Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie

Summary

We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.

Abstract

Atoom kracht microscopie gebaseerde eencellige kracht spectroscopie (AFM-SCFS) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van biofysische eigenschappen van levende cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de sterktes en dynamiek van interacties op een levend celmembraan te indringende, inclusief die tussen cellen, receptor en liganden, en naast vele andere variaties. Het werkt ook als een mechanisme voor het leveren van een fysieke of biochemische stimulans op afzonderlijke cellen in een spatiotemporaal gecontroleerde manier, waardoor specifieke celactivering en daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen in real-time worden bewaakt in combinatie met Live-cel fluorescentie beeldvorming. De belangrijkste stap in die AFM-SCFS-metingen is AFM-Cantilever functionalisatie, of met andere woorden, het koppelen van een onderwerp van belang aan de Cantilever. Hier presenteren we methoden voor het wijzigen van de AFM-cantihefbomen met een enkele T-cel en een enkele polystyreen kraal voor immunologische studies. De eerste omvat een biocompatibele lijm die koppels enkele T cellen aan de punt van een vlakke vrijdragende in een oplossing, terwijl de laatste is gebaseerd op een epoxy lijm voor enkele kraal hechting in de lucht omgeving. Twee immunologische toepassingen in verband met elke aanpassing van de cantilever worden ook verstrekt. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende celtypen en vaste deeltjes.

Introduction

Atomic Force microscopie (AFM), een veelzijdig instrument, heeft veel toepassingen gevonden in onderzoek naar celbiologie^1,2,3,4,5. Afgezien van de beeldvormings capaciteit met hoge resolutie, kunnen met de native Force-probing-functie biofysische eigenschappen van levende cellen direct in situ worden onderzocht op het eencellige niveau^6,7. Deze omvatten de rigiditeiten van subcellulaire structuren of zelfs hele cellen^8,....

Protocol

Het muis experiment protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van Tsinghua University

1. Cantilever functionalisatie met enkelvoudige T-cellen

1. Voorbereiding van de milt cellen van de muis
   1. Offer de muis (8-16 weken leeftijd (ofwel geslacht), bijvoorbeeld C57BL/6 stam) met behulp van kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie.
   2. Reinig de muis met 75% ethanol en maak een middellijn huid incisie gevolgd door splenectomie.
   3. Homogeniseer de milt in 4 mL PBS met 2% foetaal runderserum (FBS) met behulp van glazen glijbanen en verwijder aggregaten en puin door de celsuspensie door een 70 μm mesh ny....

Results

Fig. 4a toont typische kracht-afstand curves van de bindings interactie tussen één-T cel en single-DC in één benadering-intrekken cyclus. De licht rode curve is de Verleng curve en het donker rode is de terugtrek curve. Aangezien de uitbreidings curve meestal wordt gebruikt voor inspringingen of stijfheid-analyse, is hier alleen de terugtrek curve van kracht voor celadhesie. De minimumwaarde (de groene cirkel) in de curve geeft een maat voor de maximale adhes.......

Discussion

De op de AFM gebaseerde eencellige kracht spectroscopie is geëvolueerd tot een krachtig hulpmiddel om de biofysische eigenschappen van levende cellen aan te pakken. Voor deze toepassingen moet de cantilever correct worden gefunctionaliseerd om specifieke interacties of eigenschappen op de cellen van belang te sonde. Hier worden de methoden voor het koppelen van enkele T-cellen en één-micron-formaat kraal naar de punt-minder-Cantilever respectievelijk beschreven. Om een enkele T-cel aan de cantilever te bevestigen, werd e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
10 μl pipette tip	Thermo Fisher	104-Q
15 ml tube	Corning	430791
6 cm diameter culture dish	NALGENE nunc	150462
6-well culture plate	JET	TCP011006
AFM Cantilever	NanoWorld	Arrow-TL1-50	tipless cantilever
β-Mercaptoethanol	Sigma	7604
Biocompatible glue	BD Cell-Tak	354240
CD4+ T cell isolation Cocktail	STEMCELL	19852C.1
DC2.4 cell line	A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles	STEMCELL	SV30010
EDTA	GENEray	Generay-E1101-500 ml
Epoxy	ERGO	7100
Ethanol	twbio	00019
FBS	Ex Cell Bio	FSP500
FcR blocker	STEMCELL	18731
Glass coverslip	local vender (Hai Men Lian Sheng)	HX-E37	24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides	JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen	N/A	customized
H2O2 (30%)	Sino pharm	10011218
H2SO4	Sino pharm	80120892
HEPES	Sigma	51558
Magnet	STEMCELL	18000
Mesh nylon strainer	BD Falcon	REF 352350
Moesin-EGFP	N/A		cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit	STEMCELL	18782	Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit	STEMCELL	19852	Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH	Lanyi chemical products co., LTD? Beijing	1310-73-2
PBS	Solarbio	P1022-500
PE selection cocktail	STEMCELL	18151
Penicillin-Streptomycin	Hyclone	SV30010
PLCδ-PH-mCherry	Addgene	36075
Polystyrene microspheres 6.0μm	Polysciences	07312-5
polystyrene round bottom tube	BD Falcon	352054
Rat serum	STEMCELL	13551
RAW264.7	ATCC
Recombinant Human Interleukin-2	Peprotech	Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail	STEMCELL	18782C
RPMI 1640	Life	C11875500BT
Sample chamber	Home made
Streptavidin-coated magnetic particles	STEMCELL	50001
Transfection kit	Clontech	631318
Trypsin 0.25% EDTA	Life	25200114
Tweezers	JD	N/A
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
20x objective NA 0.8	Zeiss	420650-9901	Plan-Apochromat
Atomic force microscope	JPK	cellHesion200
Centrifuge	Beckman coulter	Allegra X-12R
Fluorescence imaging	home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator	Thermo Fisher	HERACELL 150i
Inverted light microscope	Zeiss	Observer A1 manual