Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Summary

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Abstract

We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo's sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna's te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna's worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo's elektroporated met Mrna's die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.

Introduction

Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen^1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen^4,

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van het Children's Hospital Los Angeles en de comités voor institutionele Dierenzorg en-gebruik van de Universiteit van Zuid-Californië.

1. generatie pCS2-gebaseerde expressie vectoren

1. Om pCS2. Lifeact-eGFP te klonen, bereidt u de vector ruggengraat voor door 2 μg pCS2. CycB1-GFP (een constructie met een ander wisselplaat) te verteren met BamHI (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte digestie buffer (zie tabel met materialen) verdund tot 1x in een totale reactie volume van 50 μL voor 1 uur bij 37 °C (Zie Figuur 1....

Results

mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation

We gebruikten pCS2 +. H2B-Citrien ter voorbereiding van de in vitro getranscribeerd mRNA. Aangezien DNA-elektroporatie gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 1-2 μg/μL, gebruikten we een equimolaire concentratie van mRNA (berekend als ongeveer 0,25-0,5 μg/μL voor H2B-Citrien) voor mRNA-elektroporation. We testten eerst de elektroporation efficiency van pCS2 +........

Discussion

In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo's. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo's (Figuur 2 en 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna's kan worden gedetecteerd door.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Thermo Fisher	15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper	Sigma Aldrich	WHA1001125
glycerol	Sigma Aldrich	G9012
Urea	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		This paper
pCS.H2B-citrine	Addgene	53752	pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH		The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator	Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm	Bex Co., Ltd.	LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope	Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4)			To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100