Methodenartikel

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

DOI:

10.3791/59635

⸱

9 augustus 2019

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genregulatie speelt een belangrijke rol in alle cellen. Transcriptionele, post-transcriptionele (of RNA processing), translationele en post-translationele stappen worden gebruikt om specifieke genen te reguleren. Sequentie-specifieke nucleïnezuur-bindende eiwitten targeten specifieke sequenties om ruimtelijke of temporele genexpressie te beheersen. De binding sites in nucleïnezuren worden meestal gekenmerkt door mutationele analyse. Echter, talrijke eiwitten van belang hebben geen bekende binding site voor dergelijke karakterisering. Hier beschrijven we een aanpak om eerder onbekende binding sites te identificeren voor RNA-bindende eiwitten. Het gaat om iteratieve selectie en versterking van sequenties beginnend met een gerandomiseerde sequentie pool. Na een aantal rondes van deze stappen-transcriptie, binding en amplificatie-worden de verrijkte sequenties geordend om een voorkeurs binding site (s) te identificeren. Succes van deze aanpak wordt bewaakt met behulp van in vitro bindende assays. Vervolgens kunnen in vitro en in vivo Functionele assays worden gebruikt om de biologische relevantie van de geselecteerde sequenties te beoordelen. Deze aanpak maakt identificatie en karakterisering mogelijk van een eerder onbekende binding site (s) voor elk RNA-bindend eiwit waarvoor een test voor het scheiden van proteïne-gebonden en niet-afhankelijke Rna's bestaat.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In celbiologie speelt genregulatie een centrale rol. Bij een of meerdere stappen langs het genexpressie traject hebben genen het potentieel om gereguleerd te worden. Deze stappen omvatten transcriptie (initiatie, rek en beëindiging), evenals splicing, polyadenylering of 3 ' end Formation, RNA export, mRNA vertaling, en verval/lokalisatie van primaire transcripten. Op deze stappen moduleren nucleïnezuur-bindende eiwitten genregulatie. Identificatie van bindende plaatsen voor dergelijke eiwitten is een belangrijk aspect van het bestuderen van gencontrole. De vergelijking van mutational analyse en fylogenetische sequentie is gebruikt om regelgevings sequenties of eiwit bindende locaties in nucleïnezuren te ontdekken, zoals promotors, Splice sites, polyadenylatie elementen en translationele signalen1, 2 , 3 , 4.

Pre-mRNA splicing is een integrale stap tijdens genexpressie en regulatie. Het merendeel van de zoogdier genen, ook bij mensen, heeft introns. Een groot deel van deze Transcripten is ook gesplitst, waardoor meerdere mRNA-en proteïne-isovormen uit hetzelfde gen of primaire transcript worden geproduceerd. Deze isovormen hebben celspecifieke en ontwikkelings rollen in de celbiologie. De 5 ' splice site, de tak-Point, en de polypyrimidine-Tract/3 ' splice site zijn kritische splicing signalen die onderworpen zijn aan regulering. In negatieve regulatie wordt een anderszins sterke Splice site onderdrukt, terwijl in positieve regulatie een anderszins zwakke Splice site wordt geactiveerd. Een combinatie van deze gebeurtenissen produceert een overvloed aan functioneel verschillende isoforms. RNA-bindende eiwitten spelen belangrijke rollen in deze alternatieve splicing-gebeurtenissen.

Er zijn talrijke eiwitten bekend waarvan de bindende plaats (en) of RNA-doelen nog steeds worden geïdentificeerd op5,6. Het koppelen van regelgevende eiwitten aan hun downstream biologische doelen of sequenties is vaak een complex proces. Voor dergelijke eiwitten is identificatie van hun doel RNA of bindingsplaats een belangrijke stap in het bepalen van hun biologische functies. Zodra een binding site is geïdentificeerd, kan deze verder worden gekarakteriseerd met behulp van standaard moleculaire en biochemische analyses.

De hier beschreven aanpak heeft twee voordelen. Ten eerste kan het een eerder onbekende binding site identificeren voor een eiwit van belang. Ten tweede, een bijkomend voordeel van deze aanpak is dat het tegelijkertijd verzadiging mutagenese toestaat, die anders arbeidsintensief zou zijn om vergelijkbare informatie te verkrijgen over de sequentie vereisten binnen de binding site. Zo biedt het een sneller, gemakkelijker en minder kostbaar hulpmiddel om eiwit bindende sites in RNA te identificeren. Oorspronkelijk werd deze aanpak (Selex of systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) gebruikt om de bindingsplaats te karakteriseren voor de bacteriofaag T4 DNA polymerase (Gene 43 Protein), die overlapt met de ribosoom binding site in zijn eigen mRNA. De binding site bevat een 8-base lus reeks, die 65.536 gerandomiseerde varianten voor analyse7vertegenwoordigt. Ten tweede werd de benadering ook onafhankelijk gebruikt om aan te tonen dat specifieke bindingsplaatsen of aptamers voor verschillende kleurstoffen kunnen worden geselecteerd uit een pool van ongeveer 1013 sequenties8. In feite is deze aanpak in veel verschillende contexten algemeen gebruikt om aptamers (RNA-of DNA-sequenties) te identificeren voor het binden van talrijke liganden, zoals eiwitten, kleine moleculen en cellen, en voor katalyse9. Als voorbeeld kan een aptamer discrimineren tussen twee xanthinederivaten, cafeïne en theofylline, die verschillen door de aanwezigheid van één methylgroep in cafeïne10. We hebben deze aanpak uitgebreid gebruikt (SELEX of iteratieve selectie-amplificatie) om te bestuderen hoe RNA-bindende eiwitten functioneren in splicing of splicing Regulation11, die de basis zal zijn voor de discussie hieronder.

De Random Library: we gebruikten een willekeurige bibliotheek van 31 nucleotiden. De lengte overweging voor de Random Library was losjes gebaseerd op het idee dat de algemene splicing factor U2AF65 bindt aan een sequentie tussen de vertakkingspunt sequentie en de 3 ' splice site. Gemiddeld is de afstand tussen deze splicing signalen in figuur in het bereik van 20 tot 40 nucleotiden. Een ander eiwit geslacht-dodelijk was bekend om te binden aan een slecht gekarakteriseerde regelgevings sequentie in de buurt van de 3 ' splice site van zijn doelwit Pre-mRNA, transformator. Zo kozen we voor een willekeurige regio van 31 nucleotiden, geflankeerd door primer bindingsplaatsen met restrictie-enzym locaties om PCR-versterking en bevestiging van de T7 RNA polymerase Promoter voor in vitro transcriptie mogelijk te maken. De theoretische bibliotheek grootte of complexiteit bedroeg 431 of ongeveer 1018. We gebruikten een kleine fractie van deze bibliotheek om onze willekeurige RNA-pool voor te bereiden (~ 1012-1015) voor de hieronder beschreven experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: afbeelding 1 biedt een overzicht van de belangrijkste stappen in het iteratief selectie-amplificatie proces (Selex).

1. genereren van een willekeurige bibliotheeksjabloon

  1. Synthetiseren van de voorwaartse primer 5 '- GtaatacgactcactatagGGtgatcagattctgatcca-3 ' en de omgekeerde primer 5 '-GcgacGgatccaagcttca-3 ' door chemische synthese op een DNA-synthesizer.
    Opmerking: de primers en de willekeurige bibliotheek kunnen commercieel worden gesynthetiseerd.
  2. Synthetiseren van een willekeurige bibliotheek oligonucleotide sjabloon 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' door chemische synthese. Gebruik een equimolaire mengsel van vier fosforamidites tijdens de synthese voor de 31 gerandomiseerde posities zoals hierboven weergegeven als N.
    Opmerking: de volgorde van de bibliotheeksjabloon bevat 31 willekeurige nucleotiden (N1 tot N31) en flankerende sequenties voor de binding van de voorwaartse en omgekeerde primers. De voorwaartse primer omvat de T7 RNA polymerase Promoter sequentie (onderstreept) voor in vitro transcriptie en een beperkings site Bcl1 (cursief) voor klonen. De omgekeerde primer bevat restrictie-enzym sites BamH1 en hindiii (cursief) om het klonen te vergemakkelijken.

2. generatie van de DNA Random Library pool

  1. Bevestig de T7 RNA polymerase promotor aan de bibliotheek door de polymerase kettingreactie (PCR) met 1 μM DNA Random Library template, 1 μM van elke primer, 20 mM tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mm kcl, 0,1 μg/μL geacetseerd runderserum albumine, 2 eenheden van Taq < /C1 > polymerase, en 200 μM elk van Dntp's (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deoxycytidine en deoxythymidine trifosfaat).
  2. Gebruik vijf cycli denaturatie, gloeien en verleng stappen (94 °C gedurende 1 minuut, 53 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 minuut) van PCR, gevolgd door één uitbreidings cyclus (72 °C gedurende 10 min).

3. synthese van pool 0 RNA

  1. Een 100 μL transcriptie reactie instellen12. Mix T7 transcriptie buffer, 1 μM Random Library pool DNA, 5 mm dithiotreïtol (DTT), 2 mm calciumguanosine trifosfaat (GTP), 1 mm elk van adenosinetrifosfaat (ATP), cytosinetrifosfaat trifosfaat (CTP) en Uridine trifosfaat (UTP), en 2 eenheden/μL T7 RNA polymerase.
    Opmerking: RNA kan in vitro worden getranscribeerd met behulp van commercieel verkrijgbare kits met een optie van de T7 of SP6 RNA polymerase.
  2. Inbroed het bovenstaande reactiemengsel in een micro centrifugebuis voor 2 uur bij 37 °C.
  3. Gel zuivert RNA in een 10% denaturerende polyacrylamidegel.
  4. Identificeer de locatie van de transcripten op de gel door deze te kleuring met methyleenblauw of autoradiografie door het opnemen van sporen van radioactiviteit (0,5 μL of minder van α-32P UTP) in de transcriptie reactie.
    1. Plaats de gelslice in een centrifugebuis en breek in kleinere stukjes, bijvoorbeeld met een homogenisator tip. Voeg de proteïnase K (PK) buffer (100 mm tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, 12,5 mm EDTA, 1% natriumdodecylsulfaat) toe om de gelstukken onder te dompelen. Laat de buis op een nutator van 2 uur tot 's nachts bij kamertemperatuur.
  5. Spin in een High-Speed microcentrifuge (14.000 rpm of 16.873 x g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het gelpuin te verwijderen en de bufferoplossing te herstellen.
  6. Vortex het monster twee keer met een gelijk volume fenol-chloroform en één keer met chloroform.
  7. Meng de waterige fase van bovenaf met een tiende volume Natriumacetaat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA of 20 μg glycogeen en ethanol (2 – 3 volumes, opgeslagen bij-20 °C). Laat de buisjes bij-80 °C gedurende 1 uur.
  8. Draai de buisjes met de oplossing gedurende 5 – 10 minuten bij 4 °C in een micro centrifuge (14.000 rpm of 16.873 x g). Gooi het supernatant voorzichtig weg. Spoel de RNA pellet met 70% ethanol en spin voor 2 – 5 min. Aspirate ethanol zorgvuldig. Lucht drogen de RNA-pellet.
  9. Solubiliseer de RNA-pellet in 50 μL water behandeld met diethyl pyrocarbonaat (DEPC). Laat het monster bij-20 °C voor opslag.
    Opmerking: Reinig het RNA met behulp van commercieel beschikbare spin kolommen, die momenteel vaker worden gebruikt om de radioactiviteit van het rechtsmiddel te verwijderen en dienen als een snel en handiger alternatief voor RNA-zuivering.
    Let op: gebruik een acryl glas schild, handschoenen en andere voorzorgsmaatregelen ter bescherming tegen radioactiviteit.

4. eiwit bindende reactie en scheiding van gebonden RNA

  1. De binding van eiwitten en RNA in 10 mM tris-HCl, pH 7,5 in een volume van 100 μL door toevoeging van de volgende ingrediënten aan deze eindconcentraties: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL boviene serumalbumine, 0,5 eenheden/μL Rnasine, 0,15 μg/μL tRNA , 1 mM EDTA en 30 μL geschikte recombinant-eiwitconcentratie (PTB). Voeg RNA toe vanuit de juiste pool.
    Opmerking: de splicing factor U2AF65 bindt meestal aan de polyyrimidine-Tract/3 ' splice sites van model intron met een binding affiniteit (evenwichts dissociatieconstante of Kd) van ongeveer 1 – 10 nm. Daarom, de eerste twee rondes van binding gebruikte eiwitconcentratie 10-voudige boven de Kd voor U2AF65; voor SXL-en PTB-eiwitten was de start concentratie in dit bereik alleen onze beste schatting. Dit zorgde ervoor dat de gewenste RNA-soorten die konden binden, hoewel lagere affiniteit reeksen ook mogelijk gebonden. In rondes 3 en 4 (transcriptie, binding en amplificatie) werd de eiwitconcentratie drieledig verlaagd (stap 4,1). Dit werd gedaan om achtereenvolgens elimineren lage affiniteit RNA soorten.
  2. Plaats de buisjes met de bindende reacties ongeveer 30 minuten bij 25 °C in een temperatuur blok (of op ijs).
  3. Fractioneren het gebonden RNA van het ongebonden RNA voor de eerste 4 ronden selectie-amplificatie met behulp van de volgende stappen.
    1. Filtreer het monster (100 μL) bij kamertemperatuur via een nitrocellulose filter dat aan een vacuüm spruitstuk is bevestigd.
      Opmerking: het RNA-eiwit complex, maar niet het ongebonden RNA, blijft op het filter staan.
    2. Hak het filter met ingehouden RNA in fragmenten met een steriel scheermesje; plaats deze in een centrifugebuis. Herstel RNA door de buis zachtjes te tuimelen gedurende minimaal 3 uur (of 's nachts) met filter stukken ondergedompeld in de proteïnase K (PK) buffer.
    3. Deproteiniseer het RNA-monster door het te vortexeren in de aanwezigheid van een gelijk volume fenol-chloroform (1:1) en vervolgens van chloroform. Herstel de waterige fase elke keer door het monster bij hoge snelheid gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren.
    4. Meng het met Natriumacetaat (0,1 volume van 3,0 M, pH 5,2) en ethanol (2 – 3 volumes van absolute ethanol, 200 proof). Laat de buis 30 minuten in een vriezer van a-80 °C, centrifugeer deze op hoge snelheid gedurende 10 minuten, en na de was-en droog stappen (stap 3,8), solubiliseer het RNA in water behandeld met DEPC. Deze stappen worden hierboven beschreven (stappen 3,6 tot en met 3,9).
  4. Scheid de proteïne-gebonden RNA-fracties van de ongebonden fracties voor de laatste 2 rondes (rondes 5 en 6; transcriptie, binding en amplificatie) als volgt. Verminder de eiwitconcentratie in de bindings reactie (stap 4,1) door verder driemaal te selecteren voor extra selectiedruk om hoge-affiniteits bindings sequenties te verrijken en bij voorkeur lage-affiniteits sequenties te verwijderen.
    1. Vooraf gegoten een inheemse polyacrylamidegel (5% met 60:1 acrylamide: bis-acrylamide ratio) in 0,5 x TBE buffer (tris-borate-EDTA) voorafgaand aan het instellen van de bovenstaande RNA: eiwit bindende (stap 4,1) reactie. Elektroforese deze gel in een koude kamer (4 °C) door toepassing van 250 V gedurende 15 min.
    2. Pipetteer de bovenstaande RNA: eiwitbinding Reacties (stap 4,1) in verschillende putjes van deze gel.
      Opmerking: het eiwit wordt opgeslagen bij-80 °c en verdund vóór gebruik in 20 mm 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonzuur (Hepes), pH 8,0, 20% glycerol, 0,2 mm ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,05% NP-40 en 1 mm dithiotreïtol (DTT). Toevoeging van 0,5 – 1,0 mM proteaseremmer fenylmethaan sulfonyl-fluoride (PMSF) is facultatief. In de bindende reactie, deze buffer draagt ongeveer 6% glycerol, waardoor direct laden van monsters in de putten zonder de noodzaak om ze te mengen met een aparte gel-loading buffer.
    3. Fractioneren het gebonden RNA van het ongebonden RNA met behulp van gel elektroforese in een koude kamer (4 °C) bij 250 V voor 1 tot 2 h. Dit proces wordt ook wel gel Mobility Shift assay genoemd.
      Opmerking: de duur van de elektroforese varieert afhankelijk van de kenmerken van het RNA en het eiwit dat wordt gebruikt voor de binding.
    4. Stel de gel bloot aan een röntgenfilm en Identificeer de locatie van het gebonden RNA met behulp van autoradiografie. Knip de gelslice met het gebonden RNA en steek het in een buisje.
    5. Inbroed de geplette gel in de PK buffer die gebruikt wordt voor elutie gedurende 3 uur of 's nachts.
    6. Herhaal de stappen 3,5 tot en met 3,9 die hierboven worden beschreven. Kort, Vortex het eluteerde RNA monster krachtig eerst met fenol-chloroform en vervolgens met chloroform.
    7. Meng natriumacetaat en ethanol met de waterige fase na chloroform extractie. Na incubatie in-80 °C vriezer, spin bij 4 °C gedurende 5 – 10 minuten om de RNA-pellet te verzamelen. Was de RNA-pellet met ethanol en lucht drogen door het deksel van de buis open te laten. Los het RNA op in water dat behandeld wordt met DEPC.
      Opmerking: overschakelen naar de gel Mobility Shift-test voor fractionering maakt eliminatie mogelijk van ongewenste RNA-soorten die eventueel zijn verrijkt voor binding, bijvoorbeeld aan de nitrocellulose filter hier (of een matrix) die in de initiële rondes voor fractionering wordt gebruikt.

5. omgekeerde transcriptie en PCR-versterking

  1. Synthetiseer cDNA van het opgeloste RNA met behulp van reverse transcriptase en de omgekeerde primer door de 20 μL-reactie (2 μL van 10x RT-buffer, 2 μL AMV reverse transcriptase, 1 μM omgekeerde primer, 10 μL RNA, RNase-remmer optioneel) bij 42 °C gedurende 60 min te bebroed.
  2. Versterk de cDNA met 20 – 25 PCR-cycli zoals beschreven in stap 2,1.

6. transcriptie en eiwitbinding

  1. Herhaal het proces van RNA-synthese, eiwitbinding, scheiding van eiwit gebonden en ongebonden Fractie, zoals beschreven in sectie 3 – 5 hierboven.

7. analyse van RNA-eiwit interacties

  1. Gebruik de gel Mobility Shift assay (stap 4,4) of de filter bindings test (stap 4,3) om de bindingsaffiniteit en specificiteit te bepalen voor geselecteerde Pools of individuele sequenties binnen elke pool (zie stap 8,3).
  2. Gebruik autoradiografie of een fosfor Imager om banden in de afhankelijke breuk en de ongebonden fractie te detecteren en te kwantificeren.

8. klonen en sequentiëren

  1. Verwerk het uiteindelijke PCR-DNA-product met beperkings enzymen Bcl1 en HindIII voor 1 – 2 h, ligaat met de naar behoren verteerde pGEM3 of andere plasmiden die de beperkings plaatsen vervoeren van 2 uur tot 's nachts, Transformeer het ligatie product in bekwame bacteriële cellen door hitteschok of elektroporation met behulp van standaard moleculaire biologie procedures13.
  2. Kweek bacteriën 's nachts door de getransformeerde cellen op agarplaten met Luria-Bertani (LB) medium en ampicillaire (50 μg/mL) bij 37 °C te bekleden. Kies kolonies om kweek buizen met LB vloeibaar medium met ampicilineen te kweken en te groeien bij 37 °C in een schud incubator 's nachts. Reinig plasmide Dna's met DNA-inserts met behulp van een standaard plasmide isolatie protocol13.
    Opmerking: commerciële kits zijn beschikbaar voor plasmide zuivering.
  3. Sequentie van de plasmiden met DNA-inserts met behulp van de dideoxy keten beëindiging sequencing protocol, volg de instructies van de fabrikant voor sequencing14.
    Opmerking: Sequentiëren kan in eigen huis worden uitgevoerd of commercieel worden uitgevoerd.

9. sequentie uitlijning

  1. Uitlijnen van sequenties en verkrijgen van een consensus binding site (s) met behulp van beschikbare online uitlijning tools
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende opmerkingen tonen succesvolle selectie-amplificatie (SELEX). Eerst analyseerden we pool 0 en de geselecteerde sequenties voor binding aan het eiwit dat wordt gebruikt voor de iteratieve selectie-amplificatie benadering. Figuur 2 toont aan dat het zoogdier polypyrimidine-tractus bindende proteïne (PTB) nauwelijks detecteerbare binding aan de pool 0-sequentie vertoont, maar een hoge affiniteit voor de geselecteerde sequentie groep. Er was nauwelijks...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleïnezuur-bindende eiwitten zijn belangrijke regulatoren voor de ontwikkeling van dieren en planten. Een belangrijke eis voor de SELEX-procedure is de ontwikkeling van een test die kan worden gebruikt om eiwit afhankelijke en ongebonden RNA-fracties te scheiden. In principe kan deze test een in vitro bindende assay zijn, zoals de filter bindings test, de gel Mobility Shift assay of een matrix binding assay19 voor recombinant-eiwitten, gezuiverde eiwitten of eiwitcomplexen. De test kan ook een e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur verklaart dat hij geen concurrerende financiële belangen heeft.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur dankt de National Institutes of Health voor de financiering uit het verleden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gel Electrophoresis equipmentStandardStandard
Glass PlatesStandardStandard
NitrocelluloseMilliporeHAWP
NitrocelluloseSchleicher & SchuellPROTRAN
polyacrylamide gel solutionsStandardStandard
Proteinase KNEBP8107S
Recombinant PTBLaboratory PreparationNiet van toepassing
Reverse TranscriptaseNEBM0277S
Vacuum manifoldFisher ScientificXX1002500Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifoldMilliporeXX27025521225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray filmsStandardStandard

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
  3. Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
  4. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  5. Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
  6. Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  9. Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
  10. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  11. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  12. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
  16. Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
  17. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
  18. Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
  19. Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
  20. Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
  21. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).
  22. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  23. Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667(2013).
  24. Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201(2014).
  25. Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004(2010).
  26. Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  27. Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223(2015).
  28. Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verkenning van de sequentieruimteidentificatie van de bindingsplaatsgerandomiseerde sequentiepoolselectie amplificatiefilterbindingsassaygel mobiliteitsverschuivingeiwit RNA bindingtranscriptie translatiefunctionele assays

Gerelateerde artikelen