Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Samenvatting

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Samenvatting

In de initiatie stap van eiwit vertaling bindt het ribosoom aan het initiatie gebied van de mRNA. Initiatie van de vertaling kan worden geblokkeerd door binding van een RNA bindend eiwit (RBP) aan de initiatie regio van de mRNA, die interfereert met ribosoom binding. In de gepresenteerde methode gebruiken we dit blokkerende fenomeen om de bindende affiniteit van rbp's te kwantificeren naar hun verwant en niet-verwant binding sites. Om dit te doen, voegen we een test binding site in het initiatie gebied van een reporter mRNA en induceren de uitdrukking van de test RBP. In het geval van RBP-RNA binding, observeerden we een sigmoïdale onderdrukking van de reporter expressie als een functie van RBP-concentratie. In het geval van geen affiniteit of een zeer lage affiniteit tussen de bindingsplaats en de RBP, werd geen significante onderdrukking waargenomen. De methode wordt uitgevoerd in levende bacteriële cellen, en vereist geen dure of verfijnde machines. Het is nuttig voor het kwantificeren en vergelijken van de bindende verwantschap van verschillende Rbp's die functioneel zijn in bacteriën tot een set van ontworpen binding sites. Deze methode kan ongeschikt zijn voor binding sites met een hoge structurele complexiteit. Dit is te wijten aan de mogelijkheid van onderdrukking van de ribosomale initiatie door complexe mRNA-structuur in de afwezigheid van RBP, wat zou resulteren in een lagere basale reporter genexpressie, en dus minder waarneembare reporter onderdrukking bij RBP binding.

Inleiding

RNA binding protein (RBP)-gebaseerde post-transcriptionele regulatie, specifiek karakteriseren van de interactie tussen Rbp's en RNA, is in de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Er zijn meerdere voorbeelden van translationele down-regulatie in bacteriën afkomstig van rbps remming, of rechtstreeks concurreren met, ribosoom binding^1,2,3. Op het gebied van de synthetische biologie, RBP-RNA interacties ontstaan als een belangrijk instrument voor het ontwerp van op transcriptie gebaseerde genetische circuits^4,5. Daa....

Protocol

1. voorbereiding van het systeem

1. Ontwerp van binding-site plasmiden
   1. Ontwerp de binding site cassette zoals afgebeeld in Figuur 1. Elke minigene bevat de volgende delen (5 ' tot 3 '): Eagl restriction site, ∼ 40 basissen van het 5 ' einde van het kanamycine (kan) Verzets gen, pLac-Ara Promoter, ribosoom binding site (RBS), aug van het mcherry gen, een spacer (δ), een RBP binding site, 80 bases van de 5 ' van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkings site.
      Opmerking: Om het succespercentage van de test te verhogen, ontwerpt u drie binding-site cassettes voor elke bindingsplaats, met spa....

Resultaten

De gepresenteerde methode maakt gebruik van de concurrentie tussen een RBP en het ribosoom voor binding aan het mRNA-molecuul (Figuur 1). Deze competitie wordt weerspiegeld door het verminderen van mCherry niveaus als een functie van verhoogde productie van RBP-mCerulean, als gevolg van toenemende concentraties van inductor. In het geval van toenemende mCerulean fluorescentie, zonder significante veranderingen in mCherry, wordt een gebrek aan RBP-binding afge.......

Discussie

De in dit artikel beschreven methode vergemakkelijkt kwantitatieve in vivo meting van RBP-RNA bindingsaffiniteit in E. coli cellen. Het protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van geavanceerde machines, en data-analyse is eenvoudig. Bovendien worden de resultaten onmiddellijk geproduceerd, zonder de relatief lange wachttijd in verband met de volgende generatie sequencing (NGS) resultaten.

Een beperking van deze methode is dat het alleen in bacteriële.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ampicillin natriumzout	SIGMA	A9518
Magnesiumsulfaat (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 platen	Axygen	P-5ML-48-C-S
8-baans platen	Axygen	RESMW8I
96-well platen	Axygen	P-DW-20-C
96-well platen voor platelezer	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Bindingplaatssequenties	Gen9 Inc. en Twist Bioscience		zie Tabel 1
E. coli TOP10 cellen	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
Glycerol	BIO LAB	071205
Incubator	TECAN	liconic incubator
Kanamycin sulfaat	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
Ligase	NEB	B0202S
Robotisch systeem voor vloeistofbehandeling	TECAN	EVO 100, MCA 96-kanaals
Matlab analysesoftware	Mathworks
Multi-pipet 8 banen	Axygen	BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lacton (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS buffer	Biological Industries	020235A
Platelezer	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase	NEB	M0493
RBP sequenties	Addgene	27121 & 40650	zie Tabel 2
Natriumchloride (NaCl)	BIO LAB	190305
SV Gel en PCR Clean-Up Systeem	Promega	A9281
Tryptone	BD	211705