We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We presenteren een flowcytometrische benadering voor het analyseren van mitochondriale ROS in diverse levende beenmerg (BM)-afgeleide stam-en voorlopercellen van gezonde muizen en muizen met AML aangedreven door MLL-AF9. Specifiek beschrijven we een tweestapskleurings proces, waarbij gezonde of leukemie BM-cellen eerst worden gekleurd met een fluorogene kleurstof die mitochondriale Super oxiden detecteert, gevolgd door kleuring met met fluorochrome verbonden monoklonale antilichamen die worden gebruikt verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische voorlopercellen te onderscheiden. We bieden ook een strategie voor het verwerven en analyseren van de monsters door flow Cytometry. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd in een tijdsbestek van slechts 3-4 h. We markeren ook de belangrijkste variabelen om te overwegen, evenals de voordelen en beperkingen van het bewaken van ROS productie in het mitochondriale compartiment van levende hematopoietische en leukemie stam en voorlopercellen subpopulaties met behulp van fluorogenic kleurstoffen doorstroming cytometrie . Bovendien presenteren we gegevens die mitochondriale ROS overvloed varieert tussen verschillende gezonde HSPC subpopulaties en leukemie voor ouders en bespreken de mogelijke toepassingen van deze techniek in hematologisch onderzoek.
Inleiding
Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn zeer reactieve moleculen afgeleid van moleculaire zuurstof. De meest goed gedefinieerde cellulaire locatie van ROS productie is de mitochondriën, waar elektronen die passeren de elektronentransport keten (ETC) tijdens oxidatieve fosforylering (OXPHOS) worden geabsorbeerd door moleculaire zuurstof die leidt tot de vorming van een specifieke type ROS genaamd Super oxiden1. Door de acties van een reeks enzymen, genaamd superoxide dismutases of sod's, worden super oxiden omgezet in waterstof peroxiden, die vervolgens worden geneutraliseerd in water door enzymen zoals katalase of glutathion peroxiasen (GPX). Verstoringen in ROS-regelgevende mechanismen kunnen leiden tot de overtollige productie van ROS, vaak aangeduid als oxidatieve stress, die schadelijke en potentieel dodelijke cellulaire gevolgen zoals Macromolecuul schade hebben (dat wil zeggen, DNA, eiwitten, lipiden). Bovendien is oxidatieve stress gerelateerd aan verschillende pathologieën, zoals diabetes, ontstekingsziekten, veroudering en tumoren2,3,4. Te handhaven redox homeostase en oxidatieve stress te voorkomen, cellen bezitten een verscheidenheid van ROS-regulerende mechanismen5.
Fysiologische niveaus van bepaalde ROS zijn noodzakelijk voor goede embryonale en volwassen Hematopoiesis6. Echter, overtollige ROS wordt geassocieerd met DNA-schade, cellulaire differentiatie en uitputting van het hematopoietische stam en voorlopercellen pool. Er is ook bewijs dat veranderingen in redox biologie kunnen verschillen tussen leukemie en gezonde cellen. Bijvoorbeeld, Ros niveaus neigen te zijn hoger in acute myeloïde leukemie (AML) cellen ten opzichte van hun gezonde tegenhangers en andere studies hebben gesuggereerd dat leukemie stamcellen een lage steady-state niveau van Ros voor overleving7,8behouden. Belangrijk, strategieën voor therapeutisch kapitaliseren op deze redox verschillen hebben aangetoond belofte in verschillende menselijke kanker instellingen9,10. Daarom, assays die het mogelijk maken voor de beoordeling van ROS niveaus in muismodellen kunnen verbeteren ons begrip van hoe deze soorten bijdragen aan cellulaire fysiologie en ziekte pathogenese, alsmede mogelijk bieden een platform voor de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe redox-gerichte anti-kankertherapieën.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven dier procedures zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Fox Chase Cancer Center.
Opmerking: De protocol-workflow is verdeeld in 4 delen zoals weergegeven in Figuur 1 en de vereiste reagentia worden vermeld in de Inhoudsopgave.
1. scheiding van beenmerg (BM)
Opmerking: MLL-AF9 leukemie muizen werden gegenereerd zoals eerder beschreven11.
- Herstel mono-nucleaire beenmergcellen, zoals eerder beschreven12,13,14,15, van wild type C57. Bl6 muizen (die de cd 45,2 congenic marker uitdrukken) en van C57. Bl6-SJL-muizen (die de CD 45,1 congenic marker uitdrukken) die zijn getransplanteerd met MLL-AF9-uitdrukken van leukemie cellen (CD 45,2+).
Opmerking: BM kan bij muizen worden teruggewonnen door12,13 te breken of door botten te spoelen14,15. Voor de hier gepresenteerde experimenten werd BM hersteld van zowel gezonde als leukemie muizen via Flushing.
2. mitochondriale ROS Fluorogenic kleurstof kleuring
- Zodra mono-nucleaire beenmergcellen zijn teruggewonnen uit gezonde en/of leukemie muizen, vlek een hoeveelheid cellen met Trypan blauw en tellen met behulp van een hemocytometer om te bepalen van het beginaantal van de totale BM-cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en respendeer de pellet in F-PBS (PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum en een 1% Penicileen/streptomycine cocktail) tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.
- Aliquot 200 μL celsuspensie per buis in 9 eenkleurige bedienings buizen met het label als volgt:
Geen vlek, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (alleen voor gezonde Hspc's), CD 45,2-APC (alleen voor leukemie cellen), CD34-FITC, mitochondriale ROS kleurstof en levende/dode cel vlek.
Opmerking: Optionele Een positieve controle voor de inductie van mitochondriale ROS kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM Menadione natrium Bisulfite (MSB) voor 1 uur bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Een tweede controle om de door MSB gemedieerde inductie van mitochondriale ROS om te keren kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM MSB plus 100 μM N-acetyl-L-CYSTEÏNE (NAC) voor 1 uur bij 37 °c in een 5% Co2 -incubator. - Aliquot de overblijvende cellen in een buis (experimentele buis) en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Respendeer de cellen in F-PBS met een levende/dode celvlek volgens de instructies van de fabrikant. Inincuberen op ijs gedurende 30 min. Zorg ervoor dat u Live/Dead Stain aan de eenkleurige controle buis toevoegt.
- Voeg 1,0 mL kamertemperatuur (RT) F-PBS toe aan zowel single-Color als experimentele buizen gekleurd met de Live/Dead kleurstof. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Respendeer 50 μg van de mitochondriale ROS-kleurstof in 13 μL dimethylsulfoxide (DMSO) om een 5 mM stockoplossing te verkrijgen.
- Verdun mitochondriale ROS-kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM in RT F-PBS met of zonder verapamil (50 μM).
- Aspirate uit de Wash van de levende/dode cel vlek. Voeg 200 μL mitochondriale ROS kleurstof vlek met verapamil toe aan elke experimentele buis en de mitochondriale ROS Dye éénkleurige controle buis.
- Vortex te mengen en inbroed gedurende 10 min bij 37 ° c in het donker.
- Voeg 1,0 mL RT F-PBS toe aan de mitochondriale ROS-gekleurd besturingselement met één kleur en experimentele buizen. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Zuig de supernatant uit en was de cellen met een extra 1,0 mL RT F-PBS. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
3. kleuring van Lineage-antilichamen
- Bereid de in tabel 1vermelde cocktails met antilichamen voor.
Opmerking: Deze antilichamen cocktails zijn eerder14,15,16geoptimaliseerd. - Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met gezonde BM en voeg 200 μL antilichaam cocktail #1 aan elke buis. Vortex om te mengen. Ook de single-Color besturings buizen voorbereiden. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.
- Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met leukemie BM en voeg 200 μL van de antilichaam cocktail #2 aan elke buis. Vortex om te mengen. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.
- Was met 1,0 mL koude F-PBS en centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Respendeer cellen in 500 μL koude F-PBS en filtreer de cellen in een flow cytometer-buis met behulp van een 40 μm-filter om aggregaten uit te sluiten.
4. flow Cytometrie acquisitie en analyse
Opmerking: Verschillende hematopoietische stam-en voorlopercellen zijn zeldzaam, zoals op lange termijn hematopoietische stamcel. Zo moeten idealiter 3-5 miljoen gebeurtenissen worden verzameld voor elke experimentele buis tijdens flow cytometrie verwerving voor voldoende analyse van mitochondriale ROS in de verschillende HSPC-subsets.
- Gebruik de No-Stain-bedienings buis om de spreidings plots (FSC-A) en Side (SSC-A) in te stellen op basis van de grootte en complexiteit van de geanalyseerde celpopulatie.
- Gebruik de buizen zonder vlekken en enkele kleuren om de flow cytometer te compenseren.
- Gate uit vreemd puin uit de voorwaartse en zijspreidings plot (Figuur 2A, B, eerste paneel van links).
- Poort uit wambuizen met een dubbele discriminator zoals de voorwaartse discriminator (Figuur 2a, B, tweede paneel van links).
- Volg de gating-strategie voorgesteld in afbeelding 2a,B om te selecteren van levende cellen, lineage lage cellen en de verschillende hspc en leukemie subsets.
- Analyseer voor elke populatie van belang de mediane fluorescentie intensiteit (MFI) van het TRPE-kanaal (x-as) in een histogram plot om de verschillen in het mitochondriale ROS-signaal te evalueren (Figuur 3a-C, linker panelen). Niveaus van mitochondriale ROS kunnen worden geëvalueerd op de single-cell niveau door het vergelijken van mitochondriale ROS kleuring versus specifieke Lineage markers in een Scatter plot.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gepresenteerd is een methode voor het analyseren van ROS in de mitochondriën van meerdere gezonde en MLL-AF9-uitdrukken leukemie populaties. Figuur 1 geeft een schematische weergave van de protocol workflow, die bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) BM-isolatie van muizen; 2) kleuring BM-cellen met een fluorogenic kleurstof die mitochondriale ROS herkent, met name Super oxiden; 3) oppervlak marker antilichaam kleuring te afbakenen verschillende gezonde en leukemie hematopoietische populaties...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Fluorogene kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor de detectie van Ros worden vaak geëvalueerd in vaste cellen door microscopie of in levende cellen door flow flowcytometrieonderzoeken22. Flow cytometrische evaluatie van mitochondriale ROS in BM-cellen met behulp van mitochondriale ROS fluorogenic kleurstoffen heeft twee belangrijke voordelen: 1) het is een snelle en eenvoudige techniek die geschikt is voor Live-celanalyse en 2) het maakt het mogelijk om te onderscheiden en te analyseren zeldzame po...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de Fox Chase Cancer Center Raad van bestuur (DDM), de American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) en het Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Referenties
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776(2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
