We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Atoom kracht microscopie gebaseerde eencellige kracht spectroscopie (AFM-SCFS) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van biofysische eigenschappen van levende cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de sterktes en dynamiek van interacties op een levend celmembraan te indringende, inclusief die tussen cellen, receptor en liganden, en naast vele andere variaties. Het werkt ook als een mechanisme voor het leveren van een fysieke of biochemische stimulans op afzonderlijke cellen in een spatiotemporaal gecontroleerde manier, waardoor specifieke celactivering en daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen in real-time worden bewaakt in combinatie met Live-cel fluorescentie beeldvorming. De belangrijkste stap in die AFM-SCFS-metingen is AFM-Cantilever functionalisatie, of met andere woorden, het koppelen van een onderwerp van belang aan de Cantilever. Hier presenteren we methoden voor het wijzigen van de AFM-cantihefbomen met een enkele T-cel en een enkele polystyreen kraal voor immunologische studies. De eerste omvat een biocompatibele lijm die koppels enkele T cellen aan de punt van een vlakke vrijdragende in een oplossing, terwijl de laatste is gebaseerd op een epoxy lijm voor enkele kraal hechting in de lucht omgeving. Twee immunologische toepassingen in verband met elke aanpassing van de cantilever worden ook verstrekt. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende celtypen en vaste deeltjes.
Inleiding
Atomic Force microscopie (AFM), een veelzijdig instrument, heeft veel toepassingen gevonden in onderzoek naar celbiologie1,2,3,4,5. Afgezien van de beeldvormings capaciteit met hoge resolutie, kunnen met de native Force-probing-functie biofysische eigenschappen van levende cellen direct in situ worden onderzocht op het eencellige niveau6,7. Deze omvatten de rigiditeiten van subcellulaire structuren of zelfs hele cellen8,9,10,11,12, specifieke ligand/receptor bindende sterktes op de enkel molecuul niveau op het celoppervlak13, en adhesie krachten tussen enkelvoudige paren van vaste deeltjes en cellen of tussen twee cellen1,2,14,15. De laatste twee zijn vaak gecategoriseerd als single-cell Force spectroscopie (SCFS)16. Vanwege de gemakkelijk verkrijgbare cantihefbomen met verschillende veerconstante, is het kracht bereik dat toegankelijk is voor de AFM vrij breed van een paar piconewtons (pN) tot micronewtons (μN), die adequaat betrekking hebben op het hele bereik van cellulaire gebeurtenissen waarbij krachten van enkele tientallen van pN, zoals receptor-gebaseerde enkelvoudige molecuul binding, aan nN, zoals fagocytische cellulaire gebeurtenissen15. Dit grote dynamische kracht bereik maakt de AFM voordelig ten opzichte van andere kracht-probing technieken zoals optische/magnetische pincet en een biomembraan kracht sonde, omdat ze meer geschikt zijn voor zwakke-krachtmetingen, met kracht meestal minder dan 200 pN17 , 18. Daarnaast kan de AFM functioneren als een uiterst nauwkeurige manipulator om verschillende stimuli op afzonderlijke cellen te leveren in een spatiotemporeel gedefinieerde manier4,19. Dit is wenselijk voor de real-time activering van eencellige onderzoeken. In combinatie met Live-cel fluorescentie beeldvorming kan de daaropvolgende cellulaire respons op de specifieke stimulus gelijktijdig worden gemonitord, waardoor de op de AFM gebaseerde SCF'S uitermate robuust zijn als optische beeldvorming die een praktisch hulpmiddel biedt om cellulaire signalering te controleren. Zo werd de AFM gebruikt om de stammen te bepalen die nodig waren om calcium transiënten in osteoblasten20uit te lokken. In dit werk werden calcium transiënten fluorescently gevolgd door calcium ratiometrische beeldvorming na de toepassing van gelokaliseerde krachten op gekweekte osteoblasten met een AFM-tip. Onlangs werd de AFM gebruikt om collageen fibrillen op te rekken waarop hepatische ecoagriturismo late cellen (HSC) werden geteeld en deze mechano-transduced HSC activering werd Real-time gemonitord door een fluorescerende src biosensor, waarvan de fosforylering zoals vertegenwoordigd door de de fluorescentie intensiteit van de biosensor is gecorreleerd met HSC Activation3.
In de op AFM gebaseerde SCFS-experimenten is een goede functionalisatie van AFM-cantihefbomen een belangrijke stap in de richting van succesvolle metingen. Omdat onze onderzoeksinteresse zich richt op immuuncellen activatie, functionaliseren we routinematig cantihefbomen met deeltjes zoals enkelvoudige vaste deeltjes die fagocytose en/of sterke immuunresponsen kunnen triggeren4,14 , 15 en enkele T-cellen die een immuunsynaps kunnen vormen met antigeen die cellen presenteren, zoals geactiveerde dendritische cellen (DC)2. Enkelvoudige vaste deeltjes worden normaliter gekoppeld aan een Cantilever via een epoxy lijm in de lucht omgeving, terwijl enkelvoudige T-cellen, vanwege hun niet-klevende aard, worden gefunctionaliseerd tot een Cantilever via een biocompatibele lijm in oplossing. Hier beschrijven we de methoden om deze twee typen Cantilever modificatie uit te voeren en geven we ook twee gekoppelde toepassingen. De eerste toepassing is het sonde T cel/DC interacties met AFM-SCFS om te begrijpen van de suppressieve mechanisme van regelgevende T cellen van het oogpunt van de cel mechanica. De tweede omvat het combineren van de AFM met een live-cel fluorescentie beeldvorming om de cellulaire respons van macrofaag op een vast deeltje in real-time te monitoren om het moleculaire mechanisme van receptor-onafhankelijke phosphatidylinositol-4, 5-bisfosfaat(PIP2)- Moesin gemedieerde phagocytose. Het doel van dit protocol is om een referentiekader te bieden voor geïnteresseerde onderzoekers om hun eigen experimentele instellingen te ontwerpen en te implementeren met een op de AFM gebaseerde eencellige analyse voor immunologisch onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het muis experiment protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van Tsinghua University
1. Cantilever functionalisatie met enkelvoudige T-cellen
- Voorbereiding van de milt cellen van de muis
- Offer de muis (8-16 weken leeftijd (ofwel geslacht), bijvoorbeeld C57BL/6 stam) met behulp van kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Reinig de muis met 75% ethanol en maak een middellijn huid incisie gevolgd door splenectomie.
- Homogeniseer de milt in 4 mL PBS met 2% foetaal runderserum (FBS) met behulp van glazen glijbanen en verwijder aggregaten en puin door de celsuspensie door een 70 μm mesh nylon zeef te passeren.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g , gooi de supernatant en respendeer cellen in 2 ml rode bloedcel lysisbuffer (Gebalanceerd bij kamertemperatuur) gedurende 5 min. Beëindig de lysisreactie door 8 ml PBS-oplossing toe te voegen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten en respendeer cellen met een dichtheid van 1 x 108 cellen/ml in PBS met 2% FBS en 1 mm EDTA (gelabeld als oplossing a), meestal 0,25-2 ml, afhankelijk van de celdichtheid. Breng de geresuspendeerde cellen over in een ronde bodem buis van 5 mL (12 x 75 mm).
- Voorbereiding van CD4 + T-cellen van de muis
- Voeg 50 μL/mL rat serum (Zie tabel met materialen) en 50 ΜL/ml CD4 + T cell isolation cocktail (Zie tabel met materialen) toe aan het celmonster dat uit stap 1.1.5 is verkregen. Meng en inbroed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Vortex de voorraad streptavidine gecoate magnetische deeltjes oplossing (Zie tabel van de materialen) voor 30 s of totdat de deeltjes gelijkmatig gedispergeerd lijken.
- Voeg aan het celmonster 75 μL/mL streptavidine-gecoate magnetische deeltjes toe. Meng en inbroed 2,5 min bij kamertemperatuur.
- Voeg oplossing A toe om het celmonster op te maken tot 2,5 mL en meng door voorzichtig voor 2-3 keer op en neer te pipetteren.
- Plaats de monsterbuis (zonder deksel) in de magneet (Zie tabel met materialen) en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet de verrijkte celsuspensie voorzichtig in een nieuwe polystyreen ronde bodem buis van 5 mL.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en breng de verrijkte T-cellen weer in 500 ΜL oplossing A.
Opmerking: de verrijkte CD4 + T-cellen bevatten zowel conventionele als regulerende T-cellen.
- Regelgevende T-cellen scheiden van conventionele T-cellen
- Voeg 25 μL FcR Blocker (Zie tabel van de materialen) toe aan het verrijkte T-celmonster dat is verkregen uit stap 1.2.6. Meng en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 25 μL regelgevende T-cel positieve selectie cocktail (Zie tabel met materialen) toe aan het T-celmonster. Meng en inbroed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 μL PE-selectie cocktail (Zie tabel met materialen) toe aan het T-celmonster. Meng en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vortex de voorraad dextran gecoate magnetische deeltjes oplossing (Zie tabel van de materialen) voor 30 s of totdat de deeltjes gelijkmatig verspreid lijken.
- Voeg 10 μL dextran-gecoate magnetische deeltjes toe aan het T-celmonster. Meng en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de oplossing A toe om het T-celmonster op te maken tot 2,5 mL en meng door voorzichtig 2-3 keer op en neer te pipetteren.
- Plaats de T Cell sample Tube (zonder deksel) in de magneet en incuberen gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Giet de supernatant voorzichtig in een nieuwe buis.
Opmerking: de supernatant bevat de verrijkte conventionele CD4 + T-cellen. - Centrifugeer de verrijkte conventionele CD4 + T-cellen bij 500 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en breng de cellen in 4 ml RPMI1640 met 10% fbs, 0,05 mm β-mercaptoethanol, 0,01 M Hepes en 1% penicillaire/streptomycine (gelabeld als medium B).
- Verwijder de buis waarin regulatoire T-cellen zijn verrijkt met de magneet. Voeg 2,5 mL oplossing A toe aan de buis en meng door voorzichtig voor 2-3 keer op en neer te pipetteren. Plaats de buis weer in de magneet, inbroed gedurende 5 minuten en giet vervolgens voorzichtig af en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog drie keer.
- Respendeer de verrijkte regulatoire T-cellen in 2 mL medium B.
- Incuberen zowel gezuiverde conventionele T-cellen als regulatoire T-cellen met 100 U/mL hIL-2 's nachts of gedurende ten minste 4 uur bij 37 °C in een bevoficeerde incubator met 5% CO2 voordat het wordt gebruikt voor Cantilever functionalisatie.
- Voorbereiding van dendritische cellen
- Bereid Piranha-oplossing, een mengsel van 30% H2O2 (30%) en 70% H2so4 (conc) (v/v). Giet langzaam 3 mL H 2O2 in 7 ml h2, dus4 onder constant roeren en koelen.
VOORZICHTIG: Piranha-oplossing is zeer corrosief en kan lichaamsweefsels verbranden en vernietigen. Daarom is het veiliger om de Piranha-oplossing onder een kap te gebruiken en geschikte veiligheidsuitrusting te dragen, omdat het mengsel rond het bekerglas spat. Neutraliseer de oplossing met NaOH tot pH 7 na gebruik. - Dompel de glazen afdekplaat met een diameter van 24 mm in de Piranha-oplossing gedurende 30 minuten onder en spoel daarna grondig met het steriele ultrapuur water.
- Dompel een paar puntige pincet in 75% ethanol gedurende 30 minuten voor koude desinfectie.
- Introduceer de gereinigde glazen dekstroken in een 6-well kweek plaat door de pincet.
- Kantel een 6 cm kunststof kweek schotel waarin DC 2.4 cellen vooraf gekweekt met 4 mL medium B en aspireren alle medium. Voeg 2 mL PBS toe aan het kweekbakje om DC 2.4-cellen af te spoelen en PBS weg te gooien. Herhaal deze spoel stap nog twee keer.
- Voeg 1 mL 0,25% trypsine EDTA toe aan het kweekbakje gedurende 2 min. Voeg 1 mL medium B toe aan dit gerecht om de enzym digestie reactie te beëindigen. Breng de verteerde celsuspensie over in een buis van 15 mL.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten en hervat DC 2.4-cellen met een dichtheid van 2 x 105 cellen/ml in medium B.
- Zaad DC 2.4 cellen op de glazen dekstroken bereid bij stap 1.4.4 en inbroed de cellen 's nachts in een bevoficeerde kamer bij 37 ° c met 5% CO2.
Opmerking: om de interactie krachten tussen twee afzonderlijke cellen te meten, is een relatief lage concentratie van DC 2.4-cellen (d.w.z. < 10% confluency) nodig om een juiste afstand tussen cellen te hebben.
- Bereid Piranha-oplossing, een mengsel van 30% H2O2 (30%) en 70% H2so4 (conc) (v/v). Giet langzaam 3 mL H 2O2 in 7 ml h2, dus4 onder constant roeren en koelen.
- AFM voorbereiding van de cantilever
Opmerking: Cantihefbomen die geschikt zijn voor eencellige kracht spectroscopie experimenten zijn die met lage veer constanten, meestal in het bereik van 0,01-0.06 N/m. Hier hebben zachte Tip-less cantihefbomen de voorkeur voor afzonderlijke cellen en enkelvoudige vaste deeltjes functionalisatie.- Reinig de cantihefbomen door Piranha-behandeling of plasma-of UV-ozon reiniging.
- Monteer de gereinigde cantilever op de AFM-scankop.
- Bereid een schone monsterkamer gevuld met zuiver water en Kalibreer de cantilever in wateroplossing door eerst een krachtcurve op het glas substraat te draaien om de gevoeligheid te verkrijgen (de helling van de lineaire pasvorm over het repulsieve deel van de naderende kromme) en vervolgens een thermisch ruis spectrum opnemen om de veerconstante te extraheren volgens de gebruiksaanwijzing van de AFM.
- Verwijder de AFM-scan hoofd uit de oplossing, was de gemonteerde Cantilever met enkele druppels zuivere ethanol en houd de cantilever droog op de scankop.
- Enkelvoudige T-cellen aan de cantilever bevestigen
- Verwarm de behuizing van de leefcel met 5% CO2 bij 37 °c.
- Monteer de glazen afdek met DC 2.4 cellen geteeld op het van stap 1.4.8 naar een monsterkamer assemblage, voeg 600 μL medium B onmiddellijk aan de kamer, en vervolgens zet de vergadering op de AFM monster fase.
- Voeg hIL-2 geïnde CD4 + T-cellen (conventionele of regulerende T-cellen) toe aan de monsterkamer.
Opmerking: het totale monstervolume mag niet groter zijn dan 1 mL. - Wacht tot de toegevoegde CD4 + T-cellen volledig zijn afgeregeld op de onderkant van de dekslip.
Opmerking: luchtbellen zullen grote verstoring van het experiment veroorzaken, daarom is het raadzaam om eventuele luchtbellen in stap 1.6.2 en 1.6.3 te voorkomen. - Voeg een druppel van 2 μL biocompatibel lijm toe aan het uiteinde van de gemonteerde Cantilever met een pipet zoals weergegeven in Figuur 1 en plaats de scankop vervolgens snel op de monster fase, zodat de cantilever die met de biocompatibele lijm is bekleed, onderdompelt in de Oplossing.
Let op: Raak het glas blok of de cantilever niet aan met de pipetpunt. Aangezien de hier gebruikte biocompatibele lijm gevoelig is voor oxidatie in lucht, moet deze stap zo snel mogelijk worden uitgevoerd. - Zoek een gezonde T-cel onder de punt van de cantilever grof onder de Microscoop door de monster fase te verplaatsen en de positionering vervolgens fijn aan te passen door de scankop te bewegen.
Opmerking: een gezonde CD4 + T-cel heeft meestal een relatief grote grootte, vloeiende randen en optisch transmissieve in de helder-veld beeldvorming. - Verlaag de cantilever handmatig met stap-maten vanaf 50 μm vervolgens tot 10, 5, 2 en 0,5 μm geleidelijk door de stappenmotoren te regelen. Houd de positie van de stappenmotoren vast en pas de positionering van de scankop aan voor een betere uitlijning tussen de cantilever-Tip en de cel, zodra de cantilever een stevig contact maakt met de doelcel, zoals aangegeven door een kleine verplaatsing van de laserstraal positie in de foto detector die overeenkomt met een typisch kracht bereik van 0,5-1,5 nN.
Opmerking: deze stap kan ook worden uitgevoerd door een enkele krachtmeting uit te voeren waarbij een set-punt (de kracht die op de cel wordt toegepast) en de contacttijd goed kunnen worden gedefinieerd in de software. Echter, vanwege de niet-klevende aard van T-cellen, biedt de handmatige aanpak meer flexibiliteit bij het regelen van het richten, positioneren en contacttijd dan de automatische nadert en het werkt betrouwbaar voor de hechting van de T-cel. Toekomstige ervarings activisten moeten zowel de handmatige als de automatische naderen proberen om erachter te komen welke beter werkt voor hun systemen van belang. - Trek de cantilever na 30 s contact intrekken.
Opmerking: als de cel met de cantilever beweegt, is de bijlage succesvol. Zo niet, herhaalt u stap 1.6.6 maar op een andere T-cel. De biocompatibele lijm wordt gemakkelijk geoxideerd. Stap 1.6.5-1.6.7 moet binnen 5 minuten worden voltooid. Bovendien, als dezelfde Cantilever drie keer mislukt voor de T-celbijlage, moet een nieuwe Cantilever worden gebruikt en moet de bevestigingsprocedure opnieuw beginnen bij stap 1.5.2.
Figuur 1: schematische weergave van het toevoegen van een kleine druppel biocompatibele lijm op de gemonteerde Cantilever. De cantilever wordt gemonteerd via een klem veer op de glazen blok houder die is geïnstalleerd op de AFM-scankop (hier niet getekend). Wanneer de scankop op een oppervlak staat, is de cantilever verticaal georiënteerd zoals aangegeven in de tekening. Aan de punt van de cantilever kan met een micro pipet ongeveer 2 μL biocompatibele lijm worden toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Kracht spectroscopie van enkelvoudige T-cel/dendritische celinteractie
Opmerking: om de celinteracties te peilen is een AFM met een Z-bereik groter dan de conventionele 10-15 μm vereist om de twee cellen volledig te scheiden. De AFM die hier wordt gebruikt heeft een Z-bereik van 100 μm, wat voldoende is om de T-cel van de dendritische cel te scheiden na het celcontact.- Plaats de bijgevoegde T-cel boven een afzonderlijke DC 2.4-cel door de monster fase en/of de scankop te verplaatsen (Zie Figuur 2).
- Stel de juiste parameters in en voer Force spectroscopie uit.
Opmerking: de volgende belangrijke instellingen worden meestal gebruikt: setpoint 0,5 nN, trek lengte 50 μm, Z-beweging constante snelheid, breid snelheid 5 μm/s, contact tijd 10 s, delay mode constante kracht. Voor elke T-DC paren worden 20 herhalingen van kracht curves verzameld en worden minimaal 14 kracht curves gebruikt voor verdere analyse. - Monteer een nieuwe gereinigde Cantilever, kalibreer deze in zuiver water zoals in stap 1.5.3, en ga terug naar hetzelfde T-DC cellen monster om stap 1,6 en 1,7 te herhalen voor een ander T-DC paar. Sonde ten minste 5 paren voor elke aandoening.
Figuur 2: experimentele configuratie van kracht-probing tussen een enkele T-cel en DC. (A) Schematische tekening van de experimentele configuratie waarbij een T-cel die aan de cantilever is bevestigd, naar een DC wordt gebracht die op het substraat wordt geteeld voor het forceren van de kracht. B) helder-veld beeld van een T-cel-Gefunctionaliseerde Cantilever en een DC. Schaalbalk, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Cantilever functionalisatie met enkele polystyreen kralen
- Enkele kralen voorbereiding
- Verdun de voorraadsuspensie van polystyreen parels van 6 μm in 100% ethanol.
Opmerking: de concentratie van de verdunde kralen oplossing moet laag genoeg zijn, zodat wanneer ze aan een glazen afdek oppervlak worden toegevoegd, afzonderlijke parels goed worden gescheiden zonder significante clustering na oplosmiddel verdamping. - Reinig de glazen afdekplaat met 24 mm diameter met ethanol en verwijder stof door N2 luchtstroom.
- Monteer de gereinigde glazen afdekplaat op een monsterkamer assemblage en zet de montage op de Microscoop.
- Zet een druppel verdunde kralen oplossing aan de linker kant maar dicht bij het midden van de dekslip (Zie Figuur 3) en controleer de afstand tussen de parels na oplosmiddel verdamping in helder-veld onder de microscoop met een 20x doelstelling. Ga verder met de volgende stap als afzonderlijke kralen goed zijn gescheiden.
- Dompel een micropipet punt of een tandenstoker in een goed gemengde epoxy lijm en breng vervolgens een kleine hoeveelheid van deze lijm over naar drie afzonderlijke vlekken met opeenvolgende zachte aanrakingen aan de rechterkant maar dicht bij het midden van de dekslip.
Opmerking: de drie lijmvlekken moeten verticaal worden uitgelijnd (Zie Figuur 3). De laatste plek met de minste hoeveelheid lijm zal later gebruikt worden.
- Verdun de voorraadsuspensie van polystyreen parels van 6 μm in 100% ethanol.
Figuur 3: schematische weergave van de werkstroom voor single-kralen functionalisatie op de Cantilever. Goed gescheiden micron-sized kralen worden aan de linkerzijde van het substraat bereid en een kleine hoeveelheid epoxy lijm wordt overgebracht naar de rechterkant van het substraat door middel van 3 opeenvolgende zachte aanrakingen, resulterend in 3 lijmvlekken. Alleen de laatste plek met de minste hoeveelheid lijm (aangegeven door een cirkel) wordt gebruikt om het uiteinde van de cantilever te kapen. Benaderen van de cantilever in de lijm van links en verplaats de cantilever terug zodra het wordt ondergedompeld in de lijm te beperken van de lijm aan het einde van de Cantilever. Breng de doel kraal onder de cantilever en lijn ze goed uit voordat u een stevig contact maakt (meestal 2-5 nN) voor de hechting van de kraal. Wanneer de kraal met succes is gefunctionaliseerd op de Cantilever, kan een nieuwe Cantilever worden gemonteerd om een nieuwe functionalisatie cyclus te starten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- AFM voorbereiding van de cantilever
- Monteer een gereinigde Tip-less Cantilever aan de AFM-scankop.
- Kalibreer deze Cantilever in de lucht met een schoon oppervlak om de veerconstante te verkrijgen.
- Enkele kralen aan de cantilever bevestigen
- Plaats de cantilever tip over de linker grens van de laatste epoxy lijm vlek zoals weergegeven in Figuur 3.
- Breng de cantilever dicht bij de lijm langzaam door het verlagen van de stappenmotoren met kleine stap maten.
- Trek de cantilever snel weg van de lijm door de AFM-scan hoofd naar achteren (naar links) handmatig te verplaatsen zodra de punt in de lijm is ondergedompeld.
Let op: Zorg ervoor dat slechts een kleine hoeveelheid van de lijm aan het uiteinde van de punt hecht. Als er overmatige lijm op de punt, is het mogelijk om de hoeveelheid lijm te verminderen door aanraken gevolgd door het verschuiven van de tip op een leeg oppervlak. - Beweeg de cantilever Tip bovenop een goed geïsoleerde enkele kraal.
- Benaderen van de cantilever tot de enkele kraal langzaam en maak een stevig contact met de kraal (zoals aangegeven door de verplaatsing van de laserstraal positie in de foto detector overeenkomend met een typische kracht bereik van 2-5 nN) voor ongeveer 10 s gedurende welke een fijnafstelling van de t IP-positionering lateraal zal helpen beter lokaliseren van de kraal aan het einde van de tip. De punt aan het einde van het contact intrekken.
Opmerking: het verdwijnen van de zeer kraal van het oorspronkelijke focal vlak duidt op een geslaagde, aanhandige gebeurtenis. - Demount de kraal-gemodificeerde Cantilever zorgvuldig en bewaar het in een Cantilever Box 's nachts voor volledige stolling van de lijm.
- Fluorescentie beeldvorming van cellulaire respons van macrofaag op een enkele kraal geleverd door de AFM.
Opmerking: fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd op een zelfgemaakte objectieve-type totale interne reflectie fluorescentie Microscoop gebaseerd op een commerciële Microscoop stand. Dit beeldvormings systeem is uitgerust met 4 laserbronnen (405 nm, 488 nm, 561 nm, 647 nm), een splitter-viewer voor tweekleurige detectie en een elektron vermenigvuldigings apparaat (EMCCD) voor groot veld beeld.- Kweek RAW 264.7 cellen op een glazen dekglaasje bij 37 °C in een 5% CO2 bevoficeerde kamer.
- Transfect Moesin-EGFP en plcδ-pH-mcherry naar RAW 264.7 Cells met behulp van een transfectie Kit (Zie tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant om Moesin en phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfaatmoleculen (PIP2) fluorescently te visualiseren Respectievelijk.
Opmerking: Moesin heeft een ITAM-motief dat Syk kan activeren, een belangrijke speler in fagocytose. PIP2 is bekend om Moesin te rekruteren voor het celmembraan. - Leg de glazen afdekplaat met cellen op een monsterkamer assemblage en monteer de montage op de AFM-monster fase.
- Monteer de met kraal gemodificeerde cantilever op de AFM-scankop.
- Voer een krachtcurve uit in een leeg gebied en Kalibreer de kracht met de gevoeligheid van deze curve en de veerconstante die in stap 2.2.2 wordt gemeten.
- Zoek een goed geïsoleerde cel met de juiste fluorescentie intensiteiten in zowel groene (Moesin-EGFP) als rode (PLCδ-PH-mCherry) kanalen met 488/561 nm excitaties.
- Lever de naakte polystyreen kraal van 6 μm met AFM aan het celoppervlak met 1 nN constante kracht en 500 s contacttijd.
- Record fluorescentie beeld reeks van de cel in contact met de kraal voor analyse (meestal 10 frames/s).
Opmerking: om de fotobleking van de fluor Foren te verminderen, moet een relatief lage excitatie kracht worden gebruikt voor het doorzoeken van de cellen van belang. Daarnaast kan een intermitterende excitatie regeling worden gebruikt om de fluorescentie tijd traceringen te verlengen als de dynamiek van celresponsen op een trage tijdschaal is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Fig. 4a toont typische kracht-afstand curves van de bindings interactie tussen één-T cel en single-DC in één benadering-intrekken cyclus. De licht rode curve is de Verleng curve en het donker rode is de terugtrek curve. Aangezien de uitbreidings curve meestal wordt gebruikt voor inspringingen of stijfheid-analyse, is hier alleen de terugtrek curve van kracht voor celadhesie. De minimumwaarde (de groene cirkel) in de curve geeft een maat voor de maximale adhes...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De op de AFM gebaseerde eencellige kracht spectroscopie is geëvolueerd tot een krachtig hulpmiddel om de biofysische eigenschappen van levende cellen aan te pakken. Voor deze toepassingen moet de cantilever correct worden gefunctionaliseerd om specifieke interacties of eigenschappen op de cellen van belang te sonde. Hier worden de methoden voor het koppelen van enkele T-cellen en één-micron-formaat kraal naar de punt-minder-Cantilever respectievelijk beschreven. Om een enkele T-cel aan de cantilever te bevestigen, werd e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) en Innovative Research Group Program (81621002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal | |||
| 10 μl pipettetip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml buis | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter kweekschaal | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well kweekplaat | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tiploze cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatibel lijm | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cel isolatiecocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cellijn | Een geschenk van K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-gecoate magnetische deeltjes | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blokker | STEMCELL | 18731 | |
| Glazen dekglas | lokale verkoper (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm dik |
| Glazen schuifjes | JinTong afdeling laboratorium en apparatuurbeheer, Haimen | N/A | aangepast |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magneet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon zeef | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | gekloond in laboratorium | |
| Mouse CD25 Treg cel positieve isolatiekit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker, Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcel isolatiekit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cel isolatiecocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD? Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selectiecocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicilline-Streptomycine | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyreen microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyreen ronde bodembuis | BD Falcon | 352054 | |
| Rattenserum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Rode bloedcel lyseerbuffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatoire T cel positieve selectiecocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Steekproefkamer | Zelfgemaakt | ||
| Streptavidine-gecoate magnetische deeltjes | STEMCELL | 50001 | |
| Transfectiekit | Clontech | 631318 | |
| Trypsine 0,25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Pincet | JD | N/A | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| 20x objectief NA 0,8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomaire krachtmicroscoop | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescentie beeldvorming | zelfgemaakte objectief-type totale interne reflectie fluorescentiemicroscoop gebaseerd op een Zeiss microscoopstandaard | ||
| Bevochtigde CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Omgekeerde lichtmicroscoop | Zeiss | Observer A1 handmatig |
Referenties
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
