Een roman en translationeel rat model van hersenschudding combineren van kracht en rotatie met in vivo cerebrale Microdialyse

Samenvatting

Neurotransmitter wijziging is een mechanisme van neurale disfunctie die optreedt na hersenschudding en draagt bij aan de soms catastrofale gevolgen op lange termijn. Dit rat model combineert microdialyse, waardoor in vivo neurotransmitter kwantificering, met een gewicht-druppel techniek die snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp, een belangrijke factor van menselijke craniocerebrale trauma.

Samenvatting

Aanhoudende cognitieve en motorische symptomen zijn bekende gevolgen van hersenschudding/mild traumatisch hersenletsel (mTBIs) dat deels kan worden toegeschreven aan veranderde transmissie. Inderdaad, cerebrale microdialyse studies bij knaagdieren hebben aangetoond een buitensporige extracellulaire glutamaat vrijlating in de Hippocampus binnen de eerste 10 min na trauma. Microdialyse biedt het duidelijke voordeel van in vivo neurotransmitter continue bemonstering terwijl het niet hoeft te offeren van het dier. Naast de bovengenoemde techniek, is een gesloten hoofdletsel model dat een snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp uitoefent nodig, aangezien een dergelijke factor niet beschikbaar is in vele andere diermodellen. De Wayne State gewicht-druppel model bootst deze essentiële component van menselijke craniocerebrale trauma, waardoor de inductie van een effect op het hoofd van een ongefixde knaagdier met een dalende gewicht. Onze roman en translationeel rat model combineert cerebrale microdialyse met de Wayne State gewicht-druppel model om te studeren, in licht verdoemde en ongebreidelde volwassen ratten, de acute veranderingen in extracellulaire neurotransmitter niveaus na hersenschudding. In dit protocol, de microdialyse sonde werd ingebracht in de hippocampus als regio van belang, en werd achtergelaten ingebracht in de hersenen bij botsing. Er is een hoge dichtheid van terminals en receptoren in de hippocampus, waardoor het een relevante regio voor het documenteren van veranderde neurotransmissie na hersenschudding. Wanneer toegepast op volwassen Sprague-Dawley ratten, onze gecombineerde model geïnduceerde verhogingen in de hippocampal extracellulaire glutamaat concentraties binnen de eerste 10 min, consistent met de eerder gemelde post-hersenschudding symptomologie. Dit gecombineerde gewicht-druppel model biedt een betrouwbare tool voor onderzoekers om vroege therapeutische reacties op hersenschuddingen te bestuderen naast repetitief hersenletsel, omdat dit protocol een gesloten hoofd mild trauma induceert.

Inleiding

Het doel van deze methode is om onderzoekers te voorzien van een betrouwbaar instrument dat de biomechanica van humaan craniocerebrale trauma getrouw reproduceert, terwijl het toestaan van longitudinale karakterisatie van de moleculaire effecten van hersenschuddingen/mild traumatisch hersen letsel (mTBIs). Deze methode combineert cerebrale microdialyse met het Wayne State gewicht-druppel model om te documenteren, in licht verdoemde en ongebreidelde volwassen ratten, de acute veranderingen in extracellulaire neurotransmitter niveaus na hersenschudding. Met deze minimaal invasieve methode kunnen neurotransmitters zoals glutamaat, GABA, taurine, glycine en serine snel en continu worden gekwantificeerd na trauma, in vivo, terwijl ze het dier niet hoeven op te offeren.

Hersenschudding/mTBI is een pathofysiologische verstoring die het functioneren van de hersenen beïnvloedt, veroorzaakt door een extern kracht mechanisme. Hersenschudding/mTBI is de meest voorkomende vorm van traumatisch hersenletsel, boekhoudkundig voor 70-90% van de gevallen¹. De meeste van de acute functionele verstoringen na een hersenschudding kunnen worden toegeschreven aan een primaire en een secundair hersenletsel^2,3: (1) het primaire hersenletsel wordt veroorzaakt door de snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp die schade aan hersenweefsel door compressie, gevolgd door de stretching en afschuiving van axonen tijdens de Backlash^4,5,6 en (2) de secundaire hersenletsel is de indirecte cellulaire reactie op het trauma. Het vindt plaats uren en dagen na de primaire hersenletsel en speelt een belangrijke rol in de motor en cognitieve stoornissen waargenomen na verloop van tijd. Veel van de symptomen kunnen worden toegeschreven aan veranderde transmissie, zoals de eerder aangetoond buitensporige extracellulaire glutamaat vrijlating in de eerste 10 minuten na blessure^7,8,9. Gezien de hoge dichtheid van terminals en receptoren, de hippocampus is een hersenstructuur bijzonder kwetsbaar voor deze excitotoxisch reactie na letsel. Sterk betrokken zijn bij cognitieve functie^10,11, studies bij knaagdieren gemeld dat hippocampal schade geassocieerd met hersenschudding kan leiden tot waardeverminderingen in angst conditionering en het leren van ruimtelijke geheugen^{12 , 13}. het primaire doel van deze methodologie was het uitwerken van een rat model van hersenschudding/mtbi, met behulp van de Wayne State closed Head gewicht-drop procedure om de mechanismen van het primaire hersenletsel getrouw te reproduceren, en de cerebrale microdialyse om te studeren in vivo, de acute extracellulaire neurotransmitter verandert als gevolg van de secundaire hersenletsel na een hersenschudding. Concentraties van extracellulaire glutamaat en GABA werden gemeten in de Hippocampus om op te treden als representatieve resultaten van onze methode.

Eerdere knaagdieren studies hebben gecombineerd microdialyse en andere modellen van letsel, zoals de daling van de gewicht van de open-schedel en gecontroleerde corticale impact, om de acute veranderingen in de extracellulaire neurotransmitter niveaus te demonstreren na een blessure van variërende Ernst graden^14,15,16,17. Echter, naast de hoge mate van variabiliteit, wordt de translationele waarde van modellen zoals de gewichtsafname met open schedel en het gecontroleerde corticale effect belemmerd door een inherent gebrek aan ecologische geldigheid als gevolg van 2 factoren: (1) deze modellen induceren verwondingen veel ernstiger dan sportgerelateerde hersenschuddingen leed bij de mens, waarbij directe hersen belasting en (2) deze modellen vereisen een craniectomie of een craniotomie, het hoofd van het knaagdier wordt volledig ingetogen in een stereotaxus frame, waardoor de snelle versnelling en vertraging van het hoofd en de romp, dus slecht reproduceren de biomechanica van hersenschudding.

Microdialyse is een minimaal-invasieve methode die het duidelijke voordeel biedt van het bemonsteren van neurotransmitters zoals glutamaat, GABA, taurine, glycine en serine, in vivo en voortdurend na trauma, terwijl het niet hoeft te offeren van het dier. Naast de voordelen die microdialyse biedt, ontwikkelde de Wayne State University een closed-Skull-gewicht-druppel model (in tegenstelling tot de open-schedel van andere modellen), waardoor de inductie van een mTBI op een licht verdoemd en oninge togen knaagdier, waardoor de snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp¹⁸. Zoals eerder vermeld, is de versnelling en vertraging van het hoofd en de romp een belangrijke biomechanische functie van sportgerelateerde hersenschuddingen die bij mensen zijn waargenomen en die eerdere knaagdier mtbi-modellen niet hebben kunnen aanpakken. De gewicht-druppel procedure kan zeer snel worden uitgevoerd en vereist geen voorafgaande operatie of hoofdhuid incisie. Na inductie van de hersenschudding herstellen knaagdieren de rechtse reflex bijna spontaan en ondervinden ze na een enkele botsing geen verlamming, epileptische aanvallen of ademnood. Intracraniële bloedingen en fracturen van de schedel zijn zeldzaam en slechts geringe tekorten in de motorische coördinatie zijn gemeld bij knaagdieren. Dit rat model is gemakkelijk te gebruiken, goedkoop en vergemakkelijkt de kwantificering van neurotransmitters vrijgegeven in de acute fase na een hersenschudding zonder het verwijderen van de microdialyse sonde tijdens de botsing.

Ons rat model dat microdialyse en hersenschudding combineert, is geschikt voor onderzoekers die in de lengterichting de moleculaire effecten van hersenschudding willen karakteriseren en kunnen worden gebruikt in een breed scala aan therapeutische studies. Inderdaad, ondanks enkele jaren van onderzoek en een overweldigende behoefte, geen medicijn om de langetermijneffecten van hersenschuddingen te voorkomen heeft de klinische proeffase¹⁹doorstaan. Een van de mogelijke redenen voor deze mislukkingen zou kunnen zijn het gebruik van diermodellen die niet getrouw reproduceren de traumatische biomechanische krachten van hersenschuddingen zoals ervaren door de mens. De hier gepresenteerde methode voldoet aan de definitie van menselijke hersenschuddingen die aangeeft dat het primaire hersenletsel wordt veroorzaakt door een stompe impact, evenals een snelle acceleratie en vertraging van het hoofd en de romp^2,3.

Bovendien, ons gecombineerde model is geschikt voor onderzoekers bestuderen van de effecten van herhaalde milde traumatisch hersenletsel (rmTBI) Aangezien een van de belangrijkste kenmerken die het onderscheidt van andere dierlijke modellen van hersenschudding is dat het mogelijk maakt om te induceren herhaalde, milde verwondingen in dezelfde zaak¹⁸. Bij de mens, rmtbi wordt geassocieerd met meer ernstige posttraumatische symptomen, langere hersteltijden, en verergerd motorische en cognitieve beperkingen die de neiging om zich te verspreiden in de tijd^20,21. Andere relevante diermodellen hebben het ook mogelijk gemaakt om de posttraumatische pathofysiologie van rmtbi,^{22,23,24,25,26,}27, beter te begrijpen . Verhoogde hersenen kwetsbaarheid is aangetoond bij knaagdieren na een minimum van 5 mTBI op 24 h intervallen. Neuroinflammatie stijgt met het aantal ervaren mTBI en markers van neurodegeneratie verschijnen²⁸. Herhaalde mTBI zou voorkomen dat de overgang van Microglia van een proinflammatoire modus naar een normale modus van herstel, resulterend in langdurige excitotoxisch activiteit en activering van neurodegeneratieve mechanismen ²⁹. Met ons model, ratten kunnen worden blootgesteld aan 1 impact per dag gedurende de periode van 1 week voor een totaal van 5 blootstellingen. Gezien de eenvoud van dit diermodel, kan het de karakterisering van de cumulatieve effecten van de acute willekeurige neurotransmitter die onmiddellijk na een mTBI ontstaan, vergemakkelijken.

Met dit model kunnen dieren ook gemakkelijk worden blootgesteld aan 2 effecten per dag, waardoor het mogelijk is om nog ernstigere omstandigheden te bestuderen, zoals wanneer een atleet een andere traumatische impact krijgt binnen een korte tijd vanaf de eerste klap³⁰. Zoals aangetoond in een eerdere studie³¹, de timing van een tweede klap op het hoofd kan drastisch beïnvloeden vasculaire en axonale schade. Hoe dichter de tweede klap is voor de eerste klap, hoe schadelijker de gevolgen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van hoe deze specifieke aandoening van invloed is op de extracellulaire neurotransmitter release.

In deze methode, de Hippocampus werd gebruikt als regio van belang vanwege de relevantie in hersenschudding onderzoek maar microdialyse monsters kunnen worden verzameld uit andere regio's van belang ook. Echter, elke andere hersenregio moet worden overwogen vanwege de ruimte die overblijft door de inslag plaats van de geleidecanule, inclusief het tand cement eromheen, kan een aanzienlijke hoeveelheid ruimte innemen op het hoofd van de rat. Naast deze, de microdialyse parameters gepresenteerd in deze methode, zoals het membraan van molecuulgewicht cut-off en actieve lengte, de bemonsteringstijd intervallen en de stroomsnelheid kunnen worden aangepast aan het type molecuul bestudeerd. De efficiënte verzameling van pro-inflammatoire cytokines die betrokken zijn bij hersenschuddingen, bijvoorbeeld, zou vereisen een membraan met een veel grotere poriegrootte.

Protocol

Het dieren protocol voor dit project heeft de goedkeuring verkregen van de Dierenzorg Commissie van de Hopital du Sacre-Cœur de Montreal in overeenstemming met de richtsnoeren van de Canadese Raad voor dierverzorging.

Opmerking: een schematische schets van het onderzoeksprotocol wordt weergegeven in Figuur 1.

1. voorbereiding van dieren

1. Bestel Sprague-Dawley ratten van een standaard laboratorium dierlijke leverancier te leveren tussen 43 en 50 dagen oud en met een gewicht tussen 151 en 200 g.
2. Huis alle ratten individueel in een cyclus van 12:12 h licht: duisternis, bij 24-26 ° c met ad libitum toegang tot water en voedsel.
3. Gedurende de 2 weken voor het begin van het Protocol, omgaan met de ratten voor 5 min op een dagelijkse basis om hun gegewijze in contact met onderzoekers te vergemakkelijken. Ratten moeten worden gerijpt ongeveer 10 weken oud en hun gewicht moet tussen 295 en 351 g op het moment van hersenschudding of schijn wond inductie.

2. microdialyse gids implantatie chirurgie van de canule

1. Voer de operatie uit onder steriele omstandigheden. Draagster iele handschoenen, een haar motorkap en een chirurgische masker gedurende de hele procedure. Autoclaaf en steriliseer alle materialen en chirurgische instrumenten vooraf. Reinig en Desinfecteer het werkgebied en het stereotaxsche apparaat grondig met een oplossing van ethanol (70%).
2. Anesthetiseer de dieren door een cocktail van ketamine (70 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) intraperitoneaal te injecteren. Ezels verdoving diepte door het testen van de reflex om een teen knijpen.
3. Verwijder het bont van het hoofd van het dier met behulp van elektrische tondeuses. Reinig geschoren hoofd met een oplossing van 2% isopropylalcohol en 2% chloorhexidine gluconaat (3 keer). Smeer oogzalf aanbrengen tijdens de anesthesie om droogheid te voorkomen.
4. Drape-uit het chirurgische veld zodat alleen het hoofd van het dier wordt blootgesteld. Plaats het hoofd van de rat in een stereotaxus apparaat, steek de gehoor stangen met grote zorg in de gehoor kanalen en draai vervolgens de neusklem vast. Bevestig een 26 G roestvaststalen geleidecanule aan de arm van de houder op het stereotaxsche apparaat.
5. Lokaal injecteren van een verdovings cocktail van de (1,5 mg/kg) en lidocaïne (1,5 mg/kg) subcutaan op het hoofd, 10 min vóór incisie.
6. Onderhoud anesthesie gedurende de hele procedure door het leveren van natrium Isofluraan (2,5%) bij 0,5 L/min zuurstoftoevoer met een neuskegel.
7. Maak een middenlijn incisie (3 cm) langs de hoofdhuid met een scalpel. Laat de schedel helder door het installeren van 4 klemmen rond de incisie.
8. Schrael het periosteum van de schedel met een chirurgisch lemmet, totdat de Bregma en de Lambda-hechtingen zichtbaar zijn. Houd de schedel stevig onder druk met een gaasje of een applicator met een wattenschijfje als er een bloeding is.
9. Bevestig of de schedel correct is uitgelijnd op de stereotaxic apparatuur door het vergelijken van de dorsoventral coördinaten van de Bregma en Lambda hechtingen. Identificeer de anteroposterior, Mediolaterale en dorsoventral coordinaten van de Bregma-hechtdraad als referentiepunten voor de coördinaten van de geleidecanule.
10. Het nemen van de bregma hecht coördinaten als verwijzingen, bereken de coördinaten van de gids canule implantatie site in de hippocampus.
    Opmerking: De volgende coördinaten werden bepaald volgens de rat Brain Atlas van Paxinos en Watson (anteroposterior:-0,60 cm; Mediolaterale: ± 0,58 cm; dorsoventral:-0,16 cm, Fig. 2a)³².
11. Markeer de precieze implantatieplaats met behulp van een marker.
12. Boor een gat van 0,5 mm door de cranium op de doel plaats van de geleidecanule. Boor 3 andere gaten ongeveer 5 mm rond dit punt naar draad 3 anker schroeven in de schedel die de canule stollen nadat acryl tand cement is aangebracht.
13. Plaats de canule in de hippocampus en bevestig deze met tand cement. Deze canule wordt 7 dagen later tijdens de microdialyse procedure gebruikt om de sonde in het gebied van de interesse in te steken. Wees voorzichtig om niet te morsen van overtollig tand cement rond de plaats waar het gewicht zal worden gedaald.
14. Laat het cement 2 min drogen en verwijder vervolgens de draagarm van de canule. Steek een roestvrijstalen afneembare obturator in de canule om cerebrospinale vloeistof te voorkomen en Risico's van infectie.
15. Verwijder de 4 klemmen, trek de teruggetrokken huid terug en naai deze met een chirurgische hechtdraad 4-0.
16. Verwijder de rat van het apparaat en Injecteer buprenorfine subcutaan om pijn te behandelen (0,05 mg/kg, na de operatie en vervolgens eenmaal per dag gedurende de volgende 2 dagen). Plaats de knaagdier terug in zijn kooi met een verwarmingspad tot het zich bewust wordt, en breng het vervolgens terug naar de dierenverzorgings faciliteit voor een herstelperiode van 7 dagen onder nauwlettend toezicht.

3. microdialyse procedure

1. Draag tijdens het uitvoeren van de microdialyse procedure steriele handschoenen, een haar motorkap en een chirurgisch masker. Zeven dagen na de implantatie operatie van de canule, anesthetiseer de rat met natrium Isofluraan (2,5%) bij 0,5 L/min zuurstoftoevoer.
2. Verwijder de obturator uit de canule en plaats langzaam een microdialyse sonde, geperfundeerd met kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (acsf) (26 mmol/l NaHCO₃, 3 mmol/l Nah₂po₄, 1,3 mmol/l MgCl₂, 2,3 mmol/l CACL₂, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L L-ascorbinezuur), via de canule in de Hippocampus of andere regio van belang.
   Opmerking: Ratten moeten alleen worden verdouseerd tijdens het verwijderen van de obturator en het inbrengen van de microdialyse sonde, en tijdens de inductie van hersenschudding of schijn letsel. De sondes die hier worden gebruikt zijn in het laboratorium gebouwd, I-vormig, en bestaat uit gesmolten side-by-side silica inlaat-uitlaat lijnen [inwendige diameter (ID): 50 μm] omhuld in polyethyleen slang (ID: 0.58-0.38 mm). Het uiteinde van de canule is vastgezet met een lengte van geregenereerde holle cellulose membraan [molecuulgewicht cut-off: 13 kDa, buitendiameter (OD): 216 μm; ID: 200 μm] met behulp van Cyanoacrylaat lijm en de tip verzegeld met epoxy. Het actieve membraan meet 2,5 mm voor implantatie in de hippocampus, maar kan worden aangepast aan de diepte van het gebied van belang. De aansluiting van de inwonende canule van de rat op de sonde is beveiligd met een roestvrijstalen halsband met schroefdraad.
3. Bevestig de sonde aan een roestvrijstalen veer die is aangesloten op een vloeibare wartel en een tegenbalans hendel die boven de kooi is opgehangen met een ring standaard en klemmen zodat het dier zich vrij binnen zijn kooi kan bewegen. Tethered ratten besteden de hele duur van de microdialyse procedure met ad libitum toegang tot water en voedsel.
4. Gebruik een micro infuuspomp om perfusaat naar de probes te sturen en haal het dialysaat op uit de gesmolten silica uitlaat lijn (Dead volume: 0,79 μL).
5. Ten minste 1 uur en 30 minuten voordat de procedure begint, draai de sonde omhoog naar het werk debiet (1 μL/min). Controleer of de stroomsnelheid van de sonde consistent is door het volume in de loop van de tijd te meten met een pipet.
   Opmerking: De stroomsnelheid kan meer of minder zijn afhankelijk van de neurotransmitters bemonsterd en de hersenen gebied van belang. Dialyse monsters worden genomen vóór, tijdens, en na hersenschudding of schijn wond inductie. Bemonsterings interval is afhankelijk van het hersengebied van belang, neurotransmitters die worden geanalyseerd, dialysaat concentraties van de analyt en gevoeligheid van de gebruikte analytische chemie apparatuur. De verzamel fases hier gedaan in de Hippocampus voor glutamaat en GABA bemonstering zijn als volgt:
   1. baseline: Verzamel bij aanvang van het experiment dialyse monsters met intervallen van 10 min voor 60 min.
   2. na de hersenschudding of schijn blessure: verzamelmonsters voor een extra 90 min (9 samples) na de hersen schreden of schijn blessure.
6. Verzamel elk dialysaat monster in een fractie flacon met een vooraf geladen hoeveelheid van 1 μL van 0,25 mol/L perchloorzuur om afbraak van analyt te voorkomen. Bewaar de monsters bij 4 °C voor verdere analyse.
7. Na de verzameling van het laatste dialysaat monster, heranesthetiseer de rat met een neuskegel die natrium Isofluraan levert (2,5%) bij 0,5 L/min zuurstoftoevoer.
8. Verwijder de microdialyse sonde uit de canule, plaats de obturator opnieuw en breng de rat vervolgens terug naar de dierenverzorgings faciliteit.

4. installatie van de hersenschudding

1. Vóór aanvang van de procedure, carve een gewicht te worden gebruikt om de hersenschudding (19 mm in diameter) van massief messing te verkrijgen van een massa van 450 g. Steek een metalen lus aan de bovenkant van het messing gewicht. Boorgaten Preliminary op een afstand van 1,0 m in een verticale polyvinylchloride (PVC) geleidings buis.
2. Spleet een aluminium plaat met een scherp scheermesje. De gesleufde aluminium plaat moet het gewicht van de rat (295 tot 351 g) ondersteunen zonder de acceleratie van het lichaam na het hoofd effect van het messing gewicht te verstoren.
3. Plak de gesleufde aluminium plaat strak op een U-vormig plexiglas frame (38 cm lang x 27 cm breed x 30 cm diep, Figuur 3a, B) dat een schuimkussen bevat (37 cm lang x 26 cm breed x 12 cm diep).
4. Positioneer het plexiglas frame onder een PVC geleidebuis (20 mm diameter x 1,5 m lengte).
5. Houd de PVC-geleidings buis op zijn plaats met een klem standaard 3,5 cm boven het gesleufde aluminium.
6. Bevestig een nylon vlieg vislijn (capaciteit van 9,1 kg, 0,46 mm diameter) door de metalen lus, zodat de onderkant van het gewicht hangt 2,5 cm over het gesleufde aluminium om te voorkomen dat meerdere hits wanneer de rat valt op het schuimkussen na botsing.
7. Bevestig de nylon vlieg vislijn aan de klem standaard.
8. Trek het gewicht door de PVC-buis met de nylon vlieg vislijn en houd het op zijn plaats door een hex-sleutel door de voor geboorde gaten op 1,0 m te plaatsen.

5. concussie inductie

1. Na de baseline fase van de dialyse monsters collectie, opnieuw anesthetiseren de rat licht door het plaatsen van een neuskegel leveren natrium Isofluraan (2,5% Isofluraan bij 0,5 L/min zuurstoftoevoer) tot het als geen reactie op een teen knijpen (zoals vermeld in paragraaf 3,1).
2. Plaats het dier op de borst op de gesleufde aluminium plaat zodat het hoofd direct in het pad van het messing gewicht wordt gepositioneerd (figuur 3c, D). Handhaaf anesthesie met de neuskegel om ervoor te zorgen dat de rat niet beweegt of wakker wordt voordat het gewicht het raakt.
3. Verwijder de neuskegel en trek de inbussleutel. Het gewicht zal verticaal door de PVC-buis vallen en het hoofd van de rat beïnvloeden. De rat zal een snelle 180 ° rotatie ondergaan en op zijn rug landen (figuur 3e).
4. Verwijder de rat van het schuimkussen en plaats het op zijn rug in de kooi.
5. Gebruik een digitale timer om de tijd van de rechtse reflex te meten als teken van herstel en letsel ernst. De juiste reflex tijd is de totale tijd van de botsing tot de knaagdieren wakker worden en zich spontaan op de liggende positie van de liggende positie bevinden, of beginnen te lopen. Let op tekenen van overlijden, breuk of bloeding.
   Opmerking: De procedure kan op verschillende tijdstippen op hetzelfde onderwerp worden herhaald voor herhaalde hersenschuddingen.

6. schijn inductie

1. Na de baseline fase van de dialyse monsters collectie, opnieuw anesthetiseren de rat licht door het plaatsen van een neuskegel leveren natrium Isofluraan (2,5%) bij 0,5 L/min zuurstoftoevoer tot het als geen reactie op een teen knijpen (zoals vermeld in paragraaf 3,1).
2. Plaats het dier op de borst op de gesleufde aluminium plaat zodat het hoofd direct in het pad van het koperen gewicht legt. Onderhoud anesthesie met de neuskegel om ervoor te zorgen dat de rat niet beweegt of wakker wordt.
3. Verwijder de neuskegel en verwijder het dier uit de aluminium plaat zonder de hex-toets aan te trekken. De rat zal niet een snelle 180 ° rotatie ondergaan.
4. Plaats de rat op zijn rug in de kooi.
5. Gebruik een digitale timer om de rechtse tijd te meten als indicator voor neurologisch herstel.

7. High-Performance vloeistofchromatografie

1. Bepalen van de neurotransmitter niveaus (dat wil zeggen, glutamaat en GABA) door precolumn derivatisatie met behulp van high-performance vloeibare chromatografie met snelle scheiding fluorescentiedetectie, en een systeem bestaande uit een snelle scheiding autosampler en een pomp gekoppeld een 3,0 x 50 mm 5 μm analytische kolom.
2. Maak een mobiele fase met 100 mmol/L natriumfosfaatdibasisch (na₂HPO₄), 3,5% acetonitril en 20% methanol. Stel de pH in op 6,7 met fosforzuur (85%) indien nodig.
3. Stel de stroomsnelheid in op 0,5 mL/min.
4. Bereid verse dagelijkse bewerking reagentia en werk normen (100 ng/ml) uit stockoplossingen. Laad ze in een gekoelde (10 °C) snelle separatie autosampler met samples.
5. Meng elke fractie opeenvolgend in de analytische kolom met 20 μL 3-mercaptopropionzuur (0,071 mol/L), verdund met H₂O en 20 μL O-ftaldehyde (0,0143 mol/l), verdund met Natriumtetraboraat van 0,1 mol/l. Laat 10 min voor de mix reageren.
6. Om besmetting van volgende monsters te voorkomen, moet u de injectielus met methanol (20%) na elke injectie spoelen.
   Opmerking: De retentietijd glutamaat zou van 1 min ongeveer in dit protocol, voor een totale uitvoeringstijd van 30 min voor elk monster.
7. Identificeer onbekende pieken tijdens de analyse van chromatografische pieken met behulp van monsters die zijn afgestemd op de retentietijd van bekende standaarden. De hoeveelheid analyten als μg/mL.

8. histologie

1. Een maand na de microdialyse procedure en hersenschudding of schijn wond inductie, anesthetiseren de dieren door het injecteren van een cocktail van ketamine (70 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) intraperitoneaal en euthanaseren ze door Paraformaldehyde (4%) en zoutoplossing intracardiale perfusie.
2. Onthooi de knaagdieren dan ontleden de hersenen.
3. Bewaar de hersenen in Paraformaldehyde (4%) en vervolgens cryoprotect in een oplossing van sucrose (30%).
4. Snijd de hersenen in coronale delen van 50 μm met een cryostat.
5. Vlek de hersen sneden met Cresylacetaat Violet voor histologische verificatie van letsel en sonde plaatsing (Nissl-kleuring).

Resultaten

Met behulp van ons model van hersenschudding dat kracht en rotatie combineert met in vivo cerebrale microdialyse, verandert de acute extracellulaire glutamaat en GABA na een hersenschudding of schijn blessure in 21 mannelijke, volwassen, Sprague-Dawley ratten door de implantatie van een geleidecanule in de CA1-regio van de hippocampus.

Histologische verificatie van sonde plaatsing en letsel
Er werden geen morfologische veranderingen zoals massale Intracerebrale bloedingen of contusies gerapporteerd na de histologische verificatie van de weefselbeschadiging van de Hippocampus op secties die zijn gekleurd met Cresylacetaat Violet. Begeleiden canule implantatie en microdialyse sonde inbrengen veroorzaakte kleine en soortgelijke schade tussen geblesseerd en schijn gevallen. Bovendien, niet verwijderen van de sonde rechts voorschijn letsel of hersenschudding inductie geen onderscheidbaar te onderscheiden Hippocampus weefselschade zoals gezien onder een microscoop (Figuur 2b, C, respectievelijk), met het membraan van de sonde nog intact daarna (figuur 2D, E). Hersenschudding en schijn blessure hersenen geperfectiongebruikt met Paraformaldehyde (4%) 1 maand na microdialyse procedures zijn niet te onderscheiden bij visuele inspectie (figuur 2F, G).

Tijd van de rechtse reflex
De dieren van de gewonde groep hadden een significant toegenomen recht op het recht op gemiddelde versus schijn gevallen (student t-test, p = 0,042801) (Figuur 4) en leken verbijsterd toen ze het bewustzijn herwonnen. Van de 10 gevallen van de hersenschudding groep, toonde een enkel dier kleine tekenen van bloeden onder de impact site na de gewichtsafname. Er werden geen andere tekenen van schedelfractuur of intracraniële bloedingen waargenomen.

In vivo cerebrale microdialyse
Om als representatieve resultaten van onze methode te fungeren, werden 15 10 μL monsters van dialysaat geëxtraheerd uit de hippocampus, in vivo, met intervallen van 10 min en een debiet van 1 μL/min. extracellulaire niveaus van glutamaat en GABA werden gemeten uit 6 monsters tijdens Baseline ( 60 min) en uit 9 monsters na inductie van schijn letsel of hersenschudding (90 min).

Extracellulaire concentraties van glutamaat
Significante stijgingen van de extracellulaire glutamaatconcentraties werden waargenomen in de CA1-regio van de Hippocampus tijdens de eerste 10 minuten na inductie van trauma in vergelijking met schijn letsel (Mann-Whitney U test, p = 0,009175) (Figuur 5). Geen ander verschil in glutamaat concentraties werden waargenomen tussen groepen op een ander tijdstip punt.

Extracellulaire concentraties van GABA
Geen significante verandering in GABA concentraties werden waargenomen in de CA1-regio van de Hippocampus tijdens de eerste 10 minuten na inductie van trauma in vergelijking met schijn letsel (Mann-Whitney U test, p = 0,943861) (Figuur 6). Er was geen ander significant verschil in GABA concentraties op enig ander tijdstip tussen hersenschudding gevallen en schijn schadegevallen.

Figuur 1: schematische schets van het onderzoeksprotocol. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: histologische verificatie van de plaatsing van de sonde en letsel. (A) coronal View van de microdialyse sonde en gids canule placement site in de Hippocampus met behulp van de stereotaxic Atlas van Paxinos en Watson. B) representatieve photomicrograph van weefselbeschadiging van de Hippocampus (cresyl violet), geproduceerd door een microdialyse sonde en een geleidecanule uit een schijn blessure geval. C) representatieve photomicrograph van weefselbeschadiging van de Hippocampus (cresyl violet), geproduceerd door een microdialyse sonde en geleidecanule uit een hersenschudding. D) representatieve photomicrograph van een microdialyse sonde vóór de inductie van de hersenschudding. E) representatieve photomicrograph van een microdialyse sonde na inductie van de hersenschudding. Het membraan is nog intact. (F-G). Representatieve photomicrograph van een schijnvertoning (F) en hersenschudding (G) gewonde hersenen na perfusie met 4% Paraformaldehyde op 1 maand na schijn blessure of hersenschudding procedure. Bij visuele inspectie zijn de 2 hersenen niet te onderscheiden. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: hersenschudding apparatuur en microdialyse-instrumenten essentiële componenten afbeeldingen. A) een foto van de gehele samenstelling die bestaat uit een geleidings buis van verticaal polyvinylchloride (PVC) voor het dalende gewicht boven de rat fase, plexiglas frame, schuimkussen, computergestuurde microinfusion pomp, gasdichte spuiten, vloeibaar en naast elkaar gesmolten silica inlaat-uitlaat lijnen. B) Schematische weergave van het plexiglas frame en schuimkussen met alle relevante afmetingen. C) een foto van het gesleufde stukje aluminiumfolie die dient als de rat fase boven het schuimkussen. D) een foto die de plaatsing van de rat op het werkvlak vóór het hoofd effect door het dalende gewicht weergeeft. E) een foto die de rat na het hoofd effect weergeeft, ter illustratie van de horizontale rotatie van 180 ° van het lichaam van de rat na het hoofd effect en de daaruit voortvloeiende versnelling en rotatie. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: de tijd van de rechter. Histogram representaties van de tijd genomen door ratten te ontwaken uit het anestheticum en flip van de liggende positie naar de liggende positie of beginnen te lopen na de hersenschudding (rode diamanten, n = 10) of schijn letsel (blauwe vierkantjes, n = 11). Ratten uit de hersenschudding groep duurde aanzienlijk langer om zichzelf in vergelijking met de Sham letsel groep. Gemiddelde waarden worden weergegeven als een horizontale lijn in elke grafiek. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: extracellulaire concentraties van glutamaat. Gemiddelde extracellulaire concentraties van glutamaat (μg/mL), gemeten door microdialyse in de Hippocampus tijdens Baseline (60 min) en na hersenschudding (rode diamanten, n = 10) of schijn letsel (blauwe vierkantjes, n = 11) voorwaarden (90 min). Foutbalken geven de standaardfout van gemiddelde weer. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: extracellulaire concentraties van Gaba. Gemiddelde extracellulaire concentraties van GABA (μg/mL) gemeten door microdialyse in de Hippocampus tijdens Baseline (60 min) en na hersenschudding (rode diamanten, n = 10) of schijn letsel (blauwe vierkantjes, n = 11) voorwaarden (90 min). Foutbalken geven de standaardfout van gemiddelde weer. * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van IO masse 2018. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen in het Protocol
Voor het genereren van betrouwbare resultaten vereisen kritieke stappen in dit protocol bijzondere aandacht. Gebruik tijdens de implantatie operatie van de canule niet meer cement dan nodig, vooral wanneer het zeer vloeibaar is om te voorkomen dat u over de inslag plaats morsen. Om te voorkomen dat de implantatieplaats blokkeert, gebruikt u een obturator die even lang is als de canule. Plaats tijdens de microdialyse procedure de sonde langzaam in de canule en zorg ervoor dat deze volledig is ingebracht voor het bemonsteren van dialysaat. Voordat de hersenschudding inductie, zorg ervoor dat de aluminium plaat goed is gesleufde met een scherp scheermesje. Anders, de impact van het messing gewicht zal niet volstaan om de aluminium plaat te rippen en de rat zal blijven borst neer in plaats van het ondergaan van een 180 ° rotatie en landing op de rug. Als dit het geval is, zullen verwondingen veroorzaakt worden door de stompe impact, niet in tegenstelling tot wat wordt gezien in de gewicht druppel modellen met open schedel en aanzienlijk ernstiger zijn. Tijdens de hersenschudding inductie, Vermijd beïnvloeden de canule met het gewicht, omdat dit kritische schade aan de schedel van de rat zou genereren. Het wordt ten zeerste aanbevolen om in teams van 2 te werken om manipulatie fouten tijdens het experiment te beperken.

Wijzigingen en probleemoplossing
Tijdens de microdialyse procedure moet de stroom constant zijn en een volume opleveren dat geschikt is voor de snelheid van perfusie, zodra de sonde aan de pomp is gekoppeld. Lagere volumes kunnen duiden op de aanwezigheid van verstopping in het membraan van de sonde of luchtbellen in de lijnen. In het geval van verstopping, moet de sonde worden weggegooid en vervangen. Echter, luchtbellen kunnen worden uitgeworpen door circulerende ACSF in de lijnen. Als er geen verstopping of luchtbellen zijn genoteerd en er nog steeds geen stroom is, kan een klein deel van de uitstroom buis die het dichtst bij het einde ligt, worden afgesneden.

Beperkingen van de methode
Andere studies met de Wayne State University Weight-drop hebben geëvalueerd enkele fundamentele structurele en moleculaire veranderingen¹⁸. Een uitgebreider onderzoek zou echter de legitimiteit van deze procedure handhaven. Informatie over de biologische en neuroanatomische veranderingen die plaatsvinden op epigenetische en cellulair niveau zou de betrouwbare en translationele waarde van onze methode verder stollen. Bovendien, evaluatie van de cognitieve functie is een betrouwbare maatstaf voor de uitkomst gerelateerd aan mTBI in knaagdieren modellen³³. Terwijl de time-to-right werd gemeten in dit protocol en aanzienlijk werd vertraagd in gewonde gevallen in vergelijking met schijn gevallen, studies in de toekomst moeten concentreren op methodisch meten cognitieve functie na trauma inductie bij knaagdieren.

Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden.
De belangrijkste betekenis van de methode is tweeledig: ten eerste, het maakt de succesvolle inductie van een hersenschudding met de Wayne State University procedure, die snelle versnelling en vertraging van het hoofd en de romp toestaat. Met deze methode werden ernstige schade-uitkomsten zoals Cardiorespiratoire arrestaties, schedel fracturen, hoge sterfte en tekenen van zichtbare cerebrale contusies op de inslag plaats vermeden. Ten tweede, deze micro dialyse techniek met succes gerepliceerd de eerder gedemonstreerd de acute en kortstondige extracellulaire glutamaat vrijlating plaatsvindt binnen de eerste 10 minuten na trauma inductie^14,16. Bovendien vermindert het houden van de sonde gedurende de hele procedure aanzienlijk de kans op het induceren van schade aan de mTBI-gevoelige bloed-hersen barrière gekoppeld aan herhaalde microdialyse sonde insertie³⁴.

Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode.
Gezien de gemakkelijk te gebruiken aspecten van de Wayne State University gewicht-druppel procedure en de acute extracellulaire neurotransmitter veranderingen gemeten door microdialyse, ons rat model combineren van microdialyse en hersenschudding biedt onderzoekers met een betrouwbare instrument om de biomechanica van humaan craniocerebrale trauma getrouw te reproduceert en in de lengterichting de moleculaire effecten van hersenschuddingen te karakteriseren. Ons rat-model kan ook worden gebruikt in een breed scala aan therapeutische studies, omdat het een waardevolle kans biedt om het mechanisme en de werkzaamheid van farmacologische agentia in vivo te bestuderen, continu en zonder het dier op te offeren. Bovendien, de beschikbaarheid van een rat model zoals het hier gepresenteerde kan sterk vergemakkelijken het beter begrip van de relatie tussen de neurotransmitter onevenwichtigheden en de gedrags gevolgen van hersenschuddingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2%	Carefusion	260100C
Lidocaine Hydrochloride	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride	Hospira	1559
Ophthalmic Ointment	Baussh and Lomb inc.	2125706
Stereotaxic Frame	Stoelting	51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm	Harvard Apparatus	72-4837
Drill	Dremel	8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrylic Cement	Harvard Apparatus	72-6906
Screws	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409	Canadian Tire		For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot	HRS Scientific	SST-26/FT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X.011" ID	HRS Scientific	C314CT	For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X.023" ID	HRS Scientific	C313CT	For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long	HRS Scientific	008BSH/30S	For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar	Sirnay In.c	304	For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name	Company	Catalog Number	Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight	Rapido Métal Inc.		Attach metal loop to base
Metal Loop	Rona Inc.		Available at most hardware stores
PVC Guide Tube	Rona Inc.		Available at most hardware stores
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Tape			Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Présentoirs PlexiPlus Inc.		Custom made
Foam Cushion	Mousse D&R Foam Inc.		Custom made
Razor Blades	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley	Canadian Tire		Available at most hardware