Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Samenvatting

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Samenvatting

In de initiatie stap van eiwit vertaling bindt het ribosoom aan het initiatie gebied van de mRNA. Initiatie van de vertaling kan worden geblokkeerd door binding van een RNA bindend eiwit (RBP) aan de initiatie regio van de mRNA, die interfereert met ribosoom binding. In de gepresenteerde methode gebruiken we dit blokkerende fenomeen om de bindende affiniteit van rbp's te kwantificeren naar hun verwant en niet-verwant binding sites. Om dit te doen, voegen we een test binding site in het initiatie gebied van een reporter mRNA en induceren de uitdrukking van de test RBP. In het geval van RBP-RNA binding, observeerden we een sigmoïdale onderdrukking van de reporter expressie als een functie van RBP-concentratie. In het geval van geen affiniteit of een zeer lage affiniteit tussen de bindingsplaats en de RBP, werd geen significante onderdrukking waargenomen. De methode wordt uitgevoerd in levende bacteriële cellen, en vereist geen dure of verfijnde machines. Het is nuttig voor het kwantificeren en vergelijken van de bindende verwantschap van verschillende Rbp's die functioneel zijn in bacteriën tot een set van ontworpen binding sites. Deze methode kan ongeschikt zijn voor binding sites met een hoge structurele complexiteit. Dit is te wijten aan de mogelijkheid van onderdrukking van de ribosomale initiatie door complexe mRNA-structuur in de afwezigheid van RBP, wat zou resulteren in een lagere basale reporter genexpressie, en dus minder waarneembare reporter onderdrukking bij RBP binding.

Inleiding

RNA binding protein (RBP)-gebaseerde post-transcriptionele regulatie, specifiek karakteriseren van de interactie tussen Rbp's en RNA, is in de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Er zijn meerdere voorbeelden van translationele down-regulatie in bacteriën afkomstig van rbps remming, of rechtstreeks concurreren met, ribosoom binding^1,2,3. Op het gebied van de synthetische biologie, RBP-RNA interacties ontstaan als een belangrijk instrument voor het ontwerp van op transcriptie gebaseerde genetische circuits^4,5. Daarom is er een toename van de vraag naar karakterisering van zulke RBP-RNA-interacties in een cellulaire context.

De meest voorkomende methoden voor het bestuderen van eiwit-RNA-interacties zijn de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)⁶, die beperkt is tot in vitro-instellingen, en verschillende pull-down testen⁷, inclusief de clip methode^8,9 . Hoewel dergelijke methoden de ontdekking van de Novo RNA binding sites mogelijk maken, lijden ze aan nadelen zoals arbeidsintensieve protocollen en dure Deep sequence-reacties en kunnen ze een specifiek antilichaam voor RBP-pull-down vereisen. Vanwege de gevoelige aard van RNA in zijn omgeving, kunnen veel factoren invloed hebben op RBP-RNA-interacties, waarbij het belang van het ondervragen van RBP-RNA-binding in de cellulaire context wordt benadrukt. Zo hebben wij en anderen aanzienlijke verschillen aangetoond tussen de RNA-structuren in vivo en in vitro^10,11.

Op basis van de aanpak van een eerdere studie¹², hebben we onlangs¹⁰ aangetoond dat bij het plaatsen van vooraf ontworpen binding sites voor de capside rbps van de bacteriofagen ga¹³, ms2¹⁴, PP7-¹⁵en qβ¹⁶ in de Vertaal initiatie regio van een reporter mRNA, reporter expressie wordt sterk onderdrukt. We presenteren een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode op basis van dit repressie fenomeen om de affiniteit tussen Rbp's en hun corresponderende RNA bindingsplaatss in vivo te meten.

Protocol

1. voorbereiding van het systeem

1. Ontwerp van binding-site plasmiden
   1. Ontwerp de binding site cassette zoals afgebeeld in Figuur 1. Elke minigene bevat de volgende delen (5 ' tot 3 '): Eagl restriction site, ∼ 40 basissen van het 5 ' einde van het kanamycine (kan) Verzets gen, pLac-Ara Promoter, ribosoom binding site (RBS), aug van het mcherry gen, een spacer (δ), een RBP binding site, 80 bases van de 5 ' van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkings site.
      Opmerking: Om het succespercentage van de test te verhogen, ontwerpt u drie binding-site cassettes voor elke bindingsplaats, met spacers bestaande uit ten minste één, twee en drie basissen. Zie representatieve resultaten sectie voor verdere richtlijnen.
2. Klonen van binding site plasmiden
   1. Bestel de binding-site cassettes als dubbel-streng DNA (dsDNA) minigenes. Elke minigene is ∼ 500 BP Long en bevat een Eagl restrictie plaats en een ApaLI restrictie plaats aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (zie stap 1.1.1).
      Opmerking: In dit experiment werden mini-genen met de helft van het kanamycine gen gelast om de screening op positieve kolonies te vergemakkelijken. Echter, Gibson assembly¹⁷ is hier ook geschikt, in welk geval de binding site kan worden besteld als twee kortere complementaire enkel-streng DNA oligos.
   2. Dubbel-verteren zowel de mini-genen als de doel vector met Eagl-HF en apali door het beperkings protocol¹⁸en de kolom zuiveren¹⁹.
   3. Ligate de verteerde minigenes aan de binding-site backbone met de rest van de mCherry reporter gen, terminator, en een kanamycine resistentie Gene²⁰.
   4. Transformeer de ligatie oplossing in Escherichia coli top10 cellen²¹.
   5. Identificeer positieve transformanten via Sanger-sequencing.
      1. Ontwerp een primer 100 basissen stroomopwaarts naar de regio van belang (Zie tabel 1 voor primer sequenties).
      2. Miniprep een paar bacteriële kolonies²².
      3. Bereid 5 μL van een 5 mM oplossing van de primer en 10 μL van het DNA bij een concentratie van 80 ng/μL.
      4. Stuur de twee oplossing naar een handige faciliteit voor Sanger-sequencing²³.
   6. Bewaar gezuiverde plasmiden bij-20 °C, en bacteriële stammen als glycerol voorraden²⁴, zowel in de 96-well formaat. DNA zal vervolgens worden gebruikt voor de omzetting in E. coli top10 cellen met een van de vier fusie-RBP plasmiden (zie stap 1.3.5).
3. Ontwerp en bouw van het RBP plasmide
   Opmerking: Aminozuur en nucleotide sequenties van de vacht eiwitten die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 2.
   1. Bestel de vereiste RBP-sequentie zonder stop codon als een op maat gemaakte dsDNA-minigene die geen stop codon heeft met beperkings sites aan de uiteinden (Figuur 1).
   2. Kloon de geteste RBP ontbreekt een stop codon onmiddellijk stroomafwaarts van een induceerbaar promotor en stroomopwaarts van een fluorescerende eiwit ontbreekt een start codon (Figuur 1), vergelijkbaar met de stappen 1.2.2-1.2.4. Zorg ervoor dat het RBP plasmide een ander gen met antibioticaresistentie bevat dan de binding-site plasmide.
   3. Identificeer positieve transformanten via Sanger-sequencing, vergelijkbaar met stap 1.2.5 (Zie tabel 1 voor primer-sequenties).
   4. Kies een positieve transformant en maak het chemisch-competent²⁵. Bewaar als glycerol gezuiverde plasmiden bij-20 °C en glycerol voorraden van bacteriële stammen²⁴ bij-80 °c in 96-goed platen.
   5. Transformeer de binding-site plasmiden (uit stap 1.2.6) opgeslagen in 96-put platen in chemisch-competente bacteriële cellen die al een RBP-mCerulean plasmide²¹. Om tijd te besparen, in plaats van het plateren van de cellen op Petri schalen, plaat ze met behulp van een 8-kanaals pipet op 8-Lane platen die Luria-Bertani (lb)²⁶ agar met relevante antibiotica (kan en amp). Kolonies moeten in 16 uur verschijnen.
   6. Selecteer een enkele kolonie voor elke dubbele transformant en groeien 's nachts in LB medium met de relevante antibiotica (kan en amp) en opslaan als glycerol voorraden²⁴ bij-80 °c in 96-goed platen.

2. experiment instellen

Opmerking: Het hier gepresenteerde protocol werd uitgevoerd met behulp van een robotsysteem met vloeistof behandeling in combinatie met een incubator en een plaat lezer. Elke meting werd uitgevoerd voor 24 inductor concentraties, met twee duplicaten voor elke stam + inductor combinatie. Met behulp van dit Robotic Systeem, gegevens voor 16 stammen per dag met 24 inductor concentraties werd verzameld. Als een dergelijk apparaat echter niet beschikbaar is of als er minder experimenten nodig zijn, kunnen deze gemakkelijk met de hand worden gedaan met behulp van een 8-kanaals multi-pipet en het protocol dienovereenkomstig aanpassen. Bijvoorbeeld, voorlopige resultaten voor vier stammen per dag met 12 inductor concentraties en vier tijdpunten werden op deze manier verworven.

1. Bereid, vooraf, 1 L bioassay buffer (BA) door het mengen van 0,5 g Tryptone, 0,3 mL glycerol, 5,8 g NaCl, 50 mL 1 M MgSO₄, 1 ml 10 x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer pH 7,4, en 950 ml dubbel gedestilleerd water (DDW). Het autoclaaf of steriel filter de BA-buffer.
2. Kweek de dubbel-transformant stammen bij 37 °C en 250 rpm schudden in 1,5 mL LB met geschikte antibiotica (kanamycine in een eindconcentratie van 25 μg/mL en ampicilinein een eindconcentratie van 100 μg/mL), in 48-well platen, over een periode van 18 h (overnachting).
3. In de ochtend, maak de volgende voorbereidingen.
   1. Inductor plaat. In een schone 96-wells plaat, bereid putten met semi-arme medium (SPM) bestaande uit 95% BA en 5% LB²⁶ in de incubator bij 37 °c. Het aantal putjes komt overeen met het gewenste aantal inductor concentraties. Voeg C4-HSL toe aan de putjes in de inductor plaat die de hoogste inductor concentratie (218 nM) zal bevatten.
   2. Program meer de robot in een serie verdund medium van elk van de hoogste concentratie putten in 23 lagere concentraties variërend van 0 tot 218 nM. Het volume van elke inductor verdunning moet voldoende zijn voor alle stammen (inclusief duplicaten).
   3. Terwijl de inductor verdunningen worden voorbereid, warme 180 μL SPM in de incubator bij 37 ° c, in 96-well platen.
   4. Verdun de nachtelijke stammen van stap 2,2 met een factor 100 door seriële verdunningen: eerst verdunnen met een factor 10 door 100 μL bacteriën te mengen met 900 μL SPM in 48-well Plates, en vervolgens opnieuw te verdunnen met een factor 10 door 20 μL van de verdunde oplossing in 180 μL voorverwarmde SPM, in 96-put platen geschikt voor fluorescerende metingen.
   5. Voeg de verdunde inductor van de inductor plaat toe aan de 96-put platen met de verdunde stammen volgens de uiteindelijke concentraties.
4. Schud de 96-put-platen bij 37 °C gedurende 6 uur, terwijl de optische dichtheid wordt gemeten bij 595 nm (OD₅₉₅), mcherry (560 Nm/612 nm) en mCerulean (460 nm/510 Nm) fluorescentie via een plaat lezer elke 30 minuten. Voor normalisatie doeleinden, meten van de groei van SMP zonder cellen toegevoegd.

3. voorlopige resultatenanalyse

1. Kies voor elke dag van het experiment een tijdsinterval van logaritmische groei volgens de gemeten groeicurves, tussen de lineaire groeifase en de stationaire (T₀, t_Final). Neem ongeveer 6 − 8 tijdpunten, terwijl de eerste en laatste metingen worden verwijderd om fout te voorkomen die is afgeleid van onnauwkeurigheid van exponentiële groei detectie (Zie Figuur 2a, bovenste paneel).
   Opmerking: Gooi stammen die abnormale groeicurven of stammen vertonen waar de logaritmische groeifase niet kan worden gedetecteerd en herhaal het experiment.
2. Bereken de gemiddelde genormaliseerde fluorescentie van mCerulean en de productiesnelheid van mCherry, van de ruwe gegevens van zowel mCerulean als mCherry fluorescentie voor elke inductor concentratie (Figuur 2a).
   1. Bereken genormaliseerde mCerulean als volgt:
      
      waar Blank (mCerulean) is de mCerulean niveau [a.u.] voor medium alleen, blank (OD) is de optische dichtheid voor medium alleen, en mCerulean en OD zijn de mCerulean fluorescentie en optische dichtheidswaarden, respectievelijk.
   2. Gemiddelde mCerulean over de verschillende tijdspunten (Figuur 2b, bovenste twee panelen) als volgt:
      
      Wanneer #Time punten het aantal gegevens tijdpunten is dat in aanmerking wordt genomen, is T₀ het tijdstip waarop de exponentiële groeifase begint, en t-_finale het tijdstip waarop de exponentiële groeifase eindigt.
   3. Bereken het percentage van de productie van mCherry (Figuur 2b, onderste twee panelen) als volgt:
      
      waar mCherry (t) is het mCherry niveau [a.u.] op tijd t, OD is de waarde van de optische dichtheid, T₀ is de tijd waarop de exponentiële groeifase begint, en t_Final is het moment waarop de exponentiële groeifase eindigt.
3. Plot ten slotte het mCherry-percentage van de productie als een functie van mCerulean, waardoor dosisrespons curven worden gebruikt als een functie van RBP-mCerulean Fusion fluorescentie (figuur 2c). Dergelijke plots vertegenwoordigen de productie van het reporter-gen als een functie van RBP-aanwezigheid in de cel.

4. dosisrespons functie-aanpassings routine en K_RBP -extractie

1. Onder de veronderstelling dat het ribosoom Vertaal cijfer met de RBP-binding constant is, model de mcherry-productiesnelheid als volgt (Zie figuur 2D, groene lijn):
   
   waarbij [x] de genormaliseerde gemiddelde mcerulean fluorescentie is, berekend volgens EQ. 2, mcherry productiesnelheid is de waarde berekend volgens EQ. 3, k_RBP is de relatieve binding affiniteit [a.u.], k niet-_afhankelijk is het ribosoom tarief van vertaling met de RBP ongebonden, n is de cooperativiteit factor, en C is de basis fluorescentie [a.u.]. C, n, K niet-_afhankelijken K_RBP worden gevonden door de gegevens van de mcherry-productiesnelheid aan het model te monteren (EQ. 4).
2. Met behulp van data analysis software, voeren een passende procedure op percelen beeltenis van mCherry productiesnelheid als een functie van gemiddelde mCerulean (stap 3,3), en pak de pasvorm parameters volgens de formule in EQ. 4.
   Opmerking: Alleen passende resultaten met R² > 0,6 worden in aanmerking genomen. Voor die fits, K_RBP fout is meestal in het bereik van 0,5% tot 20% van K_RBP waarden, voor een 0,67 betrouwbaarheidsinterval, terwijl degenen met een hogere K_RBP fout kan ook worden geverifieerd door het oog.
3. Normaliseer K_RBP -waarden door de respectieve maximale waarde van gemiddeld mCerulean voor elke dosis-respons functie.
   
   waarbij K_RBP in [a.u.] de waarde is die wordt geëxtraheerd uit de aanpassingsprocedure in EQ. 4, en Max (gemiddeld mcerulean) is het maximale gemiddelde mcerulean-signaal [a. u] dat is waargenomen voor de huidige stam.
   Opmerking: De normalisatie vergemakkelijkt de juiste vergelijking van het regelgevings effect over stammen door de afhankelijkheid van de specifieke maximale RBP-uitdrukkings niveaus te elimineren.

Resultaten

De gepresenteerde methode maakt gebruik van de concurrentie tussen een RBP en het ribosoom voor binding aan het mRNA-molecuul (Figuur 1). Deze competitie wordt weerspiegeld door het verminderen van mCherry niveaus als een functie van verhoogde productie van RBP-mCerulean, als gevolg van toenemende concentraties van inductor. In het geval van toenemende mCerulean fluorescentie, zonder significante veranderingen in mCherry, wordt een gebrek aan RBP-binding afge...

Discussie

De in dit artikel beschreven methode vergemakkelijkt kwantitatieve in vivo meting van RBP-RNA bindingsaffiniteit in E. coli cellen. Het protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van geavanceerde machines, en data-analyse is eenvoudig. Bovendien worden de resultaten onmiddellijk geproduceerd, zonder de relatief lange wachttijd in verband met de volgende generatie sequencing (NGS) resultaten.

Een beperking van deze methode is dat het alleen in bacteriële...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ampicillin natriumzout	SIGMA	A9518
Magnesiumsulfaat (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 platen	Axygen	P-5ML-48-C-S
8-baans platen	Axygen	RESMW8I
96-well platen	Axygen	P-DW-20-C
96-well platen voor platelezer	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Bindingplaatssequenties	Gen9 Inc. en Twist Bioscience		zie Tabel 1
E. coli TOP10 cellen	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
Glycerol	BIO LAB	071205
Incubator	TECAN	liconic incubator
Kanamycin sulfaat	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
Ligase	NEB	B0202S
Robotisch systeem voor vloeistofbehandeling	TECAN	EVO 100, MCA 96-kanaals
Matlab analysesoftware	Mathworks
Multi-pipet 8 banen	Axygen	BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lacton (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS buffer	Biological Industries	020235A
Platelezer	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase	NEB	M0493
RBP sequenties	Addgene	27121 & 40650	zie Tabel 2
Natriumchloride (NaCl)	BIO LAB	190305
SV Gel en PCR Clean-Up Systeem	Promega	A9281
Tryptone	BD	211705