Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59664

⸱

7 juni 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Samenvatting

We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo's sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna's te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna's worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo's elektroporated met Mrna's die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.

Inleiding

Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen4,5,6te bestuderen, 7. Er bestaan echter ook verschillende experimentele beperkingen met DNA-elektroporation8. DNA-elektroporation introduceert bijvoorbeeld vaak zeer variabele aantallen expressie vectoren per cel en vervolgens de Mrna's en eiwitten die ze coderen. Deze variabiliteit kan leiden tot een aanzienlijke celcellige heterogeniteit die zowel beeldanalyse als gegevens interpretatie van9,10compliceert. Bovendien beginnen eiwitten van DNA-elektroporation slechts ~ 3 h post-elektroporation en bereiken ze niet de maximale efficiëntie in het aantal cellen en de intensiteit van de fluorescentie tot 12 uur, waarschijnlijk als gevolg van de tijd die nodig is om over te brengen in de Nucleus en volledige zowel transcriptie als vertaling in vivo11.

MRNA transfectie is daarentegen effectief gebruikt in een verscheidenheid van modelsystemen, waaronder Xenopus laevis oocyten door Microinjection12,13, herprogrammatie menselijke stamcellen door mRNA lipofectamine transfectie14 , en elektroporerende recalcitrante neurale stamcellen bij volwassen muizen15. We testten het vermogen van mRNA electroporatie om cellen efficiënt te labelen tijdens de vroege aviaire embryonale ontwikkeling met behulp van in vitro gesynthetiseerde mrna's die verschillende fluorescerende eiwitten (fps) coderen. Voor onze studies gebruikten we de pCS2 + vector, een multifunctionele expressie vector die vaak wordt gebruikt voor het uitdrukken van eiwitten in Xenopus en zebravis embryo's. De SP6 en T7-RNA-polymerase bevorderaar in de pCS2 + staan de synthese toe van mRNA en eiwitten uit elk gekloond gen bij gebruik in een in vitro transcriptie/vertaalsysteem.

Hier tonen we aan dat mRNA electroporatie een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (fps) in gastrulerende kwartel embryo's mogelijk maakt. We ontwierpen en genereerden veel van de expressie vectoren die in deze studies werden gebruikt. Zo hebben we de LifeAct-eGFP Gene16 in de pCS2 + Vector17 gesubgekloond om uit te drukken van de promotor en de SP6 Promoter van CMV. Het ingebrachte gen ligt stroomafwaarts van de SP6 promoter en stroomopwaarts van de SV40 poly (A) tail18. In embryo's co-elektroporated met mRNA en DNA, FPs gecodeerd uit in vitro getranscribeerd Mrna's werden voor het eerst gedetecteerd binnen 20 min van electroporation, terwijl FPs van DNA-expressie vectoren werden gedetecteerd pas na 3 h. meervoudige mRNAs-codering voor nucleaire, Golgi en membraan proteïnen kunnen gelijktijdig in een embryo worden geëvacueerd, wat resulteert in een snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in individuele cellen. Ten slotte, met behulp van een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) Assay, tonen we aan dat een meerderheid van de electroporated mRNAs verval binnen 2 h. Dus, snelle initiële eiwitproductie in combinatie met een beperkte nieuwe eiwit vertaling maakt mRNA elektroporation een waardevolle techniek wanneer temporele beheersing van de uitdrukking noodzakelijk is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van het Children's Hospital Los Angeles en de comités voor institutionele Dierenzorg en-gebruik van de Universiteit van Zuid-Californië.

1. generatie pCS2-gebaseerde expressie vectoren

  1. Om pCS2. Lifeact-eGFP te klonen, bereidt u de vector ruggengraat voor door 2 μg pCS2. CycB1-GFP (een constructie met een ander wisselplaat) te verteren met BamHI (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte digestie buffer (zie tabel met materialen) verdund tot 1x in een totale reactie volume van 50 μL voor 1 uur bij 37 °C (Zie Figuur 1 voor de schematische weergave van de kloon procedure).
    1. Defosforylaat de vrije 3 ' OH-uiteinden van de vector ruggengraat van de restrictie-enzym reactie door toevoeging van garnalen alkalische fosfatase (1 U). Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.
    2. Voer het hele mengsel uit in een 1% agarose gel/1x tris acetaat EDTA (TAE) buffer bij 90 V voor ~ 50 min en beits de gel vervolgens in een 0,5 μg/mL oplossing van ethidiumbromide bromide in 1x TAE buffer voor 15 min met zachte schommeling. Zorg er ook voor dat u moleculair gewicht markeringen in een vrije rijstrook laadt om de DNA-groottes te bepalen.
    3. Gebruik een DNA veilige UV-Transilluminator om te voorkomen dat de Dna's worden geknipt, knip de vector backbone (verwachte band grootte van 4kb) snel uit de agarose-gel en Isoleer het DNA-fragment van het gelstuk met behulp van een gel-zuiverings pakket met behulp van de instructies van de fabrikant.
  2. Gelijktijdig met stap 1,1 bereidt u de wisselplaat voor door 2 μg pEGFP-N1-Lifeact te verteren met BglII (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte verterings buffer, verdund tot 1x in een totaal reactievolume van 50 μL voor 1 uur bij 37 °C. Voer het hele mengsel uit in een gel van 1% agarose om de 800 BP-band te isoleren zoals eerder uitgelegd in stap 1.1.2-1.1.3.
  3. Na zowel de vector als de insert worden gezuiverd en gekwantificeerd op de spectrofotometer, combineren 50 ng van de vector en 38 ng van de insert (1:3 molaire verhouding van vector om in te voegen) in T4 DNA ligase buffer voorafgaand aan het toevoegen van T4 DNA ligase om de ligatie reactie te katalyseren. Daarnaast stelt u een besturingselement geen DNA in, alleen een vector besturingselement en een besturingselement alleen invoegen. Inincuberen alle reacties op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    1. Transformeer 1 μL van het ligatie mengsel (en) in de bevoegde E. coli DH10. Ook, transformeren water alleen negatieve controle en 20 PG van pUC19 positieve controle. Verdeel bacteriën op de Luria Bouillon (lb) agar-platen met 50 μg/ml ampicilinein en incubeer 's nachts bij 37 °c.
    2. Tel de volgende ochtend de kolonies op elke plaat.
      Opmerking: Idealiter zijn er geen kolonies op de negatieve controle platen, > 100 kolonies op de vector + insert ligatie platen, en minder kolonies op de vector plaat.
    3. Kies ten minste 8 bacterie kolonies uit de agar-plaat, getransformeerd met het ligatie mengsel vector + insert, en beënt ze met steriele tandenstokers of pipetpunten in 2 mL vloeibare LB bouillon met 50 μg/mL Ampicilineen.
    4. Extraheer DNA uit elk van de klonen met behulp van commerciële plasmide miniprep Kits.
    5. Voer een diagnostische beperkings samenvatting uit met 500 ng van het DNA van elke kloon met NotI (10 U) en BamHI (10 U) in de juiste digestie buffer, verdund tot 1x voor 1 uur bij 37 °C en voer het verteerde DNA uit op een 1% agarose-gel in 1x TAE-buffer. Verwachte band grootten voor pCS2. Lifeact-eGFP positieve klonen zijn 3,9 KB en 978 BP.
    6. Transformeer 1 pg-100 ng van het DNA van de positieve kloon in de competente E. coli DH10 en bereid 3-4 miniprep reacties voor zoals beschreven in voorgaande stappen om een voldoende hoeveelheid DNA te verkrijgen voor in vitro transcriptie reactie (minimaal 10 μg).

2. bereiding van mRNA door in vitro transcriptie

  1. Linearize 10 μg pCS2. LifeAct-eGFP op het 3 ' uiteinde van de wisselplaat met NotI (10 U) in een geschikte digestie buffer verdund tot 1x in een totaal reactievolume van 50 μL bij 37 °C 's nachts.
    Opmerking: Om RNase verontreiniging te voorkomen en mRNA afbraak te verminderen, Draag handschoenen tijdens het hanteren van mRNA monsters.
  2. Reinig het DNA met een mengsel van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, v/v).
    1. Voeg 150 μL RNase-vrij water toe om het totale volume van de digestie reactie gelijk te stellen aan 200 μL. Voeg vervolgens 200 μL fenol: chloroform: isoamyl alcohol en Vortex het mengsel voor 20 s.
    2. Centrifugeer in een microfugebuis bij maximale snelheid (18.400 x g) gedurende 2 min. Verwijder voorzichtig de bovenste waterige fase die het gelineariseerde DNA bevat. Herhaal deze stap om extra onzuiverheden te verwijderen en wees voorzichtig om het witte precipitaat dat tussen de onderste en bovenste vloeistof fasen kan vormen, niet te verstoren.
  3. Precipitaat gelineariseerd DNA door toevoeging van 1/10 volume 3M Natriumacetaat (RNase-vrij) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Laat het mengsel bij-20 °C gedurende > 30 minuten en pellet het DNA door centrifugeren bij maximale snelheid (18.400 x g).
    1. Was de DNA pellet met 70% ethanol, dan lucht-droog de pellet voor > 5 min.
    2. Los de DNA-pellet op in 5 μL RNase-vrij water. Kwantificeer het DNA door spectrofotometer.
      Opmerking: De verwachte DNA-concentratie is ~ 0,5-1 μg/μL met een A260/A280 ratio tussen 1,7-2,0.
  4. Gebruik 1 μg gelineariseerde pCS2. lifeact-EGFP DNA voor in vitro transcriptie (IVT). Volg de instructies van de fabrikant in de commerciële Kit (zie tabel van de materialen) met 10 μL van het GLB analoog (eindconcentratie 0,8 mM) en Ntp's (eindconcentratie 1 mM voor ATP, CTP en TTP; 0,2 mM voor GTP), 2 μL 10x reactiebuffer (eindconcentratie 1x), 2 μL SP6 RNA polymerase en RNase-vrij water tot 20 μL.
    1. Inbroed het IVT-mengsel gedurende ongeveer 2 uur of langer, afhankelijk van de transcriptie grootte.
      Opmerking: 2 uur incubatie werkt goed voor een transcriptie van 3 KB, maar de nachtelijke incubatie werkt beter voor transcripten die groter zijn dan 5 KB.
    2. Om vrije nucleotiden uit de transcriptie reactie te verwijderen, Voeg 30 μL LiCl RNA precipitatie oplossing (7,5 M lithiumchloride, 50 mM EDTA) toe om de mRNA te precipderen. Vortex het mengsel kort en bewaren bij-20 °C gedurende 30 min. Draai de mRNA 15 min in een microfugebuis bij maximale snelheid (18.400 x g) en spoel met 70% ethanol (RNase-vrij).
  5. Los de gesynthetiseerde mRNA op in 15 μL RNase-vrij water. Breng de gesynthetiseerde mRNA op 5 μL/buis (3 tubes in totaal) en plaats bij-80 °C voor langdurige opslag. Quantitaat de mRNA met een spectrofotometer.
    Opmerking: Verwachte opbrengst is 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) is voldoende voor een experiment met ~ 10 embryo's, ervan uitgaande dat de mRNA wordt verdund van 1 μg/μL tot 500 ng/μL en dat elk embryo wordt geïnjecteerd met ~ 200 nL. Elke buis moet daarom bevatten voldoende mRNA voor ~ 5 experimenten.
  6. Voer ~ 300 ng van mRNA op een 1% agarose gel in 1x TAE buffer na het reinigen van alle gelapparatuur met de RNase decontaminatie oplossing (bijv. RNase) en zorg ervoor dat de mRNA als één band wordt weergegeven (er kunnen meerdere bands aanwezig zijn als er secundaire structuren vormen) en dat er geen uitstrijkje pperen in de gel Lane, die RNA degradatie aangeeft.

3. bereiding van mRNA Electroporation mix

  1. Het ontdooien en verdunnen van mRNA bij de gewenste concentratie (250-500 ng/μL in RNase-vrij water werkt goed voor alle Mrna's die in dit werk zijn getest). Voeg 1/10 volume gekleurde kleurstof toe (zie tabel met materialen, RNAse-vrij, 0,1% eindconcentratie) om de mRNA-injectieplaats te visualiseren en de elektroden correct te plaatsen.
    Opmerking:     als DNA en RNA worden gecombineerd om een co-elektroporation uit te voeren, zorg er dan voor dat DNA vrij is van verontreiniging van de Rnasen door gebruik te maken van fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie voorafgaand aan mRNA en DNA-mengsel.
    1. Zorg ervoor dat u een negatieve controle voor te bereiden met behulp van een mock (geen RNA toegevoegd) electroporatie oplossing. Indien mogelijk, bereid een positieve controle met behulp van vooraf gevalideerde mRNA (mRNA die is aangetoond dat FP met succes in eerdere experimenten te produceren).
      Opmerking: De negatieve controle is essentieel voor alle beeldvormings experimenten om achtergrond fluorescentie niveaus vast te stellen voor het normaliseren van gegevens. De positieve controle is vooral belangrijk bij het werken met nieuw getranscribeerd mRNA door te helpen bevestigen dat de elektroporation instellingen werkten.
  2. Bewaar de mRNA-elektroporation oplossing op een ijsslurry om afbraak te voorkomen tot het klaar is om door te gaan met elektroporation.

4. elektroporate Mrna's in levende kwartel embryo's

  1. Verzamel dagelijks vers gelegde, bevruchte kwarteleitjes en bewaar deze gedurende maximaal 1 week bij 13 °C in een bevoficeerde koelkast. Inbroed de kwarteleitjes op 38 °c tot de gewenste embryonale ontwikkelingsstadia19,20,21.
    Opmerking: HH3 tot HH5 werden in deze studie gebruikt voor zowel statische als dynamische beeldvorming. Voor HH3 embryo's, waardoor de eieren bij kamertemperatuur voor 2 uur voorafgaand aan de oogst het isolatie proces veel gemakkelijker maakt, omdat de embryo's in het algemeen beter bestand zijn tegen fysieke manipulaties wanneer ze worden afgekoeld.
  2. De embryo's isoleren en bereiden volgens het EG-cultuur systeem22. Verzamel ten minste 5 embryo's per aandoening, waaronder ten minste één om te dienen als een negatieve controle (niet elektroporated).
    1. Breek en giet het ei zachtjes in een 10 cm Petri schaaltje. Verwijder de meerderheid van het dikke albumine met een pipet voor overdracht en verwijder het resterende dikke albumine rond het embryo door het oppervlak van de dooier zachtjes af te vegen met een weefsel doekje om ervoor te zorgen dat het embryo strak aan de papier ring blijft kleven.
    2. Leg voorgesneden filtreerpapier (Zie tabel met materialen) op het embryo en gebruik een schaar om de omtrek van het embryo soepel te snijden.
    3. Gebruik een Pasteur-pipet om het embryo te onderdoen met PBS, met behulp van zachte stromen om elke dooier die aan het embryo vasthoudt, te verlaten.
      Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang bij het werken met jongere (< HH3) embryo's omdat deze embryo's de neiging hebben om meer aan de dooier te hechten en zullen vaak los van het vitelline membraan tijdens volgende wasstappen.
    4. Trek de embryo/papier ring langzaam omhoog en uit de dooier in een Petri schaaltje gevuld met PBS voor verdere reiniging. Nadat de meeste dooier is verwijderd, plaatst u de embryo ventrale kant op een 35 mm Petri schaaltje bedekt met een semi-massief mengsel van agar/albumen.
  3. Bereid zes tot 8 10 cm lange glazen micro capillairen (O.D. = 1,2 mm) door gebruik te maken van een glazen micropipet-trekker-instrument.
  4. Plaats de embryo ventrale zijde omhoog in de elektroporation kamer gevuld met PBS. Injecteer met behulp van een glas microcapillair een bolus van 200 nl van de mRNA-of DNA/mRNA-electroporatie mix in de holte tussen het epiblast-en vitelline-membraan dat de gewenste regio beslaat.
    Opmerking: Het hele voorste gebied voor pellucida en sommige gebied voor opaca werd elektroporated in de meeste van de experimenten die in dit manuscript worden getoond.
  5. Plaats de positieve en negatieve elektroden (platina Platte vierkante elektrode, zijlengte van 5 mm) aan de boven-en onderkant van het embryo respectievelijk en elektroporaat met behulp van de volgende pulssequentie: vijf vierkante elektrische pulsen van 5 V, 50 MS duur met 100 MS intervallen met behulp van een in vivo electroporator. Zorg ervoor dat de afstand tussen de elektroden ~ 5 mm is.
    Opmerking: Het optimaliseren van de elektroporation parameters is cruciaal om aandoeningen te vermijden die de fragiele embryonale cellen kunnen doden. Parameters van spanning, pulslengte, pulsintervallen, en het aantal pulsen voor DNA en mRNA moeten worden overwogen voor verschillende elektroporation apparaten.
  6. Incuberen de elektroporated embryo's bij 38 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase.
    Opmerking: Een fluorescerende stereoscoop (zie tabel met materialen) helpt om getransffecteerd te worden met niet-getransfuneerde embryo's.
  7. Als de embryo's statisch worden afgebeeld, repareer deze dan in 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of gedurende een nacht bij 4 °C.
    1. Verwijder de embryo's uit de vitelline membraan door soepel te snijden rond de omtrek van het filtreerpapier met een schaar en afbladderen van het glanzende membraan op het rugoppervlak met scherpe Tang zachtjes.
    2. Was de vaste embryo's in PBS/Triton (0,1%) 2x gedurende 5 min en ga verder met in-situ hybridisatie of immunokleuring indien gewenst.
    3. Ten slotte, beits het embryo in 0,5 μg/μL DAPI in PBS/Triton (0,1%) minimaal 30 min bij kamertemperatuur. Was embryo's in PBS/Triton 2x gedurende 5 minuten en wis het embryo in SCALE-U2-oplossing23 's nachts.
  8. Om de efficiëntie van elektroporation te analyseren (Zie Figuur 2), gebruikt u de binaire en particle Analysetool en het DAPI-kanaal op imagej om nucleaire contouren van alle cellen in de afbeelding te verkrijgen.
    1. Als u het binaire hulpprogramma op ImageJ wilt gebruiken, gebruikt u één z-segment in het DAPI-kanaal met een meerderheid van de cellen en klikt u op proces ≫ binaire ≫ binair maken. Als u nabijgelegen cellen wilt scheiden, klikt u op proces ≫ binaire ≫ waterscheiding. U celconto uren verkrijgen door te klikken op analyseren ≫ deeltjes analyseren, grootte ingesteld op 100-500 (μm2).
    2. Zorg ervoor dat een meerderheid van de cellen wordt beschreven in het DAPI-kanaal en sla de celconto uren op door te klikken op meer ≫ opslaan in het pop-upvenster ROI Manager.
    3. Gebruik deze contouren voor het verkrijgen van fluorescentie intensiteitswaarden voor het mRNA en DNA-kanaal door het eerder opgeslagen bestand te openen op een enkele z-slice in het mRNA-of DNA-kanaal en klik vervolgens op meten op de ROI Manager.
    4. Filter tot slot deze intensiteitswaarden, Tel cellen met < 6000 fluorescentie intensiteit als niet-getransffecteerd en cellen met > 6000 fluorescentie intensiteit als getransffecteerd.

5. beeld FPs gecodeerd door Electroporated mRNAs

  1. Kies het gezondste en beste elektroporated embryo voor de dynamische beeldvormings experimenten na het bekijken van alle elektroporated embryo's onder de fluorescerende ontleden stereoscoop.
    1. De andere elektroporated embryo's en het niet-electroporated embryo (de negatieve controle) blijven incueren in een afzonderlijke incubator, terwijl het gekozen embryo wordt gebeeld wanneer dit embryo sterft tijdens het experiment.
  2. Voor de dynamische beeldvorming, gebruikt u de hele-Mount ex OVO aviaire embryo cultuur zoals eerder beschreven24,25,26 met een omgekeerde confocale Microscoop.
    Opmerking:     de Microscoop is uitgerust met een opstage incubator (Zie tabel met materialen) die tijdens beeldvorming de temperatuur bij 36 °c handhaaft. Tijdens de opstelling van de Microscoop werd geconstateerd dat embryo's die op 36 °C werden geïnineerd, langer overleefde dan bij hogere temperaturen, mogelijk omdat de laser lokale verwarming op het embryo kan veroorzaken. De lezers moeten de optimale incubatietemperatuur op het podium bepalen voor hun eigen Microscoop opstelling.
    1. Om de embryogenese dynamisch te kunnen afbeelten en visualiseren, reinig het elektroporated embryo kort met PBS om eventuele bubbels die zich tijdens het elektroporatie proces aan de rugzijde van het embryo kunnen vormen, te verwijderen door het embryo te verplaatsen met behulp van een tang in een PBS clean Oplossing.
    2. Plaats het schone embryo rechtstreeks op een beeldvormings schaal die een dun laagje albumen-agar (~ 150 μL) bevat, zodat er geen luchtbellen op het rugoppervlak van het embryo22ontstaan.
    3. Om de overleving voor langdurige beeldvorming te garanderen, voegt u een klein vochtig opgerold stukje tissuepapier aan de binnenranden van de beeldvormings schaal toe en verzegelen u het gerecht met behulp van paraffinefolie om de verdamping tijdens de beeldvorming en incubatie te minimaliseren.
    4. Verplaats dit gerecht snel naar de voorverwarmde fase van een confocale Microscoop en lokaliseer de gekleurde kleurstof in het embryo met behulp van het brightfield-kanaal (PMT laser 20%), dat de geïnjecteerde en elektroporated regio identificeert.
  3. Stel imaging software in op de gewenste doelstelling (10 of 20x), dichroïde spiegel (488 nm voor GFP nm, 561 voor RFP), emissiespectra (499-562 nm voor GFP, 570-695 nm voor RFP) en zet een geschikte laser aan (488 nm voor GFP, 561 nm voor RFP).
    Opmerking:     elektroporated mRNA werd vertaald in eiwitten die binnen 20 minuten werden gezien (Zie Figuur 3). De metagegevens voor Imaging die voor de meeste afbeeldingen in dit document werden gebruikt, waren: een omgekeerde confocale Microscoop met een doelstelling van 20 x (Zie tabel met materialen); pixel dwelltijd, ~ 1,5 μs; gemiddelde van 4-lijn scans.
    1. Klik op live op de beeldvormings software en stel de laser stroom in op een instelling die geschikt is voor de intensiteit van de fluorescentie, afhankelijk van de laser stroom van elke Microscoop. Begin met het beeldvorming van het embryo met 1% laser vermogen, 800 Gain, en verhoog het Laser vermogen langzaam met 1% stappen totdat verzadigde pixels worden gezien.
    2. Volg dit door het Laser vermogen iets te verlagen tot er geen verzadigde pixels meer worden gezien.
      Opmerking: De laser stroom die is gekozen voor het begin van een beeldvormings sessie van een embryo kan goed zijn voor eerdere tijdpunten, maar niet ideaal op latere tijdstippen als de fluorescentie van de cellen in de loop van de tijd veel helderder of dimmer wordt. Om dit aan te pakken, beeltenis het embryo in eerste instantie met iets lagere Vermogensinstellingen, omdat de elektroporated cellen over het algemeen helderder worden tijdens de eerste 6 uur na de elektrotechniek (Zie Figuur 3a-E voor kwantificering van signaal verhoging). Als de latere afbeeldingen verzadigd zijn, gaat u door met het beeld met de oorspronkelijke beeldvormings instellingen, maar neemt u onmiddellijk een extra afbeelding met zwakkere beeldvormings instellingen (kleiner pingat of zwakker Laser vermogen).
    3. Beeld het embryo elke 3-5 min in om individuele Celmigratie over verschillende tijdspunten te volgen. Voor dit werk waren de beelden z-Stacks (~ 50 μm dik) van het gehele elektroporated gebied, plus enkele extra ruimte naar de onderkant van de z-stack in het geval het embryo zakt in het agarose bed tijdens de Imaging sessie.
    4. Kijk hoe snel de cellen bewegen door de eerste paartijd punten van de eerste film te controleren. Als de cellen met een snel tempo bewegen (wat betekent dat ze het gebied van het afbeelding gemaakt gebied binnen een paar meer tijdpunten zullen verlaten), u overwegen de zoom van het beeldgebied uit te breiden (1x à 0.8 x) of een andere regio te maken.
      Opmerking: Embryonale gebieden in het gebied pellucida verplaatsen veel sneller dan die in het gebied opaca. Daarnaast bevatten jongere embryo's (HH3, HH5) vaak cellen die een snellere beweging ondergaan in vergelijking met oudere embryo's (> HH7).
    5. Na beeldvorming van het elektroporated gebied van het embryo, beeld een un-elektroporated gebied van hetzelfde embryo om te bepalen van de autofluorescentie niveaus (moet minimaal zijn als lage Laser vermogen < 10% wordt gebruikt voor het beeld van het embryo).

6. fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) om mRNA-integriteit te testen

Opmerking: Een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) assay kan worden gebruikt om te bepalen hoe lang getransfunteerd mRNA kan worden vertaald in FPs. Het volgende protocol schetst een FRAP-experiment voor het detecteren van de halfwaardetijd van H2B. Citrien mRNA in een elektroporated embryo.

  1. Voer FRAP-experimenten uit op de omgekeerde confocale Microscoop met behulp van een objectief van 20 x 0,8 NA en een volledig open pinhole.
    1. Na bevestiging van de elektroporation van H2B-Citrien op de stereomicroscoop en het instellen van het embryo op de voorverwarmde fase op de omgekeerde confocale Microscoop (zie stap 5.2.4), fotobleek middel het grootste deel van de cellulaire fluorescentie van H2B-Citrien in een verscheidenheid van tijd punten (45 min, 2 h, en 5 h post-Electroporation) door gebruik te maken van de 405 nm laser met 70% Laser vermogen, 100 iteraties, scansnelheid 4, die laat slechts 5% van de fluorescentie overgebleven.
      Opmerking: Dit proces moet een paar minuten duren.
    2. De embryo's op het podium blijven inbrokken bij 36 °C na fotobleaching.
  2. Zorg ervoor dat u aandacht besteedt aan het actief verdelen van cellen in het fotogebleekte gebied, wat aangeeft dat de fotogebleekte cellen na de behandeling niet volledig zijn gestorven.
  3. Verkrijg een post-Bleach-afbeelding (z-stapels van het elektroporated-gebied) tot 30 minuten met regelmatige tijdsintervallen (3 of 5 min) met behulp van de confocale Microscoop.
    Opmerking: Indien beschikbaar, gebruik een transgene H2B-XFP-lijn als een positieve controle voor het overleven van de cel in de fotogebleekte regio. De snelheid van fluorescentie herstel voor de FP gecodeerd door de electroporated mRNA moet afnemen, maar dat voor de FP gecodeerd via transgen moet consistent blijven gedurende de hele film.
  4. Om ervoor te zorgen dat de beeldvormings omstandigheden niet schadelijk zijn voor de overleving van embryo's, moeten tegelijkertijd elektroporated, die niet fotogebleekt zijn, gelijktijdig worden geïnfiltreerd, wat kan dienen als controle voorbeeld vorming.
  5. Om de fotobleaching resultaten voor mRNA Decay na elektroporation te kwantificeren, houdt u de celfluorescentie na verloop van tijd (3 of 5 min) bij door de intensiteit van de fluorescentie van het midden (een cirkel van 7,5 μm) van elke cel te meten met ImageJ. Meet dit voor alle cellen in de fotogebleekte regio die geen mitose ondergaan en volledig fotogebleekt zijn.
    Opmerking: Overweeg het weglaten van de mitotische cellen van de kwantificering omdat mitotische kernen sterker fluorescentie hebben dan interfase kernen als gevolg van chromatine condensatie.
  6. Plot de intensiteit van de fluorescentie na de tijd na het bleken op verschillende tijdspunten (45 min, 2 uur en 5 uur).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation

We gebruikten pCS2 +. H2B-Citrien ter voorbereiding van de in vitro getranscribeerd mRNA. Aangezien DNA-elektroporatie gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 1-2 μg/μL, gebruikten we een equimolaire concentratie van mRNA (berekend als ongeveer 0,25-0,5 μg/μL voor H2B-Citrien) voor mRNA-elektroporation. We testten eerst de elektroporation efficiency van pCS2 +....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo's. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo's (Figuur 2 en 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna's kan worden gedetecteerd door...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

We danken David Huss voor het nuttige inzicht in dit werk. Dit werk werd deels gesteund door de Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) en de undergrad Research Fellowship van USC Provost aan M.T., het Saban Research Institute Intramural training pre-Doctoral Award aan M.D., en de Universiteit van Southern California Undergraduate Research Associates programma Award aan R.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Fenoel:Chloroform:Isoamyl AlcoholThermo Fisher15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kitThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)fenyl-polyethyleenglycol, t-Octylfenoxypolyethoxyethanol, Polyethyleenglycol tert-octylfenylether
DAPISigma AldrichD95422-(4-Amidinofenyl)-6-indolcarbamidin dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-fenylindool dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filterpapierSigma AldrichWHA1001125
glycerolSigma AldrichG9012
UreaSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi was een geschenk van Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneDit artikel
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine was een geschenk van Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry was een geschenk van Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 geïnverteerde microscoopCarl Zeiss Microscopy GmbHDe LSM-780 is een confocale en multi-fotonen microscoop die de gevoeligheid biedt die nodig is voor vitale beeldvorming. Uitgerust met een gemotoriseerde stage, een autofocus apparaat en een volledige stage-top verduisterings incubator, is de 780 een uitstekende microscoop voor high-end live cel/embryo beeldvorming. De hooggevoelige 32-kanaals Quasar detector maakt spectrale beeldvorming, lineaire unmixing en hoge kleur tel (>4) beeldverwerving mogelijk. Excitatie kan worden uitgevoerd met 6 lijnen enkele foton lasers (405, 458, 488, 514, 564 en 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-foton laser (bereik van 690nm tot 1000nm), en draait met ZEN 2011 SP7 (Black) systeem software.
CUY-21 EDIT in vivo elektroporatorBex Co., Ltd.
Platinum platte vierkante elektrode, zijlengte 5 mmBex Co., Ltd.LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo MicroscoopOlympus LifeScience
XM10 Monochrome cameraOlympus LifeScience
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor HCR (10×, pH 7,4) Om 1 L van een 10× stockoplossing te bereiden, combineer 80 g van NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g van KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g van Na2HPO4 (watervrij; Sigma-Aldrich S3264), en 2,7 g van KH2PO4 (watervrij; Sigma-Aldrich P9791). Pas de pH aan naar 7,4 met HCl, en breng het eindvolume tot 1 L met ultrapure H2O. Vermijd het gebruik van CaCl2 en MgCl2 in PBS voor HCR. Het is belangrijk dat de PBS voor HCR wordt bereid als een RNase-vrije oplossing (bijv. via diëthylpyrocarbonaat [DEPC] behandeling).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonVoeg 1 mL van Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) en 100 mL van 10× PBS toe aan 890 mL van ultrapuur gedestilleerd H2O. Filter de oplossing door een 0,2 μm filter en bewaar deze bij 4 ?C tot gebruik.
1× fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (DEPC-behandeld; pH 7,4)
0,1% Triton X-100

Referenties

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fluorescerende eiwitteneiwitexpressieconfocale microscopiephotobleaching-assaytransfectie-efficiëntieembryo-imagingkwartelsembryo'sdynamische imaging
Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.