Methodenartikel

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

DOI:

10.3791/59677

⸱

14 mei 2019

 ,  ,  ,  , 
1Cancer Metastasis Laboratory, Department of Biomedicine, University of Basel and University Hospital Basel, 2SIB Swiss Institute of Bioinformatics

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blood-Borne metastase is verantwoordelijk voor de meeste kanker-gerelateerde sterfgevallen en impliceert circulerende tumorcellen (CTCs) die succesvol zijn in het vestigen van nieuwe tumoren op verre locaties. CTCs zijn te vinden in de bloedbaan van patiënten als enkelvoudige cellen (enkele CTCs) of als multicellulaire aggregaten (CTC clusters en CTC-witte bloedcel clusters), met de laatste weergave van een hogere gemetastaseerde vermogen. Beyond opsomming, fenotypische en moleculaire analyse is buitengewoon belangrijk voor ontleden CTC biologie en om te identificeren van de kwetsbare kwetsbaarheden. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van een workflow die CTC immunokleuring en micromanipulatie, ex vivo cultuur omvat om de proliferatie en overlevingsmogelijkheden van individuele cellen te beoordelen, en in vivo metastase-vorming assays. Daarnaast bieden wij een protocol om de dissociatie van CTC-clusters in individuele cellen en het onderzoek naar intra-cluster heterogeniteit te bereiken. Met deze benaderingen, bijvoorbeeld, we nauwkeurig kwantificeren overleving en proliferatie potentieel van enkele CTCs en individuele cellen binnen CTC clusters, leidt ons naar de observatie dat cellen in clusters weer te geven betere overleving en proliferatie in ex vivo culturen in vergelijking met single ctcs. globaal, biedt onze werkstroom een platform aan om de kenmerken van ctcs op het enige niveau van de cel te ontleden, dat naar de identificatie van metastase-relevante wegen en een beter begrip van CTC biologie streeft.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De klinische manifestatie van metastasen in verre organen vertegenwoordigt de laatste fase van de progressie van kanker en is goed voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde sterfgevallen1. De overgang van gelokaliseerde naar gemetastaseerde ziekte is een multi-step proces, vaak bemiddeld door circulerende tumorcellen (ctcs)2,3,4. Deze cellen worden vergoten van de primaire tumor in de bloedcirculatie en worden vervoerd naar verre organen, waar ze kunnen extravasate en vast te stellen gemetastaseerde laesies5,6. Hoewel de stevige tumors een vrij hoog aantal CTCs kunnen vrijgeven, zijn de meeste CTCs bestemd om te sterven, ten gevolge van hoge afschuifkrachten in omloop, anoikis-gemedieerde celdood, immune aanval of beperkte capaciteiten om aan een buitenlandse micro-omgeving7aan te passen. Daarom is het cruciaal om instrumenten vast te stellen die de dissectie van de moleculaire kenmerken van die CTCs die zijn begiftigd met metastasen-zaaien vermogen mogelijk te maken. Recente preklinische en klinische studies suggereren dat de aanwezigheid en kwantiteit van enkelvoudige ctcs en CTC-clusters wordt geassocieerd met een slechtere uitkomst bij patiënten met verschillende soorten vaste tumoren8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . CTC-clusters zijn groepen van twee of meer ctcs die aan elkaar zijn gekoppeld tijdens de circulatie en zijn efficiënter in het vormen van metastase in vergelijking met enkele ctcs3,15,16. De cellen binnen een cluster handhaven sterke cel-cel adhesie door desmosomes en adherens verbindingen, die kunnen helpen om anoikis17,18te overwinnen. Onlangs hebben we opgemerkt dat clustering van CTCs is gekoppeld aan hypomethylation van bindende sites voor de stam-en proliferatie-geassocieerde transcriptiefactoren, wat leidt tot een verhoogde vermogen om met succes te initiëren metastase19. CTC cluster dissociatie resulteert in het remodelleren van belangrijke bindende plaatsen, en bijgevolg, de afschaffing van hun gemetastaseerde potentieel19. Bovendien aan clusters van kankercellen, kan CTCs aan witte bloed cel (het vaakst neutrofielen) ook associëren om hoge proliferatie niveaus in omloop te handhaven en hun gemetastaseerde vermogen20te verhogen. Nochtans, wordt de biologie van CTCs begrepen slechts voor een deel en verscheidene vragen blijven open, met inbegrip van de onderliggende moleculaire eigenschappen en de kwetsbaarheden van enige en geclusterde cellen.

In de afgelopen jaren zijn verschillende strategieën vastgesteld die gebruik maken van cel-oppervlakte expressie patronen en fysische eigenschappen van ctcs voor hun isolement21,22,23,24, 25. antigeen-afhankelijke isolatie methoden vertrouwen meestal op de expressie van cel oppervlak epitheelcellen adhesie molecuul (EpCAM)26. Het het vaakst gebruikt en (momenteel) het enige door de FDA goedgekeurde platform voor CTC-opsomming, is het CellSearch systeem, dat gebaseerd is op een procedure in twee stappen om CTCs21te isoleren. In de eerste stap, worden de plasma componenten verwijderd door centrifugeren, terwijl CTCs met magnetische ferrofluids die aan anti-EpCAM antilichamen wordt gekoppeld worden gevangen. In de tweede stap, de CTC-verrijkte oplossing is gekleurd voor nucleated (DAPI-positieve) cellen die cytokeratine (CK)8,18,19, terwijl witte bloedcellen (WBC) worden geïdentificeerd met behulp van de pan-leukocyten marker CD45. Ten slotte, gevangen cellen worden geplaatst op een geïntegreerde screening platform en CTCs worden geïdentificeerd door de expressie van EpCAM, CKs, en DAPI terwijl ze negatief voor CD45. Hoewel dit wordt beschouwd als de gouden standaard voor CTC opsomming, downstream moleculaire analyse is uitdagend met deze technologie als gevolg van inherente beperkingen in CTC ophalen. Bovendien, gezien de isolatie-procedure, CellSearch kan het voordeel van de verrijking van CTCs met hogere EpCAM niveaus in vergelijking met CTCs met een lagere EpCAM expressie, als gevolg van bijvoorbeeld kanker heterogeniteit27 of downregulation van epitheel markeringen 28,29. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn antigeen-onafhankelijke technologieën voor de verrijking van CTCs ontstaan. Bijvoorbeeld, de CTC-iChip integreert hydrodynamica scheiding van nucleated cellen, met inbegrip van CTCs en WBC van de resterende bloedbestanddelen, gevolgd door een immunomagnetic uitputting van antilichaam-Tagged WBC, waardoor zuivering van ongecodeerde en levensvatbare CTCs in oplossing25. Bovendien, het feit dat de meeste ctcs zijn iets groter dan rode bloedcellen (RBCs) of WBC geleid tot de ontwikkeling van op maat gebaseerde CTC verrijking technologieën23,30 (bijv. de Parsortix systeem (hoek)), die gebruik maakt van een microvloeiende-gebaseerde technologie, bestaande uit een vernauwing kanaal over de separatie cassette, leidende cellen naar een Terminal gap van ofwel 10, 8, 6,5 of 4,5 µm (verschillende maten zijn beschikbaar, afhankelijk van de verwachte diameter van de doelgroep kankercellen). Het merendeel van de bloedcellen passeren de smalle kloof, terwijl CTCs te krijgen gevangen als gevolg van hun grootte (maar ook vanwege hun lagere vervorming) en zijn dus bewaard in de cassette. Het terugdraaien van de stroomrichting maakt het vrijgeven van gevangen CTCs, die in een levensvatbare staat en geschikt voor downstream-analyse. Onafhankelijk van de gekozen protocol voor CTC isolatie, echter, typische post-verrijking procedures nog steeds CTCs die worden gemengd met een relatief klein aantal RBCs en WBC, waardoor de analyse van pure single of bulk CTCs uitdagend. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een workflow die CTC manipulatie mogelijk maakt zonder potentiële bias geïntroduceerd door bloedcellen contaminanten. De toevoeging van immunokleuring op voorhand, met variabele antilichaam-combinaties, onderscheidt CTCs van bloedcellen en maakt het zelfs mogelijk om CTC-subgroepen te identificeren met verschillende oppervlakte-marker expressieprofielen. Deze uiterst aanpasbare procedure kan vervolgens verder worden gecombineerd met specifieke downstream-toepassingen.

Hier beschrijven we een workflow die begint met een CTC-verrijkt product (verkregen met een CTC-verrijking technologie van keuze) en combineert verschillende benaderingen om inzicht te krijgen in de CTC biologie op single-cell resolutie. In een notendop, onze workflow maakt het mogelijk de identificatie van enkele CTCs, CTC clusters en CTC-WBC clusters door Live immunokleuring, gevolgd door single-cel micromanipulatie en downstream-analyse met behulp van ex vivo kweken protocollen, enkele cel sequenties, en in vivo metastase assays.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot bloedmonsters van patiënten werden uitgevoerd op ondertekende geïnformeerde toestemming van de deelnemers. Procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen EKNZ BASEC 2016-00067 en EK 321/10, goedgekeurd door de ethische en institutionele Review Board (ethiek Comite Northwest/Centraal Zwitserland [EKNZ]), en in overeenstemming met de verklaring van Helsinki.

Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en Cantonal richtlijnen (goedgekeurd muis protocol #2781, Cantonal Veterinair Bureau van Basel-city).

1. patiënt monstervoorbereiding

  1. Alvorens te beginnen, zorg ervoor om met aseptische oplossingen en materialen te werken om steriliteit tijdens de volledige procedure te handhaven.
  2. Trek 7,5 mL van perifeer bloed van een borstkanker patiënt in een 10 mL EDTA bloedafname buis.
  3. Incubeer de bloed-bevattende buizen voor een korte periode (tot 1 h) bij kamertemperatuur (RT) op een schommelende Schudbeker bij 40 schommeling per minuut (OSC/min).
  4. Verrijken voor enkelvoudige ctcs en CTC-clusters met behulp van een CTC-isolatie methode van keuze21,22,23,25. Release CTCs in een 1x DPBS oplossing.
    Opmerking: afhankelijk van de gekozen CTC-verrijkings technologie kunnen de resterende witte bloedcellen en rode bloedcellen aanwezig zijn. Pas de vrijgave druk aan om de CTC-cluster structuren te behouden.
  5. Ga onmiddellijk naar de volgende stap in deel 3.

2. muis monster voorbereiding

  1. Voordat u begint, bereidt u een 1 mL insuline spuit met een 25G naald, 5 mM EDTA gefilterde oplossing, en 2 mL EDTA bloedafname buizen.
  2. Zorg ervoor om met aseptische oplossingen en materialen te werken om steriliteit tijdens de volledige procedure te handhaven.
  3. Pre-wash de spuit met 5 mM EDTA-oplossing.
  4. Laad de spuit met 100 l van 5 mM EDTA en verwijder de bubbels.
  5. Euthanaseren de muis met behulp van 80% CO2 /20% O2 gas inhalatie en ga onmiddellijk naar de volgende stap.
    Opmerking: een alternatief voor CO2 inhalatie methode is de Isofluraan anesthesie (3 vol% Isofluraan en zuurstof (Carrier gas) op het debiet van 600 ml/min), gevolgd door cervicale dislocatie, of overdosering injectie van ketamine/xylazine oplossing. Specifieke euthanasie methode kan variëren, afhankelijk van de goedgekeurde muis protocol.
  6. Bevestig de dood van het dier door de afwezigheid van Ademhalings activiteit, ontbrekende cornea reflex, en plassen zonder externe stimuli.
  7. Voer een cardiale punctie uit door de naald van de EDTA-voorgeïnstalleerde spuit met een hoek van 30 ° in de thorax van het borstbeen naar het hart te introduceren.
    Opmerking: voor onervaren experimenten, is het raadzaam om de borstholte eerste open, voordat het uitvoeren van de cardiale punctie, beter te visualiseren het hart.
  8. Halen tot 1 mL bloed. Zonder het loslaten van de zuiger, trek de spuit uit de dieren borst, veilig verwijderen van de naald, open het deksel van de 2 mL EDTA bloedafname buis en afzien van het bloed direct binnen. Sluit het deksel en omkeren van de buis 10x.
  9. Incubeer de bloed-bevattende buizen voor een korte periode (tot 1 h) bij RT op een schommelende Schudbeker bij 40 osc/min.
    Let op: de naald moet worden verwijderd in een scherp veilige biologische gevaren verwijdering.
    Opmerking: meerdere puncties zijn mogelijk om het totale bloedvolume te verhogen. Gebruik aparte spuiten vooraf geladen met EDTA voor verschillende terugtrekt om te voorkomen dat opzuigen bloedstolling aanwezig in de vorige naald.
  10. Verrijken voor enkelvoudige ctcs en CTC clusters met behulp van ctcs isolatie methode van keuze21,22,23,25. Release CTCs in een 1x DPBS oplossing.
    Opmerking: afhankelijk van de gekozen CTC-verrijkings technologie kunnen de resterende witte bloedcellen en rode bloedcellen aanwezig zijn. Pas de vrijgave druk aan om de CTC-cluster structuren te behouden.
  11. Ga onmiddellijk naar de volgende stap in deel 3.
    Opmerking: voor alle volgende procedures, ervoor te zorgen dat niet-vaste en vers geïsoleerde bloed wordt gebruikt.

3. CTCs Live immunokleuring

  1. Centrifuge CTC-verrijkte cel suspensie bij 72 x g voor 4 min.
    Opmerking: 72 x g komt overeen met 800 rpm als de rotor een diameter heeft van 100 mm. Converteer het g-Force nummer volgens de rotor.
  2. Voorzichtig de pellet in 1% BSA-oplossing in 1x DPBS en voeg 2 μg/mL anti-humaan EpCAM-AF488 antilichaam en 1 μg/mL anti-humaan antiCD45-BV605 antilichaam of 2 μg/mL anti-muis CD45-BV605-antilichaam in een totaal volume van 500 l.
    Opmerking: voor borstkanker patiënt-afgeleide CTCs, Anti-menselijke EGFR-FITC, en anti-menselijke HER2-AF488 kan bovendien worden toegevoegd aan anti-EpCAM en anti-CD45. Dit maakt het mogelijk om de CTCs die een lager EpCAM niveau uitdrukken beter te identificeren.
  3. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT en Bescherm tegen licht.
  4. Wash CTCs Suspension met 1 mL van 1% BSA in 1x DPBS oplossing en centrifugeren bij 72 x g voor 4 min. Herhaal deze wasbeurt tweemaal.
  5. Hersuspendeer gekleurde cellen in 2 mL van 1% BSA in 1x DPBS oplossing en breng het totale volume in 1 goed van een 6-Wells ultra-lage bevestigingsplaat.
  6. Incubeer de plaat voor 10-15 min bij 4 °C beschermd tegen licht om sedimentatie van CTCs en residuele bloedcellen toe te staan.

4. micromanipulatie van CTCs en single-cell plukken

Opmerking: voordat u begint, moet u zich ervan bewust dat de micromanipulator vereist tot 45 min voor volledige set-up. Eenmaal ingesteld, de procedure voor CTC identificatie en micromanipulatie vereist tot 2 minuten per cel (of cluster).

  1. Zorg ervoor dat u de CTC-picking procedure binnen 2 uur beëindigt vanaf het einde van de kleuring.
  2. Start de micromanipulator software op en schakel de micromanipulator in. Sluit de micro manipulator aan op de computer en Initialiseer de robotarm evenals de Microscoop fase door op de Connect knop te drukken, gevolgd door int apparaat.
  3. Sluit de beschermende kast na elke manipulatie van de machine te kunnen om het te manoeuvreren via de computer.
  4. Reinig de oppervlakken van stof en morsen door het spuiten van ethanol en het afvegen van de interne oppervlakken van de kast. Een schone omgeving zal zorgen voor de steriliteit van het proces.
  5. Installeer een nieuw glas capillair op de robotarm. Voor de single-cell plukken, gebruik 20-30 μm capillaire terwijl 30-50 μm is de voorkeur voor CTC cluster picking.
  6. Verwijder alle bubbels aanwezig in de slang door het doseren of opzuigen van het systeem olie.
    Let op: glas capillaire is scherp en breekbaar. Handvat met voorzichtigheid.
  7. Vul de sterilisatie tank 1 met 70% ethanol, de sterilisatie tank 2 met steriele Nuclease-vrij H2O en de buffertank met steriele 1x DPBS.
    Let op: sluit niet de deksels van de tanks, want tijdens de volgende stappen van de capillaire zal moeten vrij toegang tot de tanks.
  8. Steriliseren de capillaire tweemaal met 70% ethanol.
  9. Vervang de sterilisatie tank 1 met tank 2 en wassen capillaire in H2O ten minste drie keer met behulp van de sterilisatie functie.
  10. Met behulp van de micromanipulator software, start een nieuw experiment en kies het type van het plukken experiment tussen de automatische en de handmatige selectie modi.
    Opmerking: Kies het type experiment op basis van het eindpunt van de manipulatie. Handmatige modus maakt het manoeuvreren van een robotarm na de capillaire komt de cel schorsing. Deze stap is noodzakelijk voor het dissocieren van CTC-clusters in individuele cellen. Het is mogelijk om het type van het plukken tijdens het experiment te veranderen.
  11. Configureer de dek lade met vermelding van de positie van de sterilisatie tank (vloeistof 1), buffertank (vloeistof 2) en het deponeren van lade (target 1 of 2). Target 1 maakt het mogelijk om te deponeren in platen, Target 2 maakt het mogelijk om te deponeren in PCR buizen of PCR-platen.
  12. Stel de temperatuur van de vloeibare tanks en het deponeren van lade gekozen tot 4 ° c.
    Opmerking: het picking proces kan tijdrovend zijn. Het koelen van de vloeibare tanks en het deponeren van dienblad wordt daarom geadviseerd
  13. Plaats de ultra-lage bevestigingsplaat met de vrijgegeven CTCs oplossing onder de Microscoop in de micromanipulator kast. Verwijder het deksel van de plaat en sluit de kast. Houd de plaat bij RT voor de rest van de set-up en tijdens de picking procedure.
  14. Selecteer handmatig de Microscoop doelstelling voor het plukken (10-20x) en de belichtingstijd van alle benodigde kanalen (helderveld, FITC, en TRITC kanalen).
  15. Selecteer Toon goed Navigator van de Toolbar om het type van bestelwagen plaat (6-goed plaat) te visualiseren en te selecteren.
    Opmerking: elke plaat of goed formaat kan alleen worden geïnstalleerd door de fabrikant.
  16. Kalibreer pickup positie in het midden van de put met de CTCs oplossing, maar zonder cellen in het midden van het gezichtsveld. Kalibratie uitgevoerd aan de randen van de putten kan leiden tot defecte kalibratie als gevolg van oneffen goed oppervlak.
  17. Gebruik de sensor om zachtjes de onderkant van de plaat met de capillaire (snelheid 0,01 mm/Step en 1% snelheid) te raken.
  18. Stel de pickup positie 0,05 mm boven de onderkant van de plaat.
    Nota: Zorg ervoor om deksels van platen en tanks te openen en te verwijderen alvorens te werk te gaan. Het capillair kan breken op een gesloten of onverwijderd deksel.
    Let op: als de capillaire breekt bij contact met deksels, gebroken glas kan worden gevonden in de omgeving of in de oplossingen.
  19. Selecteer type cel en parameters voor orderverzamelen. Picking parameter kan worden ingesteld en geladen bij elke startup. Selecteer de handmatige modus voor het kiezen van één cel.
  20. In de instellingen voor het orderverzamelen :
    1. Stel het luchtspleet volume tussen de systeem olie en het monster in op 1 l
    2. Stel de buffer vloeistofvolume in voordat elke picking tot 0,5 l.
      Opmerking: buffer vloeistofvolume wordt aangepast aan het totale maximale pickup volume. Kleine volumes hebben geen invloed op de pick-of stortings efficiëntie.
    3. Stel de snelheid van aspiratie van de buffer vloeistof tussen 1-6%.
    4. Stel de wachttijd na aspiratie van de buffer op 1 s.
      Nota: de optie om de buffer van doel goed in plaats van buffer vloeistoftank op te nemen kan indien nodig worden gebruikt
    5. Ingesteld op glas capillairen hergebruiken en geen sterilisatie tussende picks.
      Opmerking: sterilisatie tussen de picks kan handmatig worden uitgevoerd indien nodig. Voer meerdere wasbeurten in H2o tussen de picks of twee sterilisatie in ethanol, gevolgd door meerdere wasbeurten in h2o.
  21. Binnen de Kies instellingen:
    1. Wijzig de camera-instellingen tijdens het plukken en de belichtingstijd onder de Microscoop tot 7.500 μs.
    2. Selecteer vaste picking hoogte.
      Opmerking: gereedschaps sensor of autofocus kan in plaats daarvan worden gekozen. Echter, kleine onvolkomenheden van de plaat kan verstoren de gevoeligheid van de sensor of de autofocus, die kan leiden tot een impact van de capillaire in de plaat.
    3. Stel aspiratie snelheid van de capillaire het invoeren van de bron plaat tot 7-15%.
    4. Schakel de interactieve pickingin.
    5. Stel het aspiratie volume in l in op 0-0.05.
    6. Stel de snelheid van aspiratie tot 5%.
    7. Stel de wachttijd na aspiratie in s tot 0-1.
    8. Stel het aantal geplukte deeltjes per capillair in op 1.
    9. Stel geen meervoudige picking op dezelfde positie en geen schrapen functies. Aspiratie eigenschappen moeten worden ingesteld op basis van het type experiment (bijv. automatische picking-modus kan vereisen grotere aspiratie volumes).
  22. Binnen de deposito -instellingen:
    Opmerking: deponeren instellingen strikt afhankelijk van de deponeren plaat/buis.
    1. Voor single-cell plukken, definieert de snelheid van capillaire het invoeren van de doel plaat tot 25%.
    2. Stel de snelheid van de verstrekking aan 6%.
    3. Stel de wachttijd in na het doseren in s op 0.
    4. Stel de hoeveelheid luchtspleet afgeleverd in het doel goed tot 100%.
    5. Stel geen spoelen nahet deponeren.
      Nota: de sterilisatie kan na het deponeren worden uitgevoerd om het capillair schoon te gemaakt.
    6. Stel maximale hoeveelheid deeltjes borg per put en het aantal doelstellingen om deeltjes te verdelen op 1.
    7. De hoogte van de storting op positie a1 van doel 1 voor platen of op positie a1 van doel 2 voor buizen kalibreren. Plaats een open buis of plaat zonder deksel voor de kalibratie en gebruik de sensor om voorzichtig te raken de neerlegging goed (snelheid 0,01 mm/Step en 1% snelheid). Stel de hoogte van de neerlegging 1 mm boven de onderkant van de plaat.
  23. Binnen de instellingen:
    1. Stel de fasesnelheid tijdens het orderverzamelen in op 5-10%.
      Nota: de snelle bewegingen van de plaat kunnen in beweging van cellen in opschorting en moeilijkheden in het veelvoudige cel plukken wegens het verleggen veroorzaken.
    2. Stel de eigenschappen van de sterilisatie in met spoelvolume tot 1 l, 3 spoel lussen en 2 s wachttijd per sterilisatie ronde.
    3. Pas de wijzigingen toe voordat u afsluit.
  24. Navigeer het glas capillaire met behulp van de joystick in de put en plaats deze op de top van de enkele cel van belang. Kies het oppakken van posities op een veilige afstand van de put grens (1 mm) als de capillaire kan breken op de rand van de put.
  25. Handmatig deeltjes toevoegen met de knop van de joystick of handmatig selecteren in het menu.
  26. Selecteer geactiveerde deeltjes kiezen om het orderverzamelen te starten.
  27. Het capillair zal stoppen 0,05 mm boven de onderkant van de plaat en op de top van de gekozen pickup positie als gevolg van de interactieve picking (handmatige modus). Draai de knop van de joystick met de klok mee om handmatig aspireren het deeltje en de omliggende DPBS oplossing. Het maximale volume is niet vast wanneer de handmatige modus is ingeschakeld. Het maximaal toegestane volume in de spuit is echter 25 l.
  28. Afzien van de overtollige DPBS oplossing of ongewenste deeltjes door voorzichtig draaien van de knop van de joystick linksom. Te veel doseren zal vrijgeven van de luchtspleet van de spuit vormen bubbels in uw oplossing en compromitterende zichtbaarheid.
  29. Druk op Next om verder te gaan met de storting.
  30. Observeer het capillaire invoeren van de deponeren PCR buis of PCR plaat, het vrijgeven van het volume en terug te gaan naar de uitgangspositie met een lege capillaire.
    Opmerking: als er volume links in de capillaire, verder met sterilisatie. Controleer vervolgens de instellingen, het olieniveau en de olie hoogte voordat u een nieuwe picking uitvoert.
  31. Ga verder vanaf punt 26 van sectie 4 om een nieuwe picking met één cel te starten. Tijdens het plukken kan het nodig zijn om het capillair te vervangen. Na de installatie moet een nieuwe kalibratie van de pickup-positie worden uitgevoerd. Aan het einde van de kalibratie, selecteert u de functie van toepassing gekalibreerde veranderingen in Z-hoogte om de hoogte te deponeren om de borg hoogte te corrigeren om de nieuwe capillaire kalibratie en om de borg hoogte kalibratie over te slaan (punt 4,16).
    Opmerking: de in punt 1-4 beschreven stappen zijn van toepassing op de meeste CTCs verrijkings-en isolatie methoden. Hier rapporteren we optionele stappen voor specifieke CTCs analyse.

5. single-cell plukken en zaaien voor overleving en proliferatie analyse

  1. Zorg ervoor om met aseptische oplossingen en materialen te werken om steriliteit tijdens de volledige procedure te handhaven.
  2. Bereid een 384 goed plaat voor om de geplukte enkelvoudige CTCs te bevatten voor kweken met 20 l CTC kweken media31. Zorg ervoor dat CTCs worden gezaaid in kleine volumes van het medium na manipulatie (bijv. 10-20 l voor een 384 goed plaat).
  3. Spin vaststelling van de oplossing aan de onderkant van de plaat. Plaats 384 goed plaat in doel 1 en houd bij 4 °C.
  4. Voer alle stappen met de micromanipulator beschreven in de sectie 4 tot het opzetten van de micromanipulator en start een nieuwe picking.
    Opmerking: bij meerdere selecties van de afzonderlijke cellen wordt de vorming van een orderverzamellijst veroorzaakt. De deeltjes zullen worden geplukt en gedeponeerd een voor een in opeenvolgende putten (zie sectie 4.22.6). Nochtans, zal de interactieve wijze (handwijze) het capillaire recht vóór de aspiratie tegenhouden, daarom toestaand de experimenter om deze kritieke stap te controleren en het succesvolle plukken te verzekeren. De snelle bewegingen van de plaat kunnen in de beweging van de cellen in opschorting en moeilijkheden in het veelvoudige cel plukken resulteren.
  5. Na het storten herhaalt u stap 4 om een nieuwe picking te starten.
  6. Aan het eind van het plukken, centrifugeer de plaat bij 72 x g 4 min om ervoor te zorgen dat de geplukte cellen bij de bodem van de put worden geplaatst.

6. CTC cluster Breaking en single-cell plukken voor sequencing

  1. Zorg ervoor om met aseptische oplossingen en materialen te werken om de steriliteit tijdens de gehele procedure te handhaven.
  2. Bereid één PCR buizen of een PCR plaat voor die de enige cellen van de gebroken cluster met de totale 2,5 l-cel Lysing oplossing zal bevatten die 1 U/l van de Inhibitor van RNA omvat.
  3. Snel spin vaststelling van de oplossing aan de onderkant van de buis. Plaats de stort containers in de doelstelling 2 en houd deze bij 4 °C.
  4. Voer alle stappen beschreven in paragraaf 4 met de micromanipulator voor het opzetten van de micromanipulator.
  5. Een nieuwe picking starten. Het capillair stopt 0,05 mm boven de onderkant van de plaat en bovenop de geselecteerde CTC-cluster als gevolg van de interactieve picking (handmatige modus).
  6. Draai de knop van de joystick met de klok mee om handmatig aspireren het cluster en de omliggende DPBS oplossing. Afzien van de aanzuiging volume inclusief CTC cluster door voorzichtig draaien van de knop van de joystick linksom.
  7. Herhaal de aspiratie/verwijdering van het CTC-cluster dat in stap 6 is beschreven totdat de enkelvoudige cellen die het cluster vormen, uiteenvallen.
    Opmerking: te veel verstrekking zal vrijgeven van de luchtspleet van de spuit vormen bubbels in uw oplossing en compromitterende zichtbaarheid.
  8. Volg door oog de positie van de enige cellen. Voeg de deeltjes handmatig toe met de knop van de joystick of kies handmatig uit het menu.
    Opmerking: bij meerdere selecties van de afzonderlijke cellen wordt de vorming van een orderverzamellijst veroorzaakt. De deeltjes zullen één voor één in opeenvolgende PCR buizen/putten worden geplukt en worden gedeponeerd (zie sectie 4.22.6). Echter, de interactieve modus (handmatige modus) stopt het capillair vlak voor de aspiratie, dus, waardoor de Experimenteer om deze kritieke stap te controleren en te zorgen voor een succesvolle picking.
  9. Selecteer geactiveerde deeltjes kiezen om het orderverzamelen te starten.
    Nota: de hoeveelheid cel Lysing oplossing zal één enkele cel aan volledig lyse toestaan. Nochtans, kan de lange blootstelling van de lysed inhoud aan de Lysing agent DNA of mRNA afbreken. Ga daarom onmiddellijk naar de volgende stap.
  10. Sluit onmiddellijk de buis met de geplukte enkele cel en de overdracht op droog ijs voor Snap bevriezing.
  11. Snel spin de buis en controleer of er geen druppels aan de zijkanten van de buis om een goede lyse van de gedeponeerde cel te waarborgen.
  12. Herhaal vanaf stap 5 om een nieuwe picking te starten.
    Nota: het stadium van de Microscoop zal zich van één toegevoegd deeltje aan een andere bij de snelheid bewegen die in sectie 4.23.1 wordt beschreven. CTCs schorsing in de ultra-lage bevestigingsplaat kan bewegen, waardoor defecte picking als gevolg van onjuiste positionering.

7. CTCs isolatie voor muis injectie

  1. Zorg ervoor om met aseptische oplossingen en materialen te werken om steriliteit tijdens de volledige procedure te handhaven.
  2. Bereid een PCR buis met 5 l van steriele 1x DPBS.
  3. Snel spin vaststelling van de oplossing aan de onderkant van de buis. Plaats de stort containers in de doelstelling 2 en houd deze bij 4 °C.
  4. Binnen de deposito -instellingen van toepassing een verandering bij de stap 4.22.6: Stel de maximale hoeveelheid deeltjes storting per well op 1.000 en het aantal doelstellingen om deeltjes te distribueren naar 1. Deze stap zorgt ervoor dat de geplukte cellen in de zelfde buis voor 1.000 keer zullen worden gedeponeerd.
  5. Gebruik alleen de interactieve modus (handmatige modus) om de picking stap nauwkeurig te beheren en de geplukte oplossing vrij te houden van contaminant cellen.
    Nota: als meer dan 1.000 cellen nodig zijn, Verhoog het aantal doelstellingen om deeltjes te verdelen om verlies van steekproef na 1.000 cellen te vermijden.
  6. Ga verder met de stappen van sectie 4,26 om een nieuwe picking te starten. Herhaal stap 6 om meerdere Pickings uit te voeren. Annotatie van het aantal cellen verzameld bij elke picking in om bij te houden van het aantal cellen beschikbaar voor de muis injectie.
  7. Centrifugeer aan het einde van de picking de buis bij 72 x g gedurende 4 min (zie punt 3,1.) en aspireren bovendrijvende.
  8. Hersuspendeer de verzamelde CTCs in de buffer van keuze, geschikt voor muis injectie. Voor de borstklier vet pad injectie, opnieuw op te schorten de verzamelde CTCs in een 1 tot 1 verhouding van 1x DPBS en opnieuw samengesteld kelder membraan geëxtraheerd, en houden bij 4 ° c tot de injectie. Voor intraveneuze injectie, opnieuw schorsen van de verzamelde CTCs in DPBS alleen.
    Nota: het volume van de oplossing hangt strikt van het aantal CTCs af dat zal worden ingespoten. Het is raadzaam om te injecteren in de borstklier vet pad of intraveneus een maximum van 100 l per muis. Bij de berekening van het volume, altijd rekening houden met de dode volume voor de manipulatie en spuiten laden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde workflow maakt de voorbereiding van individuele CTCs, hetzij van enkelvoudige CTCs of gescheiden van CTC-clusters. CTCs van patiënten of tumor-dragende muizen worden verrijkt van geheel bloed met beschikbare CTC-verrijkings methodes en dan bevlekt met antilichamen tegen kanker-geassocieerde markers (b.v., EpCAM, groen) en WBC-specifieke tellers (b.v., CD45, rood) (Figuur 1a ). De gekleurd CTC product wordt vervolgens overgedragen aan de micr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De moleculaire karakterisering van CTCs houdt de belofte om ons begrip van het gemetastaseerde proces te verbeteren en de ontwikkeling van nieuwe anti-metastase therapieën te begeleiden. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de protocollen die CTC-micromanipulatie en downstream-analyse mogelijk maken, met inbegrip van zowel enkele cel-gebaseerde Functionele assays, Genexpressieanalyse en in vivo transplantatie voor gemetastaseerde potentieel beoordeling20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na en B.M.S. zijn opgenomen als uitvinders in octrooiaanvragen die betrekking hebben op circulerende tumorcellen en de behandeling van kanker. N.V.T. is een betaalde consultant voor farmaceutische en verzekeringsmaatschappijen met een belang in vloeibare biopsie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken alle patiënten die bloed hebben gewonnen voor onze studie, evenals alle betrokken clinici en studie verpleegkundigen. Wij danken Jens Eberhardt, uwe Birke, en Dr. Katharina Uhlig van ALS Automated Lab Solutions GmbH voor continue ondersteuning. Wij danken alle leden van het aceto Lab voor feedback en discussies. Onderzoek in het aceto Lab wordt ondersteund door de Europese Onderzoeksraad, de Europese Unie, de Zwitserse National Science Foundation, de Swiss Cancer League, de Basel Cancer League, de twee kantons van Basel via de ETH Zürich, en de Universiteit van Basel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-human EpCAM-AF488Cell Signaling TechnologyCST5198clone: VU1D9
1X DPBSInvitrogen14190169geen calcium, geen magnesium
6-wells Ultra-low attachment plateCorning3471
Anti-human CD45-BV605Biolegend304041clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC GeneTexGTX11400clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488 Biolegend324410clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605Biolegend103139clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTABD366643voor humane bloedopname
Cell CelectorALSCC1001kerneenheid 
CellD softwareALSversie 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2R&D Systems3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTASarstedt41.3395.005voor muisbloedafname
PCR tubesCorningPCR-02-L-C
RLT PlusQuiagen1053393
SUPERase  In RNase InhibitorThermo FisherAM2696 1 U/µL 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6(2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33(2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032(2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147(2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicromanipulatietechniekCTC isolatiesingle cell pickingCTC clustersex vivo cultuurin vivo metastaseCTC dissociatieintracluster heterogeniteitsingle cell RNA sequencing

Gerelateerde artikelen