Methodenartikel

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

DOI:

10.3791/59630

⸱

13 mei 2019

 , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een concurrerende index is een gemeenschappelijke methode die wordt gebruikt om bacteriële conditie en/of virulentie te beoordelen. Het nut van deze aanpak wordt geïllustreerd door haar gemak om uit te voeren en haar vermogen om de geschiktheid van vele stammen te standaardiseren tot een wild-type organisme. De techniek is echter beperkt door beschikbare fenotypische markers en het aantal stammen dat tegelijkertijd kan worden beoordeeld, waardoor een groot aantal replicaatexperimenten nodig is. Gelijktijdig met grote aantallen experimenten zijn de arbeids-en materiaalkosten voor het kwantificeren van bacteriën op basis van fenotypische markers niet onbelangrijk. Om deze negatieve aspecten te overwinnen met behoud van de positieve aspecten, hebben we een moleculaire benadering ontwikkeld om micro-organismen direct te kwantificeren na technische genetische markers op bacteriële chromosomen. Unieke, 25 basepaar DNA-barcodes werden ingebracht op een onschadelijke locus op het chromosoom van wild-type en Mutant stammen van salmonella. In vitro competitie experimenten werden uitgevoerd met behulp van entmateriaal bestaande uit gepoolde stammen. Na de competitie werden de absolute aantallen van elke stam gekwantificeerd met behulp van digitale PCR en werden de concurrerende indices voor elke stam berekend uit die waarden. Uit onze gegevens blijkt dat deze aanpak voor het kwantificeren van salmonella uiterst gevoelig, nauwkeurig en nauwkeurig is voor het opsporen van zowel zeer overvloedige (High fitness) als zeldzame (Low fitness) micro-organismen. Bovendien is deze techniek gemakkelijk aan te passen aan bijna elk organisme met chromosomen dat kan worden gewijzigd, evenals aan verschillende experimentele ontwerpen die absolute kwantificering van micro-organismen vereisen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beoordelen van de geschiktheid en virulentie van pathogene organismen is een fundamenteel aspect van microbiologie onderzoek. Hiermee kunnen vergelijkingen worden gemaakt tussen stammen of tussen gemuleerde organismen, waardoor onderzoekers het belang van bepaalde genen onder specifieke omstandigheden kunnen bepalen. Traditioneel gebruikt virulentie beoordeling een dierlijk model van infectie met verschillende bacteriële stammen en het observeren van de uitkomst van het besmette dier (bijv. infectieuze dosis50, letale dosis50, tijd tot overlijden, ernst van het symptoom, gebrek aan symptomen, enz.). Deze procedure biedt waardevolle beschrijvingen van virulentie, maar het vereist stammen om aanzienlijke verschillen in uitkomsten te veroorzaken om variaties van wild type te detecteren. Bovendien zijn de resultaten semi-kwantitatief, omdat, terwijl ziekteprogressie en symptoom ernst in de loop van de tijd subjectief kunnen worden gekwantificeerd, de interpretatie van virulentie vergeleken met wild-type meer kwalitatief is (d.w.z. meer, minder of even virulent). Een gemeenschappelijk alternatief voor het uitvoeren van dierlijke infectiviteit assays is het genereren van concurrerende indices (CIs), waarden die direct vergelijken fitness of virulentie van een stam aan een wild-type tegenhanger in een gemengde infectie1. Deze techniek heeft tal van voordelen ten opzichte van een traditioneel diermodel van infectie door de virulentie te standaardiseren tot een wild type stam en het bepalen van een kwantificeerbare waarde om de mate van verzwakking weer te geven. Deze techniek kan ook worden aangepast om geninteracties in bacteriën te analyseren door het bepalen van een geannuleerde concurrerende index (COI)2. Het berekenen van een COI voor een groep gemuleerde organismen stelt onderzoekers in staat te bepalen of twee genen zelfstandig bijdragen aan pathogenese of als ze betrokken zijn bij dezelfde virulentie route en afhankelijk van elkaar. Bovendien vereist het berekenen van een CI inventarisatie van bacteriën die waardevolle inzichten kunnen geven in de pathogenese van organismen. CIs en COIs stellen onderzoekers ook in staat om Avirulente stammen te onderzoeken die geen klinische ziekte veroorzaken, maar nog steeds verschillen in geschiktheid. Deze techniek wordt beperkt door het gebruik van traditionele antibioticaresistentie markers om stammen te identificeren, waardoor het aantal ingangs stammen beperken tot slechts één of twee tegelijk. Vanwege deze beperking zijn grote aantallen experimentele groepen en replicaten vereist, die naast het toevoegen aan arbeids-en materiaalkosten ook de mogelijkheden voor variabiliteit in experimentele omstandigheden en onnauwkeurige resultaten vergroot. (Voor een grondige beoordeling van de voordelen en toepassingen van het gebruik van gemengde infecties om virulentie, fitness en geninteracties te bestuderen, zie C.R. Beuzón en D.W. Holden 1)

Er zijn pogingen ondernomen om deze beperking te overwinnen, zoals het gebruik van fluorescently gelabelde cellen gekwantificeerd via flow flowcytometrieonderzoeken3,4,5. Deze techniek kwantificeert cellen met behulp van ofwel 1) gelabelde antilichamen tegen fenotypische markers of 2) endogeen geproduceerde fluorescerende eiwitten. Het gebruik van gelabelde antilichamen heeft een aantoonbaarheidsgrens van 1.000 cellen/mL en vereist daarom een groot aantal cellen om3te analyseren. Cellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken hebben een veranderde fysiologie en zijn vatbaar voor fitness veranderingen als gevolg van hoge eiwit expressie6. Beide methoden worden beperkt door het aantal fluorescerende markers detecteerbaar met behulp van flow cytometrie. Een vooruitgang in moleculaire kwantificatie werd bereikt door de ontwikkeling van een microarray-techniek die verzwakking ontdekte in 120 stammen van een initiële gemengde infectie van meer dan 1.000 stammen in een Murine model7. Deze techniek gebruikt een microarray analyse van RNA van gemuleerde stammen, wat leidde tot een aanzienlijke variabiliteit in de uitkomst.  Niettemin stelde het dat grote groepen van gemengde infecties een nuttig hulpmiddel kunnen zijn en dat met behulp van gevoelige detectietechnieken verschillen in bacteriële virulentie kunnen worden geïdentificeerd. Met de ontwikkeling van de volgende generatie sequencing, breidde TN-SEQ het nut van transposon mutaties uit, wat een krachtige methode mogelijk maakt voor het kwantificeren van bacteriën die willekeurig werden gemuleerd8,9,10, 11. Onlangs is een alternatief protocol ontwikkeld dat de noodzaak van transposons elimineert en in plaats daarvan DNA-barcodes gebruikt om de genomische veranderingen en hun impact op fitness12gemakkelijker te identificeren en bij te houden. Deze technologie is een belangrijke vooruitgang, maar het inbrengen van de genomische barcodes is nog steeds een willekeurig proces. Om de willekeurigheid van eerdere experimenten te overwinnen, ontwikkelde Yoon et al. een methode om het CIs van salmonella stammen te berekenen met behulp van unieke DNA-barcodes die op precieze locaties op de chromosomen van bacteriën13zijn geplaatst. Unieke met stammen werden gedetecteerd met behulp van een qPCR-gebaseerde methode met sybr Green en primers specifiek voor elke unieke barcode. De techniek werd beperkt door de door qPCR opgelegde beperkingen, waaronder verschillen in primer-efficiëntie en lage gevoeligheid, wat blijkt uit de noodzaak van geneste PCR voorafgaand aan qPCR. Niettemin heeft deze benadering aangetoond dat gerichte genomische modificaties kunnen worden benut voor het opsporen en mogelijk kwantificeren van Pools van meerdere bacteriële stammen.

In het volgende protocol beschrijven we een nieuwe methodologie om bacteriële concurrentie experimenten uit te voeren met grote Pools van gemengde entmateriaal, gevolgd door nauwkeurige kwantificering met behulp van een zeer gevoelige digitale PCR-techniek. Het protocol omvat het genetisch labelen van bacteriële stammen met een unieke DNA-Barcode ingevoegd op een onschadelijke regio van het chromosoom. Deze modificatie maakt het mogelijk om stammen snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van moderne moleculaire technologie in plaats van traditionele seriële verdunningen, replica plating, en tellen kolonie vormende eenheden die afhankelijk zijn van fenotypische markers (d.w.z. antibioticaresistentie ). De wijzigingen maken gelijktijdige beoordeling van vele stammen in één gegroepeerd entmateriaal mogelijk, waardoor de mogelijkheid van experimentele variabiliteit aanzienlijk wordt verminderd, omdat alle stammen aan exact dezelfde voorwaarden worden blootgesteld. Bovendien, terwijl deze techniek werd ontwikkeld in salmonella heliobacter Serovar typhimurium, het is zeer aanpasbaar aan een genetisch smeedbaar organisme en bijna elk experimenteel ontwerp waar nauwkeurige bacteriële tellingen zijn vereist, het verstrekken van een nieuwe tool om de nauwkeurigheid en doorvoer in microbiologie laboratoria te verhogen zonder de beperkingen opgelegd door eerdere methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Integreer unieke DNA-barcodes op een plasmide met de nodige componenten voor allelic Exchange

Opmerking: Een nieuw plasmide, genaamd pskap, met een hoog Kopieer nummer en een verhoogde transformatie-efficiëntie in vergelijking met de bestaande pKD13 allel Exchange plasmide werd gecreëerd. Dit wordt beschreven in de stappen 1.1-1.12 (Figuur 1). De gefinaliseerde plasmiden met unieke DNA barcodes en componenten voor allel Exchange zijn beschikbaar via een plasmide repository (tabel van materialen).

  1. Met behulp van een commerciële plasmide miniprep Kit, zuiveren pKD1314 en ppcr script cam SK+ van nachtelijke bacteriële culturen geteeld in Luria-Bertani (lb) Bouillon aangevuld met 50 μg/ml kanamycine of 25 μg/ml chlooramfenicol (voor pKD13 en ppcr script cam SK +, respectievelijk) (tabel 1).
  2. Voer op beide plasmiden met behulp van commerciële beperkings enzymen HindIII en BamHI op basis van de specificaties van de fabrikant restrictie-digestonen uit.
  3. Verwijder restrictie enzymen en het DNA van de pPCR script cam SK+ reactie en reinig de 3.370-base pair (BP) plasmide backbone met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA Cleanup Kit volgens de specificaties van de fabrikant.
  4. Scheid de fragmenten van de pKD13 beperking vertering op een 1% agarose gel met behulp van een elektroforese kamer.
  5. Visualiseer bands met een blauw licht transverlichter en accijns het 1.333 BP fragment uit de gel (figuur 1c).
    Opmerking: Dit fragment bevat de FRT-geflankeerd kanamycine weerstand gen vereist voor chromosomale allel vervanging.
  6. Reinig het uitblinkte DNA uit stap 1,5 met behulp van een commerciële gel-extractie Kit.
  7. Om pSKAP te maken, ligate het gezuiverde fragment van pKD13 (van stap 1,6) in pPCR script cam SK+ (vanaf stap 1,3) met behulp van een commerciële T4 DNA ligase volgens de specificaties van de fabrikant.
  8. Transformeer chemisch competente DH5α cellen met het geligeerd pskap plasmide volgens het Protocol van de fabrikant (tabel 1).
  9. Verspreid transformanten op LB agar platen aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en inincuberen bij 37 °C 's nachts.
  10. Kies een kolonie van de plaat en streep het op een nieuwe LB agar-plaat aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en incuberen bij 37 °C 's nachts. Kies een kolonie van deze plaat en gebruik om te beënten LB Bouillon aangevuld met 50 μg/mL kanamycine. Incuberen de cultuur 's nachts bij 37 ° c met constante opwinding.
  11. Gebruik een commerciële plasmide miniprep Kit om pSKAP te zuiveren van de nachtelijke bacteriële cultuur.
  12. Voer een diagnostische restrictie uit de vertering van het plasmide uit stap 1,11 met behulp van Hind III en BAM HI volgens de specificaties van de fabrikant. Visualiseer fragmenten op een 1% agarose gel zoals in stappen 1.4-1.5.
    Opmerking: De pSKAP totale grootte moet 4.703 BP. fragmenten na stap 1,12 moeten 3.370 en 1.333 BP.
  13. Ontwerp PCR-primers voor insertiongestuurde mutagenese (SDM) (tabel 2 en S1) op zodanige wijze dat een unieke 25-base pair DNA-sequentie wordt ingevoegd op positie 725 van pSKAP (Figuur 2).
    Opmerking: De barcode DNA wordt ingebracht in de plasmide net buiten het FRT-geflankeerd kanamycine weerstand gen, zodat de barcode niet verloren gaat bij latere verwijdering van de kanamycine weerstands cassette. Als u nieuwe barcode sequenties genereert, gebruik dan online tools om ervoor te zorgen dat de fluorescently-gelabelde doelspecifieke PCR-sondes (hierna simpelweg "probes" genoemd) efficiënt aan de nieuwe sequentie zullen binden. In de tabellen 2 en S1vindt u de plaatsings volgorde die tot op heden is ontworpen, samen met de benodigde primers om deze te maken.
  14. Bereid SDM-reacties voor met behulp van een commerciële High-Fidelity DNA-polymerase, de gewenste primer paren (tabel 2) en pSKAP-sjabloon. Stel de Thermocycler in om het volgende uit te voeren: 1) 98 °C voor 30 s, 2) 98 °C voor 10 s, 56 °C gedurende 15 sec., 72 °C gedurende 2 min, 3) Herhaal stap 2, 24 maal, 4) 72 °C gedurende 5 min, 5) vasthouden bij 4 °C.
  15. Na voltooiing van de PCR, afbrekende pSKAP sjabloon door toevoeging van het restrictie enzym DPN I aan de reactie. Inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min.
    Opmerking: Producten van PCR moeten worden gevisualiseerd op een agarose-gel om de grootte en zuiverheid van het product te controleren. Een controle DPN I vertering bestaande uit de ongewijzigde pSKAP template kan worden uitgevoerd en gebruikt in volgende stappen om ervoor te zorgen dat template DNA volledig wordt verteerd.
  16. Gebruik 5 μL van het product uit stap 1,15 om 100 μL commerciële chemisch bevoegde DH5α cellen om te zetten volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  17. Verspreid transformanten op LB agar platen aangevuld met 25 μg/mL chlooramfenicol en incuberen bij 37 °C 's nachts.
  18. Selecteer een kolonie (of kolonies) van de nachtelijke platen en streak op individuele LB agar-platen aangevuld met 25 μg/mL chlooramfenicol en inincuberen bij 37 °C 's nachts. Selecteer een kolonie van 's nachts platen en gebruik om te inoculeren 5 mL LB Bouillon aangevuld met 25 μg/mL chlooramfenicol. Incubate cultuur (s) 's nachts bij 37 °C met constante opwinding.
  19. Gebruik een commerciële plasmide miniprep Kit om plasmiden te zuiveren van de nachtelijke cultuur (en).
  20. Sanger sequentie gezuiverde plasmiden met behulp van de M13 forward sequencing primer (tabel 2). Vergelijk gemuteerde Region met de originele plasmide en beoordeel voor SDM insertionele nauwkeurigheid.
  21. Nadat u de barcode invoeging en nauwkeurigheid hebt bevestigd, wijst u elke barcode en plasmide een naam toe.
    Opmerking: Barcodes gegenereerd tot-datum zijn toegewezen aan een tweeletterige benaming: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, enz. Barcoded plasmiden worden aangeduid als pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, enz.
  22. Herhaal stap 1.14-1.21 om het gewenste aantal DNA-barcodes te genereren.

2. DNA-Barcode introduceren op het chromosoom van S. Typhimurium

Opmerking: Het inbrengen van DNA-barcodes op de S. Tyhimuriumchromosoom wordt bereikt door gebruik te maken van een allel-uitwisselings methode die wordt beschreven door datsenko en wanner14 en die is aangepast voor gebruik in S. Typhimurium.

  1. Bepaal de Locus op de S. Typhimurium genoom waar de DNA-streepjescode moet worden ingevoegd (Figuur 3).
    Opmerking: Selecteer een grote, intergene regio van het chromosoom. Vermijd gebieden die niet-coderen RNA produceren. Deze studie gebruikte een Locus stroomafwaarts van put P tussen residuen 1.213.840 en 1.213.861 (bepaald door genoom assemblage GCA_ 000022165.1). Deze regio is eerder genetisch gemanipuleerd voor de trans-complementatie van genen15. Als alternatief kan een DNA-Barcode worden geïntroduceerd terwijl tegelijkertijd een gen van belang wordt verstoord. Dit protocol vereist minimale wijzigingen en stroomlijnt de Mutante creatie.
  2. Ontwerp PCR-primers om het unieke barcode-en FRT-geflankeerd kanamycineweerstandsgen uit de gewenste pSKAP-barcode met plasmide uit stap 1,21 (tabel 2) te versterken. Voeg 40-nucleotide-extensies toe die homoloog zijn voor de regio die is geselecteerd in stap 2,1 tot en met het 5 ' einde van elke primer (tabel 2).
  3. Voer de versterking uit met behulp van een commerciële High-Fidelity polymerase, de primers uit stap 2,2, en de gewenste pSKAP barcode-bevattende plasmide als sjabloon. Stel de Thermocycler in om het volgende uit te voeren: 1) 98 °C voor 30 s, 2) 98 °C voor 10 s, 3) 56 °C gedurende 15 s, 4) 72 °C voor 60 s, herhaal stappen 2-4 29 keer, 5) 72 °C gedurende 5 min, 6) vasthouden bij 4 °C.
  4. Na voltooiing van de PCR, afbrekende template DNA met behulp van DpnI zoals beschreven in stap 1,15. Reinig en concentreer het DNA met behulp van een commerciële DNA Cleanup Kit volgens de specificaties van de fabrikant.
  5. Raadpleeg het eerder gepubliceerde protocol voor het genereren van mutanten in S. Typhimurium stam 14028s van PCR-producten14,16,17,18.
    Opmerking: Het is niet essentieel dat het kanamycine-resistentie-gen uit het chromosoom wordt weggesneden. Excisie van het gen is echter minimaal storend voor het bacteriële chromosoom, omdat het resulteert in een 129 BP litteken dat potentiële downstream genen in-frame zou achterlaten. Het wordt aanbevolen dat de stam die het kanamycine-resistentie-gen bevat, wordt behouden omdat het kan worden gebruikt om barcodes tussen stammen te verplaatsen via P22-gemedieerde transductie.
  6. Herhaal de stappen 2,3 – 2,5 om de gewenste stammen te maken met de juiste streepjescodes.
    Opmerking: Barcodes kunnen worden geïntroduceerd in wild-type S. Typhimurium dat vervolgens kan worden onderworpen aan verdere genetische manipulatie, of barcodes kunnen worden geïntroduceerd in stammen die eerder genetisch gewijzigd zijn.

3. bacteriële groeiomstandigheden en in vitro wedstrijd testen

  1. Van bacteriën voorraad, streak desired S. Typhimurium stammen die elke haven een unieke DNA barcode op LB agar platen. Incuberen de platen 's nachts bij 37 °C.
  2. Selecteer een enkele kolonie van elke stam en inoculeren 5 mL LB Bouillon. Inincuberen gedurende 20 uur bij 37 °C met constante opwinding.
    Opmerking: Gebruik de nachtelijke cultuur, ga verder naar stap 3,5 om zuivere genomisch DNA (gDNA) te verzamelen van elke bargecodeerde stam. Dit is noodzakelijk voor de daaropvolgende validatie-en controle experimenten in sectie 6.
  3. Breng voor elke wedstrijd test een gelijk volume van elke overnachtings cultuur over in een steriel buisje met gepaste grootte. Meng de stammen grondig door elkaar krachtig voor minstens 5 sec.
    Opmerking: Het volume van elke nachtelijke cultuur om over te dragen moet voldoende zijn voor elke toestand en repliceren, evenals voor het isoleren van gDNA om invoer te kwantificeren. Hoewel het niet geheel noodzakelijk is om de optische dichtheden van culturen te meten, omdat het absolute aantal micro-organismen zal worden gekwantificeerd met behulp van digitale PCR, moet het aantal ingangs bacteriën voor elke stam ongeveer gelijk zijn om knelpunten te voorkomen of de ongelijke concurrentie in het begin van het experiment. Representatieve competitie testen in dit protocol vergeleken groeipercentages van 8 stammen tegelijkertijd. Er kunnen extra of minder stammen nodig zijn voor individuele experimentele ontwerpen.
  4. Breng 100 μL van het gemengde entmateriaal over in 4,9 mL steriele LB Bouillon. Inincuberen bij 37 °C voor de gewenste tijd of op een gewenste optische dichtheid.
  5. Oogst 500 μL van het entmateriaal door centrifugeren bij > 12000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Ga onmiddellijk naar sectie 4 met de cellen.
  6. Verwijder op gewenste tijdstippen 500 μL van de kweek en oogst cellen door centrifugeren bij > 12000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder en gooi supernatant weg.
    Opmerking: Als u aliquots verzamelt op meerdere tijdspunten, Vries dan pellets bij-20 °C of ga onmiddellijk naar stap 4,1 na elke verzameling.

4. het verzamelen en kwantificeren van gDNA van S. Typhimurium (uit de stappen 3,5 en 3,6)

  1. Oogst gDNA uit cellen met behulp van een commerciële gDNA zuiverings pakket. Indien beschikbaar, voer de optionele RNA depletie stap uit.
    Opmerking: RNA-uitputting is niet nodig; de aanwezigheid van RNA zal de DNA-concentratie echter kunstmatig verhogen, wat leidt tot afwijkende berekeningen in de daaropvolgende stappen. Als u een commerciële gDNA-zuiverings pakket gebruikt, volgt u de aanbevelingen van de fabrikant om er zeker van te zijn dat de kolom niet overladen is met DNA. Er is geen minimale DNA-concentratie nodig als het monster in de daaropvolgende stappen kwantificeerbaar is.
  2. Gebruik een spectrofotometer om het DNA in elk monster te kwantificeren.
    Opmerking: DNA kan worden gekwantificeerd met elke betrouwbare methode.
  3. Bereken het gDNA-Kopieer nummer op basis van de bacteriële genoom grootte met behulp van de volgende vergelijking: X is de hoeveelheid DNA in ng en N is de lengte van een dubbel-streng DNA-molecuul (de grootte van het genoom).
    figure-protocol-1
    Opmerking: 660 g/mol wordt gebruikt als de gemiddelde massa van 1 DNA-BP. er kunnen kleine variaties bestaan, afhankelijk van de nucleotide-samenstelling van het organisme. Talrijke rekenmachines zijn online beschikbaar om de berekening uit te voeren.

5. ontwerp primers en voelers voor kwantitatieve detectie van DNA-barcodes via dDigital PCR

  1. Ontwerp primers om de met regio van de Ste versterken. Tyhimuriumchromosoom stroomafwaarts van Putp (figuur 3c en tabel 2).
    Opmerking: Primer en sonde ontwerpen kunnen worden vergemakkelijkt door tal van online programma's (tabel van materialen). Als barcodes allemaal op dezelfde loci worden geplaatst, is een enkele set versterkings primers universeel voor alle barcodes.
  2. Ontwerp 6-carboxyfluorescein (FAM)-gebaseerde en/of hexachlorofluorescein (HEX)-gebaseerde sondes die specifiek zijn voor elke streepjescode (tabel 2 en S1).
    Opmerking: De druppel-lezer die in dit experiment wordt gebruikt, kan zowel fam-als hex-sondes tegelijk in een multiplex reactie detecteren. Ontwerp 1/2 van de sondes om gebruik te maken van FAM en 1/2 om HEX te gebruiken. Dit is geen noodzakelijke stap, maar zal het reagens gebruik en de experimentele kosten verminderen indien geïmplementeerd.
  3. Maak 20x primer-probe Master mixen met 1) 20 mM van elke voorwaartse en omgekeerde versterkings primer, 2) 10 mM van een enkele FAM-sonde, en 3) 10 mM van een enkele HEX-sonde (indien multiplexing).

6. Valideer de gevoeligheid en specificiteit van elke Pprimer-probe-set voor elke genomische streepjescode met digitale PCR-

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van acht unieke barcodes met acht unieke sondes als voorbeeld. Het aantal gebruikte barcodes kan worden verhoogd of verlaagd om verschillende experimentele ontwerpen tegemoet te komen.

  1. Maak een pool van gDNA die elke streepjescode bevat, behalve één. Gebruik deze pool als het verdunningsmiddel om een verdunningsreeks uit te voeren met gDNA die de enige resterende streepjescode bevat (bemonsterings verdunnings schema is beschikbaar in Figuur 4).
    Opmerking: Het gebruik van gepoolde gDNA als verdunningsmiddel zorgt voor een consistente achtergrond terwijl de gevoeligheid wordt nagegaan. Verdun met behulp van de in stap 4,3 bepaalde Kopieer nummers gDNA naar een kopie nummer binnen het aanbevolen digitale PCR-bereik (1-100.000 kopieën per 20 μL-reactie). Houd er rekening mee dat het bereik is ingesteld voor elk uniek doel (streepjescode), niet het totale aantal gDNA.
  2. Bereid reacties voor op digitale PCR in tweevoud volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het gebruik van een digitale PCR Supermix ontworpen voor sonde-gebaseerde chemie. Gebruik de mengsels uit stap 6,1 als template-DNA. Gebruik de 20 x primer-probe Master Mix uit stap 5,3 die de sonde bevat voor de verdunde streepjescode in stap 6,1.
  3. Bereid replicaatcontrolereacties voor op digitale PCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het gebruik van een digitale PCR-Supermix die is ontworpen voor op sonde gebaseerde chemie. Controle reacties voor elke sonde mix moeten bestaan uit 1) geen sjabloon besturingselementen (Ntc's), 2) negatieve controles, en 3) positieve controles.
    Opmerking: Het minimum aantal replicaatcontrolereacties is twee. In dit voorbeeld protocol worden vier Ntc's, zes negatieve besturingselementen en zes positieve besturingselementen voor elke streepjescode gebruikt. Negatieve controles moeten gDNA met elke streepjescode bevatten, behalve de streepjescode die overeenkomt met de test die wordt getest. Dit zal de specificiteit van elke sonde valideren.
  4. Herhaal stap 6.1-6.3 om digitale PCR-reacties te maken voor elk met een barcode gecodeerd gDNA-monster. Een monster plaat opstelling wordt weergegeven in Figuur 5.
    Opmerking: Deze en volgende stappen worden beschreven op basis van een specifiek digitaal PCR-platform dat druppeltjes en flow-gebaseerde technologie gebruikt. Alternatieve digitale PCR-platforms die gebruikmaken van chip-gebaseerde technologie kunnen gemakkelijk worden vervangen door kleine wijzigingen in dit protocol. Stap 6,4 kan meer dan 1 96-goed plaat nodig hebben om alle primer sets te valideren. In tegenstelling tot qPCR kunnen afzonderlijke platen geanalyseerd met digitale PCR gemakkelijk worden vergeleken zonder de noodzaak van gestandaardiseerde referentie putten tussen platen.
  5. Genereer druppels voor elke reactie aandoening met behulp van een druppel Generator volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Breng nieuw gecreëerde druppels over in de juiste 96-goed plaat. Gebruik pipetpunten van 200 μL op een multikanaalspipet van 5-50 μL.
    Opmerking: Pipetteer druppeltjes, langzaam en soepel pipetten! De fabrikant van de digitale PCR-apparatuur raadt aan om alleen pipetten en pipetpunten van een bepaalde fabrikant (bijv. Ranin) te gebruiken. Deze pipetpunten hebben een soepele opening zonder microscopische kunststof fragmenten die druppels kunnen vernietigen of de microfluïdica van de druppel lezer beschadigen. Talrijke merken van tips werden onderzocht en waargenomen om een spectrum van productiekwaliteit. Gelijkwaardige resultaten zijn behaald met behulp van alternatieven voor pipetpunt; echter, voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het afwijken van de aanbevelingen van de fabrikant.
  7. Nadat alle druppels zijn gegenereerd en overgebracht, verzegelen de plaat met een folie plaat sealer.
  8. Gebruik de door de fabrikant aanbevolen Thermocycler om de volgende fiets condities uit te voeren: 1) 94 °C gedurende 10 min; 2) 94 °C gedurende 1 minuut, helling snelheid ingesteld op 1 °C/s; 3) 55 °C gedurende 2 minuten, helling snelheid ingesteld op 1 °C/s; 4) Herhaal stappen 2 en 3 49 keer; 5) 98 °C gedurende 10 min; 6) Houd bij 4 °C tot 24 uur vast.
    Opmerking: Thermische overdracht in een druppel reactie is niet hetzelfde als de standaard PCR. Reactieomstandigheden kunnen wijziging vereisen.
  9. Terwijl thermocyclen wordt uitgevoerd, programmeer de data-analyse software met de plaat instellingsinformatie zoals monster naam, experiment type (absolute kwantificering), Supermix gebruikt, target 1 naam (fam barcode naam), target 1 type (NTC, positieve controle, negatieve controle, of onbekend), Target 2 naam (HEX barcode naam), Target 2 type (blanco, positieve controle, negatieve controle, of onbekend). De informatie over de laatste plaat installatie wordt weergegeven in Figuur 5.
  10. Nadat thermocyclen is voltooid, zet u de voltooide reacties over op de druppel lezer en start u het leesproces volgens de instructies van de fabrikant.

7. Kwantificeer het aantal bacteriën in een competitieve index-experiment

  1. GDNA geïsoleerd en gekwantificeerd uit punt 4 verdunnen tot een passende concentratie zoals hierboven beschreven.
  2. Bereid reacties voor op digitale PCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het gebruik van de juiste Supermix. Gebruik DNA uit stap 7,1 als sjabloon. Gebruik een 20 x primer-probe Master mix met de sonde (of sondes bij het opsporen van zowel FAM als HEX) voor mogelijke barcodes die aanwezig zijn in het experiment.
  3. Bereid extra digitale PCR-reacties voor zoals in stap 7,2 met behulp van verschillende 20x primer-probe Master mixen totdat alle barcodes gebruikt in het experimentele ontwerp kunnen worden gedetecteerd.
  4. Inclusief besturingselementen voor elke voorwaarde, zoals beschreven in 6,3. Dit omvat 1) geen sjabloon besturingselementen (Ntc's), 2) negatieve besturingselementen en 3) positieve controles.
  5. Ga verder met het protocol zoals beschreven in stappen 6.5-6.10.

8. Analyseer digitale PCR-gegevens en bereken de absolute Kopieer nummers

  1. Wanneer alle putjes zijn gelezen en de uitvoering is voltooid, opent u het. QLP-gegevensbestand met behulp van de gegevensanalyse software.
    Opmerking: De hier beschreven bestandstypen en gegevensanalyse procedures zijn specifiek voor één digitale PCR-fabrikant. Bij gebruik van alternatieve digitale PCR-platformen zullen bestandstypen en gegevensanalyse procedures specifiek zijn voor het gebruikte platform en moeten worden uitgevoerd volgens de aanbevolen specificaties van de fabrikant.
  2. Selecteer alle putten die gebruikmaken van dezelfde primer-probe Master Mix.
  3. Op de drup pels tab, onderzoek het aantal druppels geanalyseerd in elk goed (zowel positieve als negatieve druppels). Uitsluiten van analyse elke goed dat heeft minder dan 10.000 totale druppels.
  4. Ga naar het tabblad 1d amplitude en Bekijk de amplitudes van positieve en negatieve druppels. Zorg ervoor dat ze bestaan uit twee verschillende populaties.
  5. Gebruik binnen de software de drempel functie om een cutoff te maken tussen positieve en negatieve druppels voor elke sonde die werd gebruikt (Figuur 6).
    Opmerking: Alle putjes die dezelfde primer-probe Master Mix uit stap 5,3 gebruiken, moeten dezelfde drempels hebben.
  6. Zodra passende drempels zijn toegepast op alle putten, zal de software het aantal DNA-kopieën in elke reactie berekenen. Exporteer gegevens naar een spreadsheet om verdere analyse mogelijk te maken.
    Opmerking: De gegevensanalyse software gebruikt het aantal positieve en negatieve druppels die geschikt zijn voor een Poisson-verdeling om het kopie nummer te bepalen.
  7. Bereken met behulp van de waarden uit stap 8,6 het aanvankelijke kopie nummer van elke unieke genomische streepjescode in het voorbeeld. Bepaal het gemiddelde vals-positieve percentage van de negatieve controle reacties en trek deze waarde af van de waarden die zijn verkregen in experimentele reacties. Vermenigvuldig de waarden zo nodig op basis van de verdunningen die zijn uitgevoerd bij het instellen van elk experiment (tabel 3).

9. Bepaal de relatieve geschiktheid van een organisme door de CI of COI te berekenen op basis van digitale PCR-gebaseerde kwantificering van Bargecodeerde stammen

  1. Bereken de CI van een barcode stam met behulp van de volgende formules, waarbij: eenoutput is de absolute kwantificering van de met stam op een bepaald tijdpunt, WToutput is de absolute kwantificering van met wild-type bacteriën in dezelfde tijdpunt, eeninput is de absolute kwantificering van het ingangs entmateriaal van de gebarcodeerde stam, WT-ingang is de absolute kwantificering van het input-entmateriaal van bargecodeerde wilde bacteriën, X-uitgang is de som van alle stammen op hetzelfde tijdspunt, X-ingang is de som van het totale ingangs entmateriaal van alle bargecodeerde stammen.

figure-protocol-2
figure-protocol-3
Opmerking: Zie de discussie voor voordelen, nadelen en het meest geschikte gebruik van elke formule.

  1. Herhaal stap 9,1 voor elke gebarcodeerde stam op alle tijdpunten.
  2. Indien van toepassing, bereken de coi met behulp van de volgende formules: eenuitvoer is de absolute kwantificering van een met stam met gemuleerd gen a op een bepaald tijdpunt, ABoutput is de absolute kwantificering van een met stam met gemuleerde genen a en B op hetzelfde tijdpunt, is eeninput de absolute kwantificering van het ingangs entmateriaal van de bargecodeerde stam met gemuleerd gen a, AB-input is de absolute kwantificering van het entmateriaal van de input van een barcode stam met gemuleerde genen a en b, is b-uitgang de absolute kwantificering van een met stam met gemuleerd gen b op een bepaald tijdpunt, en b-input is de absolute kwantificering van de input entmateriaal van de gebarcodeerde stam met gemuleerd gen B.

figure-protocol-4
Of
figure-protocol-5

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van deze methodologie vereist dat er passende controle reacties worden uitgevoerd om de gevoeligheid en specificiteit van elke sonde die wordt gebruikt om het doel-DNA te identificeren, te valideren. In dit representatieve experiment hebben we acht unieke DNA-barcodes gevalideerd met de acht bijbehorende sondes voor identificatie. Alle acht sondes hadden een laag percentage valse positieven in zowel NTC-als negatieve controle Reacties (tabel 3), waarbij hun sp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om micro-organismen nauwkeurig te kwantificeren is van het allergrootste belang voor microbiologie onderzoek, en het vermogen om unieke stammen van een eerste gemengde populatie te inventariseren is een waardevol instrument gebleken voor het beoordelen van de eigenschappen van fitness en virulentie in Bacteriën. De technieken om dit te verwezenlijken zijn echter niet in tempo gevorderd met de moderne ontwikkelingen in de moleculaire biologie. De technologie om de chromosomen van vele bacteriën gemakkelijk aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het onderzoeksfonds George F. Haddix president en het National Institute of General Medical Science van de National Institutes of Health (NIH) onder het awardnummer GM103427. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf22600028Verkrijgbaar bij elke fabrikant
16 mL kweekbuisjesMidSci8599Verkrijgbaar bij elke fabrikant
5-200 μL pipettentipsRAININ30389241Gebruik alternatieve pipettentips met de nodige voorzichtigheid op basis van de fabricagekwaliteit
5-50 μL multikanaals pipetRAININ17013804Gebruik alternatieve multikanaals pipetten met de nodige voorzichtigheid
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Verkrijgbaar bij elke fabrikant
BLAST AnalysisNCBIN/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler met 96-Deep Well Reactie ModuleBio Rad1851197ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
Chemisch competente DH5αInvitrogen18258012Verkrijgbaar bij elke fabrikant of zelf bereiden
ChloramfenicolThermoFisher ScientificBP904-100Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Cytation5 Microplate readerBioTekCYT5MFVerkrijgbaar bij elke fabrikant, gebruik elk systeem dat DNA nauwkeurig kan kwantificeren
Data Analysis Software (QuantaSoft en QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadN/AddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
ddPCR 96-Well PlatesBio Rad12001925ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
ddPCR Droplet Reader OlieBio Rad1863004ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)Bio Rad1863024ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
DG8 Cartridges voor QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1864008ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
DG8 Gaskets voor QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1863009ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
Droplet Generation Olie voor ProbesBio Rad1863005ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
KanamycineThermoFisher ScientificBP906-5Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Luria-Bertani agarThermoFisher ScientificBP1425-2Verkrijgbaar bij elke fabrikant of zelf maken uit agar, tryptone, gistextract en NaCl
Luria-Bertani bouillonThermoFisher ScientificBP1426-2Verkrijgbaar bij elke fabrikant of zelf maken uit tryptone, gistextract en NaCl
PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaarBio Rad1814040ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
PCR TubesEppendorf951010022Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Petri schotelsThermoFisher ScientificFB0875712Verkrijgbaar bij elke fabrikant
pPCR Script Cam SK+Stratagene/Agilent211192Niet meer commercieel verkrijgbaar
Primer/Probe DesignIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP en pSKAP_BarcodesAddgenePlasmid nummers 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
QX200 Droplet GeneratorBio Rad1864002ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
QX200 Droplet ReaderBio Rad1864003ddPCR benodigdheden moeten worden verkregen bij Bio Rad. Alternatieven zijn nog niet beschikbaar.
Salmonella typhimurium stam ATCC 14028sATCCATCC 14028swww.atcc.org
Take3 Micro-Volume PlateBioTekTAKE3Verkrijgbaar bij elke fabrikant, gebruik elk systeem dat DNA nauwkeurig kan kwantificeren
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher ScientificFERFD1704Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific GeneJet Gel Extractie en DNA Cleanup Micro KitThermoFisher ScientificFERK0832Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific GeneJet Miniprep KitThermoFisher ScientificFERK0503Verkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF534LVerkrijgbaar bij elke fabrikant
Thermo Scientific T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificFEREL0011Verkrijgbaar bij elke fabrikant
ThermocyclerBio Rad1861096Verkrijgbaar bij elke fabrikant
UVP Visi-Blue TransilluminatorThermoFisher ScientificUV95043301Of andere transilluminator die visualisatie van DNA mogelijk maakt
Water, Moleculaire Biologie GradeThermoFisher ScientificBP28191Verkrijgbaar bij elke fabrikant

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303(2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767(2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308(2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Salmonella fitnessbacteri le kwantificeringDNA streepjescodesstamcompetitiegenetische markersdroplet readerdata analyse

Gerelateerde artikelen