Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Samenvatting

We presenteren een aanpak om ribosome-gebonden mRNA van vasculaire endotheliale cellen (ECs) direct in muizenhersenen, Long-en hart weefsels te zuiveren via EC-specifieke genetische code van Enhanced Green fluorescentie proteïne (EGFP) in ribosomen in combinatie met RNA-zuivering .

Samenvatting

Veel studies zijn beperkt tot het gebruik van in vitro cellulaire testen en hele weefsels of isoleren van specifieke celtypen van dieren voor in vitro analyse van transcriptome en genexpressie door qPCR en RNA-sequencing. Uitgebreide transcriptome en genexpressie analyse van specifieke celtypen in complexe weefsels en organen zal van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee genen gereguleerd worden en hun associatie met weefselhomeostase en orgaan Functies. In dit artikel, we demonstreren de methodologie voor isolatie van ribosome-gebonden RNA direct in vivo in de vasculaire endothelia van dierlijke longen als voorbeeld. De specifieke materialen en procedures voor weefsel verwerking en RNA-zuivering zullen worden beschreven, met inbegrip van de beoordeling van RNA-kwaliteit en opbrengst, evenals real-time qPCR voor arteriogenic gen-assays. Deze aanpak, bekend als het vertalen van ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek, kan worden gebruikt voor de karakterisering van genexpressie en transcriptome analyse van bepaalde celtypen rechtstreeks in vivo in een specifiek type in complexe weefsels.

Inleiding

In complexe weefsels zoals het brein van zoogdieren, hart en longen, compliceren de hoge niveaus van cellulaire heterogeniteit de analyse van genexpressie gegevens afkomstig van hele weefselmonsters. Om genexpressie profielen in een bepaald celtype in vivo te observeren, is recentelijk een nieuwe methodologie ontwikkeld, die het mogelijk maakt de gehele vertaalde mRNA-aanvulling van elk genetisch gedefinieerd celtype te ondervragen. Deze methodologie staat bekend als de vertaling ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek^1,2. Het is een nuttig hulpmiddel om endotheel celbiologie en angiogenese te bestuderen in combinatie met het genetisch manipuleren van andere angiogenese-geassocieerde genen bij dieren.

We hebben aangetoond dat angiogene PKD-1-signalering en de transcriptie van angiogene Gene CD36 essentieel zijn voor de differentiatie van endotheliale cellen (EC) en functionele angiogenese^3,4,5,6. Om moleculaire mechanismen van angiogene en metabole signalering in gentranscriptie en EG-trans differentiatie te bepalen, hebben we genetisch gemanipuleerde VALMUIZEN gemaakt met specifiek verwijderde angiogene genen op basis van TRAP techniek^{1 , 2}. Bovendien hebben ze in onze valdieren niet alleen PKD-1 of cd36 gen- deficiëntie in de vasculaire endothelia of globale deletie van cd36 gen, maar een versterkt groen fluorescentie proteïne (EGFP) is ook genetisch gelabeld op De door de EG te vertalen ribosomes. TRAP maakt affiniteits zuivering van ribosome-gebonden mRNA rechtstreeks uit de vasculaire endothelia van gerichte weefsels, waardoor de analyse van genexpressie en identificatie van nieuwe transcriptomes die geassocieerd zijn met EG-differentiatie en angiogenese direct onder in vivo condities. We hebben met succes geïsoleerd ribosome-gebonden RNA van de endothelia in deze genetisch gemanipuleerde dieren. Het gezuiverde RNA kan worden gebruikt voor verdere karakterisering van angiogene of arteriogene genen in de regulatie van EG-differentiatie en-functies. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de TRAP-aanpak voor de isolatie van mRNA in ECs rechtstreeks in vivo.

Protocol

Voor dierproeven zijn alle hier beschreven methoden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het medisch college van Wisconsin.

1. reagentia voorbereiden

1. Bereid de lysisbuffer voor op concentraties van 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml Cycloheximide, proteaseremmers en recombinant RNase remmers op concentraties zoals hieronder beschreven.
   1. Voeg de volgende reagentia toe aan 500 mL RNase vrij gedeïoniseerd water: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl₂, 35 mg dtt, 0,5 ml Cycloheximide en NaOH indien nodig tot pH 7,4, EDTA-vrije proteaseremmers (één mini tablet per 10 ml) en RNase remmer (1 0 μL/mL).
   2. Bewaren in een koelkast van 4 °C voor maximaal 1 maand.
2. Bereid een high-Salt polysome reinigings buffer uit op concentraties van 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1% vol/vol CA-630, 0,5 mm DTT en 100 mg/ml Cycloheximide.
   1. Voeg de volgende reagentia toe aan 500 mL RNase-vrij gedeïoniseerd water: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl_2,5 ml nonionisch, niet-denaturerende reinigingsmiddel, 5 van 7,7 mg buizen van DTT, en 0,5 ml Cycloheximide, en NaOH zo nodig tot pH 7,4.
   2. Bewaren in een koelkast van 4 °C voor maximaal 1 maand.
3. BIND anti-GFP-antilichamen tegen proteïne G magnetische kralen voorafgaand aan het starten van het experiment.
   1. Voeg 10 mg anti-GFP-antilichaam toe, verdund in 200 mL PBS tot proteïne G kralen.
   2. Incuberen met een eind rotatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Plaats de parels op een magnetisch rek en verwijder het supernatant.
   4. Onderbreek de parels in 200 mL PBS en bewaar in een koelkast van 4 °C voor maximaal 1 week.
4. Bereid ijskoude PBS met 100 mg/mL Cycloheximide.
   1. Voeg 1 volume haring oplossing (100 mg/ml) toe aan 99 volumes ijskoude PBS.

2. isoleren en lyse gewenste weefsels

1. Euthanize muizen door IP-injectie van ketamine (500 mg/kg/lichaamsgewicht) en xylazine (10 mg/kg/lichaamsgewicht) en Isoleer de gewenste weefsels (d.w.z. hart, longen). Ga onmiddellijk door naar de volgende stap.
2. Plaats de gewenste weefsels in 500 mL ijskoude PBS met 100 mg/mL Cycloheximide.
3. Mince weefsel in een celsuspensie met een Motorgestuurde homogenisator of een Small-Clearance Glass homogenisator. Als u een motor aangedreven homogenisator gebruikt, beperk dan de homogenisatie tot minder dan 1 minuut bij lage frequentie (< 15000 Hz) om RNA-denaturatie te voorkomen.
4. Onderbreek de celpellet in 200 mL lysisbuffer door het pipetteren en opnieuw tekenen van de buffer meerdere malen. Homogeniseer de celsuspensie verder met 10 slagen in een Small-Clearance Glass-homogenisator of gedurende 15 seconden bij lage frequentie (< 15000 Hz) in een motor aangedreven homogenisator.
5. Centrifuge homogeniteert gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °c tot pellet kernen en grote celresten, en houdt het supernatant.
6. Voeg nonionic, niet-denaturerende reinigingsmiddel toe aan 1% vol/vol en DHPC tot 30 mM naar het supernatant. Incuberen op ijs gedurende 5 min.
7. Centrifugeer lysaat gedurende 10 min bij 16.000 x g tot pellet onoplosbaar materiaal. 15% van het heldere lysaat als input voor toekomstige stappen overdragen en bewaren.

3. isoleren ribosome/mRNA complexen

1. Voeg 50 mL antilichaam-gebonden kralen toe aan de supernatant van het cel-lysaat en laat het mengsel bij 4 °C met een eind-over-eind rotatie gedurende 30 minuten inbroed. Dit is waar de anti-GFP antilichamen de GFP-gelabelde ribosomes zullen binden, waardoor we het RNA van deze ribosomen verder kunnen isoleren.
2. Verzamel kralen op een magnetisch rek en was 5 keer met een high-Salt polysome Wash buffer.
   1. Trek vloeistof op en gooi deze weg zodra de parels aan de zijkant van de buis zijn verzameld. Vervolgens Pipetteer en hertrek je 200 mL High-Salt polysome Wash buffer meerdere malen. Herhaal deze stap 5 keer en gooi alle buffer na de laatste herhaling weg. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap.

4. Isoleer mRNA

1. Plaats kralen in RLT buffer. De volgende stappen worden rechtstreeks uit het RNeasy Mini Kit-Protocol genomen en zijn op geen enkele manier uitgebreid.
   Let op: RLT buffer bevat guanidine zouten; NIET mengen met bleekwater.
2. Centrifugeer lysaat gedurende 3 minuten bij volle snelheid 13.000 rpm of 16.000 g bij 4 °C. Verwijder voorzichtig supernatant van 350 mL door pipetteren en breng het over naar een nieuwe microfugebuis buis. Gebruik alleen dit supernatant (lysate) in volgende stappen.
3. Voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe aan de microfugebuis buis.
4. Breng tot 700 mL van het monster, inclusief eventueel precipitaat, over in een spin kolom die in een opvang buisje van 2 mL is geplaatst. Sluit het deksel zachtjes en centrifugeer 15 s bij ≥ 8.000 x g om het spin kolom membraan te wassen. Gooi de doorstroming weg.
5. Voeg 350 mL buffer RW1 toe aan de spin kolom. Sluit het deksel zachtjes en centrifugeer 15 s bij ≥ 8.000 x g om het spin kolom membraan te wassen. Gooi de doorstroom weg en hergebruik de collectie buis in de volgende stap.
   Let op: buffer RW1 bevat guanidine zouten; NIET mengen met bleekwater.
6. Voeg 350 mL buffer RW1 toe aan de spin kolom. Sluit het deksel zachtjes en centrifugeer 15 sec. bij ≥ 8.000 x g. Gooi de doorstroming weg.
7. Voeg 500 mL buffer RPE toe aan de spin kolom. Sluit het deksel zachtjes en centrifugeer 15 s bij ≥ 8.000 x g om het spin kolom membraan te wassen. Gooi de doorstroming weg.
8. Voeg 500 mL buffer RPE toe aan de spin kolom. Sluit het deksel zachtjes en centrifugeer 2 min bij ≥ 8.000 x g om het spin kolom membraan te wassen. Verwijder vervolgens voorzichtig de spin kolom uit de collectie buis, ervoor te zorgen dat de kolom geen contact met de doorstroom.
9. Plaats de spin kolom in een nieuwe 2 mL opvang buis en gooi de oude buis weg met de doorstroom. Sluit het deksel zachtjes en Centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid om de rest buffer te verwijderen.
10. Plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Voeg 30-50 mL RNase-vrij water direct toe aan het spin kolom membraan. Sluit het deksel zachtjes en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij ≥ 8.000 x g om het RNA te elzen.
11. Indien verwachte RNA-opbrengst > 30 mg is, herhaal stap 4,10 met nog eens 30-50 ml RNase-vrij water, of gebruik Elueer uit stap 4,10 (als hoog [RNA] vereist is). Hergebruik Collection Tube uit stap 4,10.
12. Gebruik gezuiverd RNA voor downstreamanalyse, inclusief RNA-sequencing of real-time kwantitatieve PCR of opgeslagen RNA in RNase-vrij H₂O bij-80 °c gedurende maximaal 1 jaar.

Resultaten

Onze eerdere studies^4,7 suggereren dat CD36 kan fungeren als een switch voor arteriolaire differentiatie en capillaire arterialisatie via de LPA/PKD-1 signalering traject. Om te bestuderen of de LPA/PKD-1-CD36-signalerings as essentieel is voor arteriogenese in vivo, hebben we de nieuwe TRAP lijnen vastgesteld die niet alleen een globale CD36-deficiëntie of endotheelspecifieke-CD36-of PKD-1-deficiëntie hebben, maar ook selectieve isolatie mogelijk maken van ribos...

Discussie

Angiogenese is een complex meerstaps proces, waarin EC-specifieke angiogene gentranscriptie en expressie een essentiële rol spelen in EG-differentiatie en angiogene herprogrammering^3,4. Om de barrières van de cellulaire diversiteit en architecturale complexiteit te overwinnen voor een beter begrip van de functie van het zoogdier vasculaire systeem op moleculair niveau in vivo, hebben we EC-specifieke VALMUIZEN gecreëerd, vergezeld van EC-specifieke cd36 ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers	Sarstedt	83.1832
Homogenizers	Fisher Scientific	K8855100020
Magnet (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	Zal afhangen van de zuiveringsschaal; monsters in 1,5-mL buisjes kunnen worden geconcentreerd op een DynaMag-2
Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000C
Gekoelde centrifuge	Eppendorf	5430R	met rotor voor microcentrifugebuisjes van 1,5 mL
RNase-vrije 1,5mL microcentrifugebuisjes	Applied Biosystems	AM12450
RNase-vrije 50-mL conische buisjes	Applied Biosystems	AM12501
RNase-vrije filter tips van 1000-μl	Rainin	RT-1000F
RNase-vrije filter tips van 200-μl	Rainin	RT-200F
RNase-vrije filter tips van 20-μl	Rainin	RT-20F
Rotor voor homogenisatoren	Yamato	LT-400D
Rotator voor buisjes, Labquake merk	Thermo Fisher	13-687-12Q