Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Summary

SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.

Abstract

Hier presenteren we een nieuwe methode om de sumoylation van eiwitten en hun sub-cellulaire lokalisatie in zoogdiercellen en nematoden oöcyten te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van een recombinant gemodificeerde SUMO-trappen eiwit fragment, kmUTAG, afgeleid van de Ulp1 SUMO protease van de stress-tolerante ontluikende gist Kluyveromyces marxianus. Wij hebben de eigenschappen van de kmUTAG voor het bestuderen van sumoylation in een verscheidenheid van modelsystemen zonder het gebruik van antilichamen aangepast. Voor de studie van SUMO, heeft KmUTAG verscheidene voordelen wanneer vergeleken bij antilichaam-gebaseerde benaderingen. Deze stress-tolerante SUMO-trapping reagens is recombinant geproduceerd, erkent native SUMO isovormen van vele soorten, en in tegenstelling tot commercieel beschikbare antilichamen het toont verminderde affiniteit voor vrije, ongeconjugeerde SUMO. Representatieve resultaten hier zijn de lokalisatie van SUMO geconjugeerde in zoogdier weefselkweek cellen en nematoden oöcyten.

Introduction

Het doel van deze methode is het vergemakkelijken van de studie en analyse van SUMO-geconjugeerde eiwitten met behulp van de recombinante SUMO-trapping UTAG (ULP domein tag) eiwit. Zoals hieronder beschreven, UTAG kan worden gebruikt in plaats van andere reagentia en benaderingen te zuiveren, op te sporen en te visualiseren SUMO-gemodificeerde eiwitten. Afhankelijk van de groeiomstandigheden, cellen kunnen bevatten honderden of duizenden eiwitten die zijn gewijzigd met SUMO of SUMO ketens (voor de herziening Zie Kerscher et al. 2006¹ en Kerscher 2016²). Dit is een aanzienlijke moeilijkheid voor de functionele analyses van specifieke SUMO-gemodificeerde eiwitten, vooral omdat slechts een fractie van een bepaalde sumoylation doelstelling is eigenlijk gewijzigd³. Naast hun rol in essentiële cellulaire processen zoals transcriptie regelgeving, eiwit homeostase, de reactie op cellulaire spanning, en Chromatin het remodelleren tijdens mitose en meiose; het is nu voldoende duidelijk geworden dat Sumo, Sumo-gemodificeerde eiwitten, en Sumo pathway componenten hebben ook potentieel als biomarkers voor pathologieën zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen^{4,5,6 ,7}. Dit onderstreept de noodzaak van robuuste, betrouwbare en gemakkelijk beschikbare instrumenten en innovatieve benaderingen voor de opsporing en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten in een verscheidenheid van cellen en monsters.

In veel systemen, Sumo-specifieke antilichamen zijn de reagentia van de keuze voor de detectie, isolatie en functionele analyses van Sumo-gemodificeerde eiwitten^8,9. Echter, sommige commercieel verkrijgbare SUMO-specifieke antilichamen zijn duur, beperkt in hoeveelheid of beschikbaarheid, vatbaar voor vertonen wild variabele affiniteiten en cross-reactiviteit, en in sommige gevallen gebrek aan reproduceerbaarheid¹⁰. Een alternatieve benadering is de uitdrukking van epitope-Tagged SUMO in getransformeerde cellen en organismen, maar het koppelen van epitope Tags aan SUMO kan kunstmatig lager zijn vervoeging aan eiwitten doelstellingen¹¹. Bovendien, Epitopes zijn niet nuttig wanneer niet-getransformeerde cellen of weefsels worden geëvalueerd.

Ulp1 is een behouden SUMO protease uit S. cerevisiae dat beide processen de Sumo voorloper en desumoylates Sumo-geconjugeerde eiwitten¹². We ontwikkelden de UTAG reagens gebaseerd op de toevallige observatie dat een mutatie van de katalytische cysteïne (C580S) in Ulp1's SUMO verwerking ULP domain (UD) niet alleen voorkomt Sumo splitsing, maar ook vallen Sumo-geconjugeerde eiwitten met hoge avidity¹². Voor de eenvoud, verwees we naar deze Carboxy-Terminal SUMO-trapping Ulp1 (C580S) fragment als UTAG (kort voor UD TAG). UTAG is een recombinant pan-SUMO het vangen proteïne die een nuttig alternatief voor anti-SUMO antilichamen vertegenwoordigt die voor de isolatie en de opsporing van SUMO-gewijzigde proteïnen worden gebruikt. Belangrijker, het erkent specifiek native-gevouwen, geconjugeerde SUMO en niet alleen een of meerdere epitopes op SUMO. Ter verbetering van zowel de eiwit stabiliteit en SUMO bindende kracht van UTAG, genereerden we een variant van UTAG uit de stress-tolerante gist Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG stevig bindt SUMO-geconjugeerden met nanomolar affiniteit¹³. Bovendien, kmUTAG is bestand tegen verhoogde temperaturen (42 °C), verminderende agenten (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride), denatureringsmiddelen (tot 2 M ureum), oxyderende agenten (0,6% waterstofperoxyde), en niet-ionische detergentia. Deze stress tolerantie is gunstig tijdens de harde zuivering en langdurige incubatietijden, zorgen voor de stabiliteit en SUMO-trapping activiteit. Niet verrassend, echter, KmUTAG SUMO-trapping activiteit is onverenigbaar met cysteïne-wijzigen reagentia, Ionische detergenten en volledig gedenatureerde eiwitextracten. De opmerkelijke affiniteit en eigenschappen van KmUTAG geven aan dat dit reagens onderdeel kan worden van het standaard repertoire voor de studie van sumoylated eiwitten in meerdere soorten.

Hier bieden we een eenvoudige methode om SUMO-gemodificeerde eiwitten te detecteren in zoogdiercellen en nematoden met behulp van een recombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion-eiwit (kmUTAG-FL).

Protocol

1. de opsporing van SUMO in de cellen van de vaste weefselcultuur gebruikend recombinant KmUTAG-FL SUMO-vangt proteïne

1. Kweek weefselkweek cellen van keuze op 22 mm ronde deksel glijdt in 6-goed TC platen tot 70%-80% Confluent. Voer stap 1,2 – 1.8 uit in de 6-well plaat.
2. Was de cellen kort met 1 mL DPBS (Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing)
3. Voor fixatie, bereid een nieuwe oplossing van 4% Paraformaldehyde (oplossing) (verdund in DPBS). Om cellen vast te stellen, voegt u 2 mL 4%-DPBS toe aan elk goed. Incubeer de cellen voor 20 min bij kamertemperatuur. Opmerking: alle stappen met behulp van het gebruik van de werkplaats moeten worden uitgevoerd in een laboratorium veiligheids kap en het moet worden verwijderd.
4. Was de vaste cellen 3x in 1 mL DPBS terwijl nutating de plaat, 5 min elke wasbeurt.
5. Aan permeabilize cellen, incubeer voor 15 min met 0,1% Triton X-100 in DPBS
6. Was de cellen 3x in 1 mL DPBS terwijl nutating de plaat, 5 min elke was
7. Incubeer de cellen met 500 µ L van 0,1 M glycine-HCL (pH 2,0) voor 10 s, dan neutraliseren pH onmiddellijk met 500 µ L van 10x SUMO protease buffer (SPB).
8. Was de cellen 3x in 1 mL DPBS, terwijl nutating plaat, 5 min elke wasbeurt
9. Verwijder de-dekglaasjes uit de put en plaats ze in een luchtvochtigheid kamer. Ga dan verder met incubaties op de dekglaasje als volgt:
   1. Voor UTAG-FL kleuring alleen: Meng 1 µ g UTAG-FL met 100 µ L van 1x SPB met 5 mM TCEP in een buis, Pipet de mix op de cellen op de dekglaasje, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 uur in de luchtvochtigheid kamer.
   2. Naar keuze, voor UTAG-FL en anti SUMO1 antilichaam mede-bevlekt, ga met het volgende te werk:
      1. Meng in een tube 1 µ g UTAG-FL en 0,5 µ L SUMO2/3 8A2 (verkregen voor ontwikkelings studies hybridoma Bank⁹) met 100 µ l van blokkering buffer, Pipet de mix op de dekglaasje, en incubeer in kamertemperatuur voor 1 uur.
      2. Was de cellen op de dekglaasje 3 keer met 200 µ L DPBS, 5 min elke wasbeurt.
      3. Meng in een buis 0,5 µ L anti-muis Alexa Fluor 488 geconjugeerd antilichaam met 100 µ L blokkering buffer, Pipet de mix op de dekglaasje, en incubeer in kamertemperatuur voor 1 uur.
10. Te wassen-dekglaasjes, pipet 200 µ L DPBS op elke dekglaasje en laat op zijn plaats voor 10 min. Herhaal de was nog 2 keer.
11. Verwijder dekglaasje uit de laatste wasbeurt en omkeren op een vooraf gereinigde microscopie dia met een druppel montage medium (Zie de tabel van materialen).
12. Store 's nachts in een-20 °C vriezer voor het bekijken onder de Microscoop. Visualiseer gebruikend de aangewezen filter reeksen voor DAPI (DNA), Texas rood (kmUTAG-FL), en Alexa Fluor 488 (als facultatieve SUMO2/3 het co-bevlekt wordt uitgevoerd).

2. SUMO detectie in vaste nematoden gonaden met UTAG-FL

1. Transfer Adult hermafrodieten naar een 8 µ L druppel ei buffer¹⁴ op een plus-charged dia die is bekleed met poly-l-lysine. Release gonaden van de wormen met behulp van 27,5 G naalden. Ga verder met een antilichaam etikettering of UTAG-FL etikettering.
2. Voor de etikettering van antilichamen gaat u als volgt te werk:
   1. Freeze-crack monsters in vloeibare stikstof en vervolgens vast 's nachts in-20 °C methanol in een Coplin pot.
   2. Ook in Coplin potten, dia's wassen voor 3 keer in 1x PBS, dan blok voor 20 min in PBS met 0,5% BSA en 0,1% Tween 20.
   3. Voeg 30 µ L van anti-SUMO 6F2 antilichaam (1:10) aan elke dia toe die de specimens behandelt. Incubeer overnachting in een vochtigheids kamer bij 4 °C.
      Opmerking: SUMO 6F2 werd verkregen uit de ontwikkelings studies hybridoma Bank¹⁵.
   4. In Coplin potten, was dia's voor 2 min in 1x PBS, dan dekking en incubeer specimens met 30 µ L van DyLight 488 geit-antimuis secundair antilichaam (1:200) voor 1,5 uren in een vochtigheids kamer bij kamertemperatuur.
   5. In Coplin potten, was dia's voor 2 min in 1x PBS, het uitvoeren van een snelle dip in dH₂0, en dan monteren de dia's met montage medium (Zie tabel van materialen).
3. Voor KmUTAG-FL-etikettering gaat u als volgt te werk:
   1. Om cellen te bevestigen, voeg 1 volume van 8% PF aan steekproeven voor een definitieve concentratie van 4% PF toe. Bevestig voor 10 min in een luchtvochtigheid kamer en vervolgens de reactie doven door de overdracht van dia's naar een Coplin jar met 1x PBS met 0,1 M glycine voor ten minste 5 min.
   2. In Coplin potten, cellen wassen voor 5 min in 1x PBS, dan permeabilize de monsters in 1x PBS met 0,1% Triton-X voor 10 min.
   3. Was in een Coplin pot voor ten minste 5 minuten in 1x PBS, voeg dan 200 µ L van 0,1 M glycine-HCl (pH = 2,0) om de monsters op de dia gedurende 10 seconden. Voeg onmiddellijk 200 µ L van 10x SPB toe om pH te neutraliseren.
   4. Was de dia in 1x PBS in een Coplin pot voor 5 min.
   5. Verwijder dia van was en Pipet 100 µ L van 1x SPB + 5mM TCEP bevattend 2 µ g van UTAG-FL aan de nematoden op de dia's, en incubeer in vochtigheids kamer voor 1 h zonder het schommelen.
   6. Return de dia aan de Coplin kruik en was 15 min in 1x PBS
   7. Verwijder de dia uit het wassen, gebruik een laboratorium veeg om te drogen rond het monster, en monteer de dia's met 5 µ L van de montage medium (Zie de lijst van materialen). Sla de dia's op bij 4 °C. Visualiseer met behulp van de juiste filter sets voor DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL), en DyLight 488 (SUMO2/3).

Results

KmUTAG-FL is een recombinant, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteïne. Om kmUTAG-FL te produceren, klonten wij een codon-geoptimaliseerde mCherry-kmUTAG in de pSPOT1 bacteriële overexpressie plasmide (Figuur 1). Na de inductie werd de kmUTAG-FL proteïne gezuiverd op Spot-TRAP, geëlueerd, en bevroren tot verder gebruik. Om de SUMO-vangstactiviteit van KmUTAG-FL te verzekeren, bevestigden wij het binden aan SUMO1-geconjugeerde parels en precipitatie van een SUMO-...

Discussion

Hier introduceren we het gebruik van kmUTAG-FL, een recombinant eiwit, voor functionele studies van SUMO in vaste zoogdiercellen en ontleed nematoden gonaden. KmUTAG-FL is een stress-tolerante pan-SUMO specifieke reagens dat herkent en vangt native SUMO-geconjugeerde eiwitten en SUMO ketens. Aangezien SUMO de tertiaire structuur is zeer behouden is het zeer waarschijnlijk dat SUMO varianten van extra model en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met de kmUTAG-FL reagens. Als dusdanig, kan KmUTAG-FL een nuttig al...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) waterige oplossing	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Gebruikt als secundaire antilichaam voor muis monoklonaal antilichaam
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 geconjugeerd AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Gebruikt als secundaire antilichaam voor muis monoklonaal antilichaam
Fisherbrand Dekglas voor Groei Dekglazen	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II met DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Bevestigingsmedium in stap 1.11
FLUORO-GEL met DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	Met DAPI toegevoegd aan 1 µg/mL; bevestigingsmedium in stap 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG reagentia zijn verkrijgbaar op Kerafast.com
Oneblock Western-CL blokkeringsbuffer	Prometheus	20-313
PBS, fosfaatgebufferde zoutoplossing, 10X-oplossing	Fisher BioReagents	BP3994
PNT2-cellijn	Sigma-Aldrich	95012613	Normaal prostaatepitheel geïmmortaliseerd met SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 werd gedeponeerd bij de DSHB door Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO-proteas buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2-antilichaam 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2 werd gedeponeerd bij de DSHB door Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Gebruikt als reducerend middel in een concentratie van 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Gebruikt voor permeabilisatie op 0,1% in DPBS/PBS (voor wormen)