen, omdat de zichtbare laterale afmetingen worden verbreed door de punt vorm (Zie voorbeeldige beelden in Figuur 4). De functies van de waarschijnlijkheidsdichtheid (pdf's) van deeltjes hoogten werden berekend voor statistische evaluatie en vergelijking van grootte distributies van de diverse lipoprotein deeltjes. Een vergelijking van de inheemse en miRNA-label LDL-deeltjes zoals weergegeven in Figuur 4 maakt het mogelijk te verifiëren van de belangrijkste gelijkenis tussen gelabeld en niet-gelabelde (dwz, native) lipoprotein deeltjes (label LDL-deeltjes zonder toevoeging van Mirna/ spermidinespermine mengsels worden weergegeven als een controle voor de etikettering procedure zelf). De hele procedure duurde ongeveer 1 dag.

figure-results-4
Figuur 4: stroomschema en representatieve resultaten van HS-AFM metingen. Verdun de HDL/LDL deeltjes steekproef in PBS (1:102-1:103) en broed het op vers gekloofd mica voor 5 min, gevolgd door een zorgvuldige spoeling met PBS om vrije (niet elektrostatisch geadsorbeerd) deeltjes te verwijderen. Voer HS-AFM Imaging en controleer de deeltjesdichtheid op het oppervlak. Voer de metingen in PBS bij kamertemperatuur uit. Het hoogste beeld van dit cijfer toont een te hoge deeltjesdichtheid; de onderste afbeelding is geschikt voor analyse. De hoogte van enkele deeltjes werd geanalyseerd na de drempel en inheemse (zwarte curve) en opnieuw samengesteld/geëtiketteerd (rode en groene curve) deeltjes werden vergeleken in een statistische evaluatie. De schaalbalk = 100 nm. Dit cijfer is gewijzigd van Axmann et al.19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

miRNA extractie, omgekeerde transcriptie, en qPCR
De extractie van miRNA uit native/kunstmatig verrijkte lipoprotein of cel monsters werd uitgevoerd met behulp van een miRNA extractie Kit zoals weergegeven in figuur 5a. Hierbij was een ASE-vrije omgeving kritisch. Deze stap duurde ongeveer 1 h. de omgekeerde transcriptie van het geëxtraheerde miRNA-monster (Figuur 5b) werd uitgevoerd volgens de door de fabrikant beschreven standaard biochemische procédés. Deze stap nam ongeveer 1,5 h. Ten slotte werd het bedrag van de cDNA verkregen tijdens de laatste stap werd bepaald met behulp van qPCR (figuur 5c). Een standaardkromme, die de verkregen cq -waarden met het absolute Mirna-strand nummer in verband brengt, leverde het absolute Mirna-gehalte van het aanvankelijke monster op. Dit vergde ongeveer 2,5 h.

figure-results-5
Figuur 5: stroomdiagram van de extractie van Mirna, omgekeerde transcriptie, en qPCR. (A) de extractie van Mirna: Meng het monster met lysis reagens en lyse het via aspiratie met behulp van een spuit. Incubeer voor 5 min en voeg CHCl3. Schud krachtig voor 15 s en incubeer gedurende 3 minuten. Na centrifugeren bij 1.200 x g voor 15 min bij 4 °c, verzamel de hoogste fase en meng het met ethylalcohol. Breng de oplossing over naar een rotatie kolom (maximaal volume < 700 µ L) en centrifugeer deze bij 8.000 x g voor 15 s. Gooi de eluens weg en herhaal de laatste stap met de rest van de oplossing. Voeg de eerste was buffer toe en centrifugeer bij 8.000 x g voor 15 s. Gooi de eluens weg, voeg de tweede was buffer toe en centrifugeer bij 8.000 x g voor 15 s. Herhaal de laatste stap met een centrifugeertijd van 2 min. Droog het membraan verder door centrifugeren bij maximale snelheid voor 1 min. elueer de miRNA met H2O en centrifugeer bij 80.000 x g voor 1 min. Bewaar het geëxtraheerde Mirna-monster bij-20 °c. (B) omgekeerde transcriptie: dooi de 10x buffer, H2O, dNTP mix, remmer, en enzym op ijs en de voorbereiding van de Master Mix. Voeg de geëxtraheerde miRNA van paneel a toe aan de Master Mix en de omgekeerde transcriptie primer en voer de omgekeerde transcriptie uit met een Thermocycler machine. Bewaar het cDNA monster bij-20 °C. (C) QPCR: Ontdooi de Supermix, H2O, en primer op ijs en bereid de Master Mix. Voeg de cDNA van paneel B toe aan de Master Mix en voer qPCR uit. Analyseer de gegevens om de cq waarden te verkrijgen en bereken het absolute Mirna gehalte van het monster (Zie Figuur 6 en de representatieve resultaten voor details). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Absolute miRNA inhoud en transfer rate
Het absolute miRNA-gehalte van inheemse en kunstmatig verrijkte HDL-en LDL-deeltjes werd berekend op basis van de cq -waarden van de monsters en een standaardkromme van de respectievelijke Mirna zoals weergegeven in Figuur 6. Figuur 6a toont gegevens zoals berekend door de analyse software (met geactiveerde DynamicTube normalisatie [voor de compensatie van verschillende achtergrondniveaus gebruikend het tweede derivaat van elk steekproef spoor] en de correctie van de lawaai helling [normalisatie naar het geluidsniveau]). cq waarden van standaard bochten werden bepaald met behulp van de auto-Find drempel functie van het software pakket op de genormaliseerde fluorescentie signaal gemeten door de qPCR machine. Hierbij heeft de software de R-waarde van de pasvorm van de standaard curve gemaximaliseerd. De drempelwaarde werd constant gehouden voor elke specifieke miRNA sample analyse. Vervolgens werden de cq waarden uitgezet als een functie van het aantal Mirna strengen, en werd een regressielijn berekend. Monster cq -waarden werden bepaald met hetzelfde drempelniveau als aangegeven in Figuur 6b; de de efficiency verschillen van de reactie tussen verschillende qPCR looppas werden gecompenseerd automatisch door de software gebruikend één extra kaliberbepalingskromme steekproef inbegrepen in elke looppas. Met behulp van de regressielijn vergelijking, kan het onbekende bedrag van miRNA in het monster worden berekend. Het lipoprotein deeltjesaantal werd geschat van de aanvankelijke eiwitconcentratie en zijn gemiddeld moleculair gewicht (MWHDL ~ 250 kDa). Daardoor werd geen lipide bijdrage aan het molecuulgewicht aangenomen — zo werd het aantal miRNA strengen per lipoprotein deeltje enigszins overschat. Bovendien werd een 100% Recovery rate van miRNA tijdens de miRNA extractie stap aangenomen. Bovendien werd de miRNA-inhoud van de cellen voor en na de incubatie met HDL-deeltjes bepaald en werd de miRNA transfer rate berekend zoals weergegeven in figuur 6C.

figure-results-6
Figuur 6: het stroomdiagram van de berekening van het absolute Mirna-gehalte en de overdrachtsnelheid. (A) standaardkromme voor mir-155: een mir-155 hoeveelheid (100 µ l, 10 µ m) werd serieel VERDUND met RNA-vrij water zoals vermeld. qPCR leverde cq waarden voor elk serieel verdunnings steekproef (gemeten tweemaal) gebruikend de auto-vondst drempel functie van het software pakket. Negatieve controle experimenten (zonder de toevoeging van miRNA) leverden cq waarden van > 35. Gegevenspunten van de waarden van cq als functie van het aantal de bundels van Mirna per steekproef volume (dat van de aanvankelijke concentratie en de periodieke verdunningen wordt berekend) werden gepast met de voorgestelde vergelijking (rode lijn, juist beeld), die M =-3,36 opbrengt en B = 42,12. De bepaalde PCR efficiency was 0,98. De fouten staven werden berekend van de resultaten van experimentele herhalingen en waren kleiner dan de diameter van de cirkel van het gegevenspunt. (B) cq waarden van native/kunstmatig verrijkte HDL-deeltjes werden bepaald met hetzelfde drempelniveau als bepaald in paneel A en omgezet in het aantal Mirna strengen in de qPCR monstervolume. De absolute verhouding van miRNA van de originele steekproef werd berekend van het aantal (concentratie) van HDL deeltjes in het steekproef volume (3,2 x 1011 deeltjes). (C) cel monsters (Cell line LDLA7-SRBI) werden uitgebroed voor 16 uur met kunstmatig verrijkte HDL-deeltjes (50 µ g/ml) en zo ook geanalyseerd. De vastgestelde waarden van cq waren 22,5, 22,5, en 19,3 voor cellen slechts, voor cellen die met inheems HDL worden uitgebroed, of voor cellen die met rHDL deeltjes oplossing worden uitgebroed (allebei 50 µ g/ml), respectievelijk. Deze waarden werden omgezet in het aantal miRNA strengen zoals gedaan in paneel B. Het aantal miRNA strengen na incubatie (7,3 x 106) werden gecorrigeerd door aftrekken van het aantal Mirna strengen voor incubatie (8,6 x 105). Het resultaat werd verdeeld door het aantal cellen in het steekproef volume (3.100), de miRNA-deeltjes-verhouding (1,5 x 10-4), en de periode van de incubatietijd (16 h). Dit leverde de overdrachtsnelheid van lipoprotein deeltjes via miRNA opname (240 HDL deeltjes opname gebeurtenissen per cel en seconde). Dit cijfer is gewijzigd van Axmann et al.19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Multigoed microvloeiende array
Door de geringe opbrengst van de extractie van miRNA werd de omgekeerde transcriptie van de geëxtraheerde miRNA gevolgd door een voorversterker stap. Ten slotte, qPCR, zoals weergegeven in Figuur 6, werd uitgevoerd. Voor alle stappen werden standaard biochemische procedures gebruikt zoals beschreven door de fabrikant. Hier wordt een deel van het Global miRNA profiel op HDL-deeltjes van uremisch patiënten aangeworven voor een studie over de invloed van CRF op cholesterol Efflux van macrofagen18 . In deze studie, de cholesterol acceptatie capaciteit van HDL of serum in-naast anderen-17 jonge volwassen uremisch patiënten (CKD stadia 3-5) en 14 jonge volwassen hemodialysepatiënten zonder geassocieerde ziekten en gematchte controles werd gemeten. Voor het analyseren van de gegevens, werden standaardinstellingen gebruikt (maximaal toegestane CT-waarde: 40,0, met inbegrip van maximale CT-waarden in berekeningen en met uitzondering van uitlopers tussen replicaties). P-de waarden werden aangepast gebruikend benjamini-Höchberg vals ontdekkings tarief (correctie van het voorkomen van valse positieven), en als normalisatie methode, werd de globale normalisatie geselecteerd, die de gemeenschappelijke analyses onder allen vindt monsters om de mediaan te gebruiken CT voor normalisatie. In de representatieve resultaten worden sommige RQs van miRNAs geïsoleerd van HDLs van uremisch patiënten afgebeeld (RQs van controles zijn 1). Uiteraard, miR-122 en miR-224 zijn sterk uitgedrukt in de HDLs van uremisch patiënten. Deze hele stap duurde ongeveer 1 dag.

figure-results-7
Figuur 7: stroomdiagram en representatieve resultaten van de multigoed microvloeiende array. Na de extractie van miRNA zoals weergegeven in figuur 5a, meng de Mirna monster met omgekeerde transcriptie primer en een Master mix met 10x buffer, H2O, dNTP mix, remmer, MgCl2, en enzym. Na incubatie op ijs voor 5 min, voert u de omgekeerde transcriptie met behulp van een Thermocycler machine. Voeg de preversterking Master Mix, incubeer voor 5 min op het ijs, en uitvoeren preversterking met behulp van een Thermocycler machine. Voeg 0,1 x TE (pH 8,0) toe en meng een hoeveelheid met PCR Master Mix en H2O. Pipetteer de PCR-reactie Meng in de vul poort van de multigoed microfluidic array en spin tweemaal bij 3.000 x g voor 1 min elk. Voer qPCR uit met behulp van een PCR-systeem en analyseer de gegevens om de waarden van OV op te geven (hier toont de figuur OV-waarden van HDL-deeltjes van uremie patiënten in vergelijking met een gezonde controlegroep18).  Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Hier wordt stap voor stap beschreven wat de isolatie is van lipoprotein deeltjes van menselijk bloed en de bepaling van hun individuele miRNA-inhoud. Het is cruciaal om te werken in een ASE-vrije omgeving, terwijl de behandeling van geïsoleerde en gesynthetiseerde miRNA-deeltje-embedded miRNA is uiteraard beschut tegen enzymatische degradatie. Aangezien de miRNA/deeltjes verhouding van inheemse lipoprotein deeltjes vrij laag is, is de kunstmatige verrijking met miRNA vereist om de holo deeltjes opname van cellen te bestuderen. Daardoor wordt de reconstitutie van HDL-deeltjes zoals eerder beschreven7 gewijzigd om Mirna strengen op te nemen. Bovendien, de scheiding van de lipide en eiwitfractie tijdens deze procedure kunnen wetenschappers te onderzoeken lipide-en eiwit-geassocieerde componenten van de lipoprotein deeltje19. Op een gelijkaardige manier, wordt de het etiketteren procedure van LDL deeltjes aangepast. Interessant, de toevoeging van spermidinespermine-een natuurlijke stabilisator van nucleotiden-heeft geen invloed op de miRNA/particle ratio. Er zij op gewezen dat in principe de methode toelaat de invouwing van andere stoffen dan miRNA binnen een lipoprotein deeltje. Natuurlijk, is er een grens met betrekking tot de fysieke grootte van de substantie die op de totale grootte van HDL wordt gebaseerd (diameter: 5-12 nm) en LDL deeltjes (diameter: 18-25 nm).

Met betrekking tot de kwaliteitscontrole van hervormde/gelabelde lipoprotein deeltjes, HS-AFM is een van toepassing zijnde methode om HDL/LDL deeltjes te karakteriseren op het enige particle niveau. In vergelijking met EM, het zorgt voor kortere voorbereiding tijden en bijna-fysiologische omstandigheden (natte, kamertemperatuur).

Door zijn inherente gevoeligheid en versterking, qPCR is de methode van de keuze om lage miRNA concentraties op te sporen. Als alternatief is een enkelvoudige molecuul gevoelige fluorescentie microscopie, die in staat is om zelfs individuele moleculen te detecteren, niet geschikt vanwege de lage concentraties van bijvoorbeeld fluorescerende gelabelde miRNA strengen per deeltje. Aldus, is de verhouding van de bundels van miRNA per inheems lipoprotein deeltje gevonden om 10-8te zijn. Kunstmatige verrijking verhoogt de ratio met een factor van 10.000, die de schatting van de cellulaire lipoprotein opnamesnelheid vergemakkelijkt (geen significant verschil wordt gedetecteerd met behulp van native lipoprotein deeltjes 19). De hoge gevoeligheid van qPCR maakt het mogelijk om deze opnamesnelheid te bepalen door het aantal miRNA strengen na de incubatietijd en de miRNA/particle ratio te meten. Opgemerkt moet worden dat de berekende waarde negeert cellulaire degradatie en vrijlating van miRNA en, dus, vertegenwoordigt ten minste een lagere limiet voor de lipoprotein deeltjes opname ratio.

In de toekomst kan de methode worden aangepast aan de overdracht van farmaceutische stoffen (met name ook lipophilic Ones) in cellen en correleren hun biologische effect op de intracellulaire concentratie (bepaald via de opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes).

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds project P29110-B21, het "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" project H-3065/2011, het Europeesfonds voor regionale ontwikkeling (EFRE, IWB2020), de federale staat van Upper Oostenrijk, en de "land OÖ Basisfinanzierung".

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
UltracentrifugeBeckmanOptima L-100 XPLipoproteïne isolatie
Ultracentrifuge rotorBeckmanTI 55.2Lipoproteïne isolatie
Vacutainer (EDTA)Becton Dickinson366643Lipoproteïne isolatie
KaliumbromideSigma Aldrich2110Lipoproteïne isolatie
UltracentrifugebuizenBeckman342414Lipoproteïne isolatie
Ultracentrifugebuis sealerBeckman342428Lipoproteïne isolatie
NatriumchlorideCarl Roth GmbHP029.2Lipoproteïne isolatie
EDTAFisher ScientificD/0650/50Lipoproteïne isolatie
Dialysebuizen, MWCO 12 - 14kSpectra132700Lipoproteïne isolatie
synthetisch miRNAmicroSynth-synthetisch miRNA
TRIS buffer pH 7AmbionAM9850Gsynthetisch miRNA
TRIS buffer pH 8AmbionAM9855Gsynthetisch miRNA
steriele buizenCarl Roth GmbHENE8.1synthetisch miRNA
FotometerEppendorfEppendorf BiophotometerBradford assay
CuvetCarl Roth GmbHXK20Bradford assay
Coomassie G-250 StainBioRad GmbH161-0786Bradford assay
NatriumchlorideCarl Roth GmbH3957.1Delipitation
EDTAFluka Analytical03690-100MLDelipitation
TRIS buffer pH 8.0AmbionAM9855GDelipitation
Ethanol 100%AustrAlcoEthanol Absolut 99.9%Delipitation
Diethyl etherCarl Roth GmbH3942.1Delipitation
CentrifugeThermo ScientificMultifuge X3RDelipitation
ChloroformCarl Roth GmbH3313.1Reconstitution
MethanolCarl Roth GmbH4627.1Reconstitution
FosfatidylcholineSigma Aldrich GmbHP3556-25mgReconstitution
Cholesterol oleateSigma Aldrich GmbHC-9253-250mgReconstitution
CholesterolSigma Aldrich GmbHC8667-500mgReconstitution
glasbuizenCarl Roth GmbHK226.1Reconstitution
SpermineSigma Aldrich GmbHS3256-1GReconstitution
ThermomixerEppendorfThermomixer comfortReconstitution
Natrium deoxycholateSigma Aldrich GmbH3097-25GReconstitution
Magnetische roerbarCarl Roth GmbH0955.2Reconstitution
100µL micropipettesCarl Roth GmbHA762.1Reconstitution
PBSCarl Roth GmbH9143.2Dialyse
Amberlite XAD-2 korrelsSigma Aldrich GmbH10357Dialyse
Slide-A-Lyzer cassette (cut-off 20 kDa)Thermo Scientific66003Dialyse
SpuitBraun9161406VDialyse
SpuitnaaldBraun465 76 83Dialyse
EGTACarl Roth GmbH3054.2Labeling of LDL particles
DMSOlife technologiesD12345Labeling of LDL particles
Atomic Force MicroscopeRIBMSS-NEXQuality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade)Christine GröplG250-1/V1Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM CantileverNanoworldUSC-F1.2-k0.15Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49Czech Metrology Institutehttp://gwyddion.netQuality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-TekVWR734-2122Cell culture
HBSSCarl Roth GmbH9117.1Cell culture
CeltellerOmni Life Science GmbHCasyCell culture
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004miRNA extraction
CentrifugeEppendorf5415RmiRNA extraction
20G naaldBraunSterican 465 75 19miRNA extraction
5ml spuitBecton Dickinson309050miRNA extraction
PCR cabinetEscoPCR-3A1Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription KitThermo Scientific4366596Reverse Transcription
Rnase-vrije waterCarl Roth GmbHT143Reverse Transcription
0.2 ml buizenBrand781305Reverse Transcription
CentrifugeCarl Roth GmbHMicrocentrifuge ALReverse Transcription
ThermocyclerSensoquestLabcyclerReverse Transcription
TaqMan PrimerThermo Scientific-qPCR
iTaq Universal probe supermixBioRad GmbH1725131qPCR
PCR machineCorbettRotor-Gene RG-6000qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4366596TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems4399966TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems4391128TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems4399933TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNGApplied Biosystems4440040TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A CardsApplied BiosystemsA31805TaqMan Array
Nuclease-vrij waterThermo ScientificR0581TaqMan Array
MgCl2 (25mM)Thermo ScientificR0971TaqMan Array
TE, pH 8.0InvitrogenAM9849TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4

Referenties

  1. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).
  2. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, (2014).
  3. Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).
  4. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  5. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs. Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).
  6. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight? Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  7. Jonas, A. Reconstitution of High-Density Lipoproteins. Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).
  8. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  9. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  10. Patsch, J. R., Patsch, W. Zonal ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  12. Yamamoto, D., et al. High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes. Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).
  13. Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).
  14. Hochberg, B. Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).
  15. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biology. 10 (6), (2009).
  16. Schumaker, V. N., Puppione, D. L. 6] Sequential Flotation Ultracentrifugation. Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).
  17. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).
  18. Meier, S. M., et al. Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux. Life Sciences. 136, 1-6 (2015).
  19. Axmann, M., et al. Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients. Genes. 9 (11), 533(2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

MicroRNA verrijkingHDL partikelmarkeringLDL partikelmarkeringdelipidatie relipidatiehigh speed AFMBradford proteinassaydialyseproceduresynthetisch microRNApartikelopnamesnelheid
Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.