Methodenartikel

Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59606

⸱

11 mei 2019

 ,  ,  ,  , 
1Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry, School of Agriculture, Yangtze University, 2CSIRO Agriculture

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe de CFDA te laden in verschillende sites van de onderste delen van Arabidopsis. Vervolgens presenteren we de resulterende distributie patroon van CF in de scheuten.

Samenvatting

De symplastic Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein DIACETAAT (CFDA) is op grote schaal toegepast in levende planten om de intercellulaire verbinding, bastweefsel transport en vasculaire patronen aan te tonen. Dit protocol toont onder-naar-top carboxyfluorescein (CF) beweging in de Arabidopsis met behulp van de root-Cutting en de hypocotyl-knijpen procedure respectievelijk. Deze twee verschillende procedures resulteren in verschillende efficiency van de beweging van het CF: ongeveer 91% verschijning van CF in de spruiten met de hypocotyl-knijpende procedure, terwijl slechts ongeveer 70% verschijning van CF met de wortel-snijdende procedure. De eenvoudige verandering van het laden van sites, wat resulteert in significante veranderingen in de mobiele efficiëntie van deze symplastic kleurstof, suggereert CF-beweging kan worden onderworpen aan de symplastic verordening, waarschijnlijk door de root-hypocotyl Junction.

Inleiding

Vele fluorescente tracers met een waaier van spectrale eigenschappen, zoals 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic zuur2, Lucifer geel CH (LYCH)3, Esculin en CTER4, zijn ontwikkeld en toegepast in planten om symplastic beweging en bastweefsel activiteit te controleren. Over het algemeen, wordt een symplastic kleurstof geladen in een besnoeiing in het doelweefsel en de opeenvolgende verspreiding van de verslaggever in andere delen van installatie zal de intercellulaire mededeling aantonen. Hoewel het mechanisme van de kleurstof absorptie is niet volledig begrepen, het principe onderliggende CF-beweging in levende cellen is alom erkend. De ester vorm van CF (CF DIACETAAT, CFDA) is niet-fluorescerend, maar membraan doorlaatbaar. Deze eigenschap maakt een snelle membraan diffusie van de kleurstof in cellen. Eenmaal binnen levende cellen, intracellulaire esterasen verwijderen van de acetaatgroepen op de 3 ' en 6 ' positie van CFDA, het vrijgeven van de TL-en membraan-ondoordringbare CF (Figuur 1, alternatief verwijzen Wright et al.2); CF kan dan door de plasmodesmata naar andere delen van planten bewegen.

Een gevestigde procedure met CFDA is dat het in bron bladeren kan worden geladen en gebruikt om het bastweefsel stromende en bastweefsel het leegmaken in de gootsteen weefsels van vele soorten te controleren, b.v., zoals het leegmaken van het CF in Arabidopsis wortel5, bastweefsel het leegmaken tijdens de aardappel tuberization6, bastweefsel lossen in de Nicotiana gootsteen bladeren7, en zo verder. Door gelijkaardige ladings benaderingen, hebben andere studies deze kleurstof goedgekeurd om de symplastic verbinding tussen gastheer en parasiet8,9te demonstreren, of de symbiotische verhoudingen10,11te openbaren.

Een andere manier om gebruik te maken van deze kleurstof is om het te laden in specifieke cellen of een cel door middel van Microinjection om zijn distributie patroon te bepalen. Dergelijke verfijnde technieken hebben sterk vergemakkelijkt ons dieper begrip van plasmodesmata-gemedieerde intercellulaire communicatie, met name in de ontwikkeling van het concept van symplastic domein12,13. Bijvoorbeeld, de Microinjection van CFDA in cotyledon cellen van Arabidopsis resulteerde in het kleurstof-koppelings patroon in de hypocotyl epidermis maar niet-koppeling in de onderliggende cellen of in de wortel epidermis, daarom vormt de hypocotyl epidermis een symplastic domein14. Vergelijkbare domeinen, zoals de stomatale Guard cellen15, zeef element-Companion cellen16, wortel haarcellen14 en root Cap17,18 zijn geïdentificeerd door de Microinjection techniek. Het meest verrassend, sommige domeinen kunnen Tracer moleculen te verplaatsen in een bepaalde richting. Neem de trichome domein bijvoorbeeld, Microinjection van een fluorescente sonde in de ondersteunende epidermale cel leidt tot de stroom van Tracer in het trichome domein, echter, de omgekeerde injectie houdt geen waar19. Een recent rapport heeft ook gelijkaardige situaties gevonden in de symplastic domeinen van het Sedum embryo20. Dus, alle bovenstaande gevallen impliceren dat het ruilen van laadplaatsen kan leiden tot nieuwe inzichten in symplastic communicatie. Ons vorige experiment gericht op het ontleden van de route van root-to-shoot mobiele silencing identificeerde een nieuwe symplastic domein, of de HEJ (Hypocotyl-epicotyl Junction) zone, die verder werd geverifieerd door de root-loading (niet-canonieke gootsteen-loading) CFDA experiment21. Hier, we verder uitwerken van de root-to-shoot CF-beweging met behulp van een eenvoudige methode en herstellen van een potentieel symplastic domein door het verschuiven van de laad-sites. Bovendien kan deze procedure worden aangepast aan de genetische achtergronden die zijn veranderd root-to-shoot lange afstand vervoer te differentiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Arabidopsis verticale groei in MS medium

  1. Het binnenland van laminaire stroom kabinet moet met 30 min UV licht en 15 min luchtstroom vóór gebruik worden behandeld. Zorg ervoor dat de glazen deur te sluiten wanneer UV-licht is ingeschakeld. Spray alle gereedschappen en platen met 70% ethanol alvorens ze in de kast.
  2. Bereid het Murashige en Skoog (MS) medium in een standaard 90 mm diameter Petri schaaltje onder een laminaire stromings kast.
    Opmerking: de MS medium bevat de volgende componenten: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mm MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 µ m na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 µ m ZnSO4· 7H2o, 0,1 µ m CuSO4· 5H2o, 0,1 µ m CoCl2· 6 uur2o, 1,39 µ m ki, 97 µ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 µ m ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA), 4,07 µ m nicotinezuur, 2,44 µ m pyridoxine hcl, 0,15 µ m thiamine hcl, 2,68 mm glycine, 555 µ m-inositol, 87,7 mm sacharose en 10 g/L agar.
  3. Hydrateren de gesteriliseerde tips of tandenstokers door het aanraken van de tip of tandenstokers aan de MS medium, dan Dompel de gesteriliseerde zaden een voor een op de vaste positie van elke Petri schaal aangegeven door de seeding kaart.
  4. Seal de Petri schaal met paraffine folie en plakband en plaats het verticaal op een duidelijke stand in een Groeiruimte (22 °C, 70% vocht) met een dag cyclus van 16 uur licht en 8 h van de duisternis (verlichting van 6 uur tot 10 uur). De Arabidopsis plant is klaar voor CFDA laden op dag 9-13 na het zaaien.
    Let op: de volgende procedure wordt uitgevoerd in de namiddag van 14.00 uur tot 17.00 uur.

2. CFDA laden met de wortel snijden procedure

  1. Bereid vers CFDA werkoplossing onmiddellijk voor gebruik. Verdun de 1 mM CFDA stockoplossing opgeslagen in-20 °C diepvries met steriele ultrapuur water tot een werkende concentratie van 5 µ M.
  2. Snijd de micro-poreuze paraffine folie (Zie de lijst van materialen) in kleine stukjes van 3 mm x 3 mm grootte.
  3. Ontdek de groeiende planten in de kamer op 22 ° c en duidelijk het overtollige vocht met een papieren handdoek. Plaats de kleine stukjes film onder elke wortel.
    Nota: van dit aan stap 2,6, zou het gehele proces binnen 15 min moeten worden voltooid.
  4. Til de planten op de Petri schaal deksel. Snijd de wortels in een positie van ongeveer 5-10 mm onder de wortel-hypocotyl kruising. Plaats de shoot deel terug op de film op het medium.
  5. Zorgvuldig van toepassing 0,25 µ L van CFDA op het snij einde van elke wortel onder een ontleden Microscoop. Vermijd spatten naar andere delen van de plant.
  6. Bedek de plaat en laat de planten onder het licht voor 2-3 h (22 ° c) in de Groeiruimte.
  7. Spoel de gebeitste planten drie keer achtereenvolgens in drie afzonderlijke bekers gevuld met gedistilleerd water, dan observeren de planten onder een stereo-fluorescentiemicroscoop met zoom van 1,4 x tot 3.3 x (Zie de tabel van materialen). Voor fluorescentie detectie, gebruik maken van een hoog rendement filter kubus (470/20 nm excitatie, 495 Nm Split en 525/50 nm emissie) gemonteerd op de fluorescentie signaal te zenden.

3. CFDA laden met hypocotyl-knijpen procedure

  1. Bereid vers CFDA werkoplossing onmiddellijk voor gebruik. Verdun de 1 mM CFDA stockoplossing opgeslagen in-20 °C diepvries met steriele ultrapuur water (Zie de tabel van materialen) tot een werkende concentratie van 5 µ m.
  2. Snijd de micro-poreuze paraffine folie (Zie de lijst van materialen) in kleine stukjes van 3 mm x 3 mm grootte.
  3. Ontdek de groeiende planten in de kamer op 22 ° c en duidelijk het overtollige vocht met een papieren handdoek.
    Nota: van dit aan stap 3,7, zou het gehele proces binnen 15 min moeten worden voltooid.
  4. Leg een klein stukje film onder de wortel-hypocotyl kruising van elke plant.
  5. Gebruik een tang om voorzichtig knijp de hypocotyl in de buurt van de wortel-hypocotyl kruising onder een ontleden Microscoop.
  6. Zorgvuldig van toepassing 0,1 µ L van CFDA op de wond site onder een ontleden Microscoop. Vermijd spatten naar andere delen van de plant.
  7. Bedek de plaat, en laat de planten onder het licht (22 ° c) voor 2-3 h.
  8. Spoel de gebeitste planten drie keer achtereenvolgens in drie afzonderlijke bekers gevuld met gedistilleerd water, dan observeren de planten onder een stereo-fluorescentiemicroscoop met zoom van 1,4 x tot 3.3 x (Zie de tabel van materialen). Voor fluorescentie detectie, Monteer een hoog rendement filter kubus (470/20 nm excitatie, 495 Nm Split en 525/50 nm emissie) om het fluorescentie signaal te zenden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Symplastic beweging is vaak onderhevig aan milieu fluctuaties. Verstoring van de plant groeiende staat, en zelfs het proces van weefsel bereiding zal invloed hebben op de grootte uitsluiting grens van plasmodesmata, waardoor de symplastic transport22. Ter verbetering van de kleuring efficiëntie, beperken we onze werking in de Groeiruimte, waar de temperatuur en vocht is strak gecontroleerd, en ook de hele procedure zo snel mogelijk (idealiter binnen 10-15 min na he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Opkomende studies hebben aangetoond dat planten snel kunnen reageren op externe stimuli23, met inbegrip van manipulatie ingevoerd om de experimentele procedures22. In onze eerste experiment, ons toezicht op deze kennis leidt vaak tot vlekken falen. Met deze lessen stellen wij voor dat de volgende voorzorgsmaatregelen in gedachten worden gehouden bij het uitvoeren van dit experiment: (1) de zaden na de oogst moeten worden bewaard in een opbergkast ingesteld op een lage tempe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door National Natural Science Foundation of China (31671257) en Hubei Collaboratief innovatiecentrum voor graan industrie (LXT-16-18).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

Referenties

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Symplastisch transportflo mbewegingwortelsnijdenhypocotyl afknellingArabidopsis plantenfluorescente sondeplasmodesmata transportvasculair kleuren

Gerelateerde artikelen