Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Samenvatting

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Samenvatting

Pre-klinisch geneesmiddelenonderzoek van vasculaire ziekten vereist in vitro modellen van vasculatuur die zijn geamendeerbaar voor screening met hoge doorvoer. De huidige in-vitro screening modellen met voldoende doorvoer hebben echter slechts een beperkte fysiologische relevantie, wat de vertaling van de bevindingen van in vitro naar in vivo belemmert. Aan de andere kant hebben microfluïdische celculturen in vitro een ongeëvenaarde fysiologische relevantie getoond, maar hebben vaak niet de vereiste doorvoer, schaalbaarheid en standaardisatie. We demonstreren een robuust platform om angiogenese te bestuderen van endotheelcellen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-ECs) in een fysiologische relevante cellulaire micro omgeving, waaronder perfusie en gradiënten. De iPSC-ECs worden gekweekt als 40 geperfused 3D Micro vaten tegen een gedessineerde collageen-1 Scaffold. Bij de toepassing van een gradiënt van angiogene factoren, kunnen belangrijke kenmerken van angiogenese worden bestudeerd, waaronder de differentiatie in punt-en stalken-cel en de vorming van perfbruikbaar lumen. Perfusie met fluorescerende Tracer kleurstoffen maakt de studie van permeabiliteit tijdens en na anastomose van de angiogene spruiten mogelijk. Concluderend toont deze methode de haalbaarheid van de iPSC-afgeleide ECs in een gestandaardiseerde en schaalbare 3D-angiogene test die fysiologische relevante cultuuromstandigheden combineert in een platform dat de vereiste robuustheid en schaalbaarheid heeft om te worden geïntegreerd in de infrastructuur voor geneesmiddelen screening.

Inleiding

In vitro-modellen spelen een fundamentele rol bij de ontdekking en validering van nieuwe geneesmiddelen doelstellingen van vasculaire ziekten. De huidige in-vitro screenings modellen met voldoende doorvoer hebben echter slechts een beperkte fysiologische relevantie¹, wat de vertaling van de bevindingen van in vitro naar in vivo belemmert. Dus, om pre-klinisch vasculaire geneesmiddelenonderzoek te verbeteren, zijn verbeterde in vitro-modellen van vasculatuur nodig die een screening met hoge doorvoer combineren met een fysiologisch relevante 3D-cellulaire micro-omgeving.

In de afgelopen tien jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt om de fysiologische relevantie van in vitro-modellen van vasculatuur te vergroten. In plaats van het kweken van endotheel cellen op vlakke oppervlakken zoals weefsel-cultuur plastics, kunnen endotheel cellen worden ingebed in 3D-steigers, zoals fibrine en collageen gels². Binnen deze matrices vertonen de endotheelcellen een fysiologisch relevant fenotype dat is geassocieerd met matrix degradatie en lumen vorming. Echter, deze modellen tonen alleen een subset van de vele processen die optreden tijdens angiogene kiemen als belangrijke aanwijzingen uit de cellulaire micro-omgeving zijn nog steeds ontbreekt.

Microfluïdische celkweek platforms zijn uniek geschikt om de fysiologische relevantie van in vitro-modellen van vasculatuur verder te verhogen. Bijvoorbeeld, endotheel cellen kunnen worden blootgesteld aan shear stress, dat is een belangrijke biomechanische stimulans voor vasculatuur. Ook kan de mogelijkheid om vocht te beheersen in microfluïdica de vorming van biomoleculaire gradiënten^3,4,5,6. Dergelijke hellingen spelen een belangrijke rol in vivo tijdens de vorming en patronen tijdens de angiogenese. Terwijl microfluïdische celculturen echter een ongeëvenaarde fysiologische relevantie hebben getoond ten opzichte van traditionele 2D-en 3D-celkweek methoden, missen ze vaak de benodigde doorvoer, schaalbaarheid en standaardisatie die nodig is voor de screening van geneesmiddelen ⁷. ook zijn veel van deze platformen niet commercieel beschikbaar en vereisen de eindgebruikers om hun apparaten te microfabriceren vóór gebruik⁸. Dit vereist niet alleen productieapparatuur en technische kennis, maar beperkt ook het niveau van kwaliteitscontrole en heeft een negatieve invloed op de reproduceerbaarheid⁹.

Tot op heden blijven primaire menselijke endotheel cellen de meest gebruikte celbron voor het modelleren van angiogenese in vitro¹⁰. Echter, primaire menselijke cellen hebben een aantal beperkingen die hun routine toepassing in screening benaderingen belemmeren. Ten eerste is er een beperkte mogelijkheid om te schalen en uit te breiden primaire cel afgeleide culturen. Zo moeten voor grootschalige experimenten batches van verschillende donoren worden gebruikt, wat resulteert in genomische verschillen en batch-naar-batch variaties. Ten tweede verliezen primaire endotheel cellen na enkele passages over het algemeen relevante eigenschappen wanneer ze in vitro^11,12worden gekweekt.

Endotheliale cellen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn een veelbelovend alternatief: ze lijken op primaire cellen, maar met een stabieler genotype dat ook vatbaar is voor precieze genoom bewerking. Bovendien kunnen iPSCs zichzelf verlengen en dus in bijna onbeperkte hoeveelheden worden uitgebreid, waardoor iPSC-afgeleide cellen een aantrekkelijk alternatief zijn voor primaire cellen voor gebruik binnen in vitro screenings modellen¹³.

Hier beschrijven we een methode om endotheliale cellen te kweken als perfbruikbare 3D-Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch celcultuurplatform met hoge doorvoer. Perfusie wordt toegepast door het apparaat op een rocker platform te plaatsen, wat een robuuste werking verzekert en de schaalbaarheid van de test verhoogt. Aangezien de micro vaten continu worden geperfectiongebruikt en worden blootgesteld aan een gradiënt van angiogene factoren, wordt angio geen kiemen bestudeerd in een meer fysiologische relevante cellulaire micro omgeving. Hoewel het protocol compatibel is met veel verschillende bronnen van (primaire) Endotheliale cellen^14,15, hebben we ons geconcentreerd op het gebruik van ECs van menselijke IPSC-derivaten om de standaardisatie van deze test te verhogen en de integratie ervan te vergemakkelijken binnen vasculaire drugs onderzoek.

Protocol

1. voorbereiding van het apparaat

1. Breng de microfluïdische 384-put plaat over naar een steriele laminaire stroming.
2. Verwijder het deksel en voeg 50 μL water of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan elk van de 40 observatie putten (Figuur 1b, goed B2) met behulp van een meerkanaals of repeterende pipet.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Laat de plaat met het deksel in de steriele cultuur kast bij kamertemperatuur (RT).

2. gel en coating klaarmaken

1. Bereid 2,5 mL van 10 μg/mL fibronectin (FN) coating oplossing. Verdun 25 μL van 1 mg/mL fibronectin stockoplossing in 2,5 mL van de PBS van Dulbecco (dPBS, calcium en magnesium vrij). Plaats de oplossing in het waterbad bij 37 °C tot het gebruik.
2. Bereid 100 μL collageen-1 oplossing voor. Voeg 10 μL HEPES (1 M) toe aan 10 μL NaHCO₃ (37 g/L) en meng door Pipetting. Plaats de buis op ijs en voeg 80 μL collageen-1 (5 mg/mL) toe om een neutraliseerde collageen-1 concentratie van 4 mg/mL te leveren. Gebruik een pipet om voorzichtig te mengen en Vermijd de vorming van bubbels.
3. Voeg 1,5 μL collageen-1-oplossing (4 mg/mL) toe aan de gelinlaat van elke microfluïdische eenheid (Figuur 1b, goed B1). Zorg ervoor dat de druppel gel in het midden van elk goed wordt geplaatst, zodat de gel het kanaal binnenkomt (Zie Figuur 2a).
   Opmerking: Phaseguides voorkomen het vullen van de aangrenzende kanalen en maakt gel-patronen mogelijk. Correcte gel-belasting kan worden bevestigd onder een brightfield-Microscoop door de meniscus-formatie te observeren via het ' observatie venster ' (goed B2) of door de plaat ondersteboven te spiegelen. Als de gel het kanaal niet volledig vult, kan een extra druppeltje van 1 μL worden toegevoegd.
4. Plaats de microfluïdische plaat in een incubator (37 °c, 5% Co₂) gedurende 10 min tot een collageen-1.
   Opmerking: Timing van de polymerisatie is cruciaal; vanwege de lage volumes die worden gebruikt in microfluïdica, kan de verdamping al worden waargenomen na 15 minuten incubatie, wat resulteert in gel ineenstorting of krimp.
5. Haal de plaat uit de incubator en breng deze over in een steriele laminaire stroming.
6. Voeg 50 μL van 10 μg/mL FN-coating oplossing toe aan de uitlaatklep van het bovenste perfusie kanaal van elke microfluïdische eenheid (Figuur 1b, goed a3). Druk de pipetpunt tegen de zijkant van de put voor de juiste vulling van de put zonder luchtbellen te vangen (Zie Figuur 2b). Het kanaal moet vullen, en de vloeistof moet pinnen op het stopcontact (goed C1) zonder de uitlaat goed te vullen.
7. Plaats de plaat gedurende ten minste 2 dagen in de incubator (37 °C, 5% CO₂).
   Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken, omdat de collageen-1-gel samen met het coating mengsel gedurende ten minste 5 dagen in de incubator stabiel is. Als het coating mengsel wordt ververst, kunnen langere perioden mogelijk zijn, maar dit is niet getest. Cruciaal is het niveau van FN-coating, omdat dit de uitdroging van de collageen-1-gel voorkomt.

3. Celseeding/Microvat cultuur

1. Voeg 5 mL foetaal kalf serum en 2,5 mL pen/STREP toe aan 500 mL basale endotheliale celkweekmedium en filter steriliseren met behulp van een fles topfilter met een poriegrootte van 0,22 μm. Dit medium wordt nu aangeduid als basale medium.
2. Bereid vasculaire groeimedium: Voeg 3 μL van 50 μg/mL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en 2 μL van 20 μg/mL basis fibroblast groeifactoren (bFGF) toe aan 5 mL Basaal medium.
3. Dooi de bevroren iPSC-ECs snel (< 1 min) in een 37 ° Cwaterbad en breng over in een buis van 15 mL en Verdun in 10 mL Basaal medium.
4. Tel de cellen.
   Opmerking: Een enkele injectieflacon bevat 1.000.000 cellen in 0,5 mL met > 90% levensvatbaarheid.
5. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 5 min. aspirate supernatant zonder verstoring van de celpellet en respenderen in Basaal medium om een concentratie van 2 x 10⁷ cellen/ml te geven.
6. Breng de microfluïdische 384-put plaat van de incubator over in een steriele laminaire stroming.
7. Aspirate FN-coating oplossing van de perfusie inlaat (goed a1). Voeg 25 μL Basaal medium toe aan de inlaat putjes (goed a1).
8. Voeg een druppel van 1 μL celsuspensie toe aan elke top perfusie ingang goed (Figuur 1b, goed a1). De druppel moet in een paar seconden afvlakken (Zie Figuur 3a, b voor een illustratie van deze ' passieve pomp methode ').
   Opmerking: Controleer onder een microscoop of de zaaien homogeen is. Als dat niet zo is, voeg dan nog eens 1 μL in het stopcontact en wacht tot de druppel afvlakt.
9. Incuberen de microfluïdische goed plaat gedurende 1 uur bij 37 °C, 5% CO₂. Hierna moeten de cellen zijn vastgehouden. Zo niet, wacht dan nog eens 30 min.
10. Verwijder het basale medium uit de bovenste perfusie uitlaat putjes (Figuur 1b, goed a3). Voeg warm vat kweekmedium in de bovenste perfusie inlaat en uitlaat (Figuur 1b, Wells a1 en a3). Plaats de plaat op het rocker platform (ingesteld op 7 ° hoek, 8 min schommel interval) in de incubator (37 °C, 5% CO₂).
11. Beeld de plaat met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerde fase op dag 1 en 2 na seeding om de levensvatbaarheid van de cel te bevestigen. Na 2 dagen had een confluente monolaag moeten zijn gevormd tegen de collageen-1-Scaffold.
    Opmerking: Als de kanalen niet even Confluent lijken te zijn, kunnen de micro vaten worden gekweekt voor een extra 24 h.

4. onderzoek naar angio geen kiemen, waaronder de vorming van punt-en Stalk-cellen

1. Bereid 4,5 ml angiogene kiem medium voor door het basale medium aan te vullen met 4,5 μl VEGF (50 μg/ml voorraad), 4,5 μL forbol 12-Myristate-13-acetaat (PMA) (2 μg/ml voorraad) en 2,25 μl Sphingosine-1-fosfaat (S1P) (1 mm voorraad).
2. Bereid 8,5 mL van het groeimedium voor het vat (Basaal medium aangevuld met 30 ng/mL VEGF en 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirate medium uit de putten en voeg 50 μL vers vat kweekmedium in de bovenste perfusie inlaat-en uitlaat putten en gel inlaat-en uitlaat putten (Figuur 1b, Wells a1, a3, B1 en B3).
4. Voeg 50 μL angiogene kiem mengsel toe aan elk van de onderste perfusie kanaal inlaat-en uitlaat putten (Figuur 1b, Wells C1 en C3).
5. Plaats het apparaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO₂) op het rocker platform om een gradiënt van angiogene groeifactoren te vormen.
6. Afbeelding 1 dag en 2 dagen na toevoeging van de angiogene groeifactoren met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerde fase.
   Opmerking: Ga door met het kweken van de micro vaten om anastomose te bestuderen (Ga naar rubriek 5) of fixeer en beits de micro vaten om de kiem lengte en morfologie te kwantificeren op dag 2 en dag 6 (Ga naar sectie 6).

5. studie anastomose en Sprout stabilisatie

1. Afbeelding met behulp van een brightfield-Microscoop met geautomatiseerd podium.
2. Voeg 1 μL fluorescendig gelabeld albumine (0,5 mg/mL) toe aan de bovenste perfusie inlaat (Figuur 1b, goed a1) en meng met een pipet van 50 μL.
3. Breng de plaat over naar een fluorescerende Microscoop met automatische podium-en incubator set bij 37 °C. Stel Microscoop in op 10x objectieve en correcte blootstellings instellingen (bijv. tetramethylrhodamine [TRITC]-kanaal, 20 MS blootstelling). Verkrijg time-lapse-beelden elke minuut gedurende 10 minuten.
4. Verwijder de plaat van de Microscoop en breng de plaat over naar een steriele laminaire stroming.
5. Verwijder alle medium uit de putjes en vervang zowel het vat kweekmedium als het angiogene kiem medium in de overeenkomstige putjes (Zie de stappen 4,3 en 4,4).
6. Plaats het apparaat terug in de incubator (37 °C, 5% CO₂) om het angiogene spruiten voort te zetten.
7. Herhaal stap 5.1 − 5.6 om de permeabiliteit op dag 6 te bestuderen.

6. fixatie, kleuring en beeldvorming

1. Aspireren alle cultuur media uit alle putten.
   Opmerking: Rest medium of vloeistoffen in de microfluïdische kanalen hebben geen invloed op de fixatie door het geringe volume van 1 − 2 μL.
2. Voeg 25 μL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS toe aan alle perfusie inlaat (Figuur 1b, a1 en C1) en uitlaat putten (Figuur 1b, a3 en C3). Incureren gedurende 10 min bij RT. plaats het apparaat onder een lichte hoek (± 5 °) om de stroming te induceren (bijvoorbeeld door een zijde van de plaat op een deksel te plaatsen).
3. Aspirate PFA uit de putten. Was alle perfusie-inlaten en uitgangen tweemaal met 50 μL van de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hank. Aspirate HBSS van Wells.
4. Permeabilize bij RT gedurende 10 minuten door toevoeging van 50 μL 0,2% nietionogene oppervlakteactieve stof aan alle perfusie-inlaten en-uitgangen.
5. Aspireren de nonionische oppervlakteactieve stof uit putten. Was de perfusie kanalen tweemaal door 50 μL HBSS toe te voegen aan alle perfusie inlaat-en uitlaat putten. Aspirate HBSS van Wells.
6. Vlek de kernen met behulp van Hoechst (1:2000) en F-actin met behulp van phalloidin (1:200) in HBSS. Bereid 2,2 mL voor 40 eenheden en voeg 25 μL toe aan elke perfusie inlaat en uitlaat goed. Plaats de plaat onder een lichte hoek en inincuberen bij RT gedurende ten minste 30 minuten.
7. Was tweemaal met 50 μL HBSS in alle perfusie-inlaten en-uitgangen.
8. Direct beeld met behulp van een fluorescerende Microscoop met geautomatiseerd podium of bewaar de plaat beschermd tegen licht bij 4 °C voor later gebruik.

Resultaten

Het microfluïdische 3D-celkweek platform bestaat uit 40 geperfundeerd microfluïdische eenheden (Figuur 1a, b), die wordt gebruikt om angiogene kiemen van geperfundeerd micro vaten te bestuderen tegen een gedessineerde collageen-1 gel (figuur 1c). Deze micro vaten worden continu geperfectiongebruikt en blootgesteld aan een gradiënt van angiogene groeifactoren (Figuur 3a-d). De angiogene spruiten kunnen worden onderzocht 2 dagen na gradiënt blootstelling of gekweekt gedurende meer dan 5 dagen na gradiënt blootstelling aan studie anastomose en Sprout stabilisatie (Zie tijdlijn, figuur 1d).

Het seeden van de IPSC-ECs met behulp van de passieve pomp methode moet resulteren in homogene zaaien dichtheden (figuur 4a, b). De cultuur onder voortdurende perfusie resulteerde in een confluente micro vaten in 2-dagen, waarbij de cellen volledig de omtrek van het microfluïdische kanaal en de vorming van een confluente monolaag tegen de gedessineerde collageen-1-gel hebben gevoerd.

Blootstelling aan een gradiënt van angiogene factoren resulteerde in directionele angiogene kiemen van de micro vaten in de gedessineerde collageen-1 gel (figuur 5a-g). Clear Tip celvorming en invasie in de collageen-1 gel was zichtbaar 24 h na toevoeging van de angiogene gradiënt, terwijl stalken cellen inclusief lumen vorming zichtbaar waren na 48 h (figuur 5a).

Na fixatie en kleuring kan het capillaire netwerk worden gevisualiseerd met behulp van phalloidin om F-actin te beits en Hoechst 33342 te gebruiken om de Nucleus te vlekken (Figuur 5b, c). Deze spruiten kunnen worden gekwantificeerd (bijv. vorm en lengte¹⁴). Zonder toevoeging van groeifactoren, mag geen invasie in de collageen-1 gel worden waargenomen (figuur 5d). Confocale beeldvorming werd gebruikt om de kiem diameter te bepalen en om de lumen vorming te bevestigen (figuur 5e-g).

De spruiten groeien verder naar de richting van de gradiënt en bereiken het tegenovergestelde perfusie kanaal binnen 3 − 4 dagen na toevoeging van angiogene groeifactoren. Dit resulteert in de verbouwing van het vasculaire netwerk, met een duidelijke afname van het aantal angiogene spruiten (Figuur 6a). Lumen vorming werd beoordeeld door perfusie van het vasculaire netwerk met fluorescently gelabelde macromoleculen (bijv. albumine of dextrans). Perfusing de micro vaten met 0,5 mg/mL gelabelde albumine vóór en na anastomose onthulde een duidelijk verschil in ontkiemen permeabiliteit na 10 min (Figuur 6b-e), wat suggereert dat de capillairen stabiliseren en rijpen na anastomose.

Figuur 1: Microfluïdisch celcultuurprotocol voor door iPSC afgeleide micro vaartuigen. a) de bodem van het microfluïdische celkweek apparaat wordt weergegeven met de 40 microfluïdische eenheden die onder de 384-goed plaat zijn geïntegreerd. Grotere weergave toont een van de 40 microfluïdische eenheden. b) elke microfluïdische eenheid wordt onder 9 putjes met 3 inlaat putten en 3 uitlaat putten geplaatst. De microfluïdische kanalen worden gescheiden door ribbels (' phaseguides '), die het patroon van hydrogels in het centrale kanaal (' gelkanaal ') mogelijk maken, terwijl er nog steeds contact is met de aangrenzende kanalen (' perfusie kanalen '). c) methode voor het kweken van een geperfundeerd micro-vat binnen het microfluïdische apparaat, dat wordt gebruikt om gradiënt aangedreven angiogene kiemen te bestuderen door middel van een gedessineerde collageen-1 matrix. d) tijdlijn voor de studie van angiogene kiemen en/of anastomose. Dit cijfer is gewijzigd van van duinen et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: laadprocedures voor gel en medium. a) voorbeelden van correcte en onjuiste geldepositie. Correcte archivering resulteert in een gedessineerde collageen-1 gel in het middelste kanaal, dat vervolgens gepolymeriseerd wordt. b) voorbeelden van correcte en onjuiste vulling van de putten. Putten worden gevuld in de volgorde van 1 − 4 om luchtbellen te voorkomen binnen de microfluïdische kanalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: continue hydrostatische druk aangedreven stroming en gradiënt stabilisatie. a) de hydrostatische drukverschillen tussen putten resulteren in passieve nivellering en debiet binnen de microfluïdische kanalen. b) het plaatsen van het apparaat op een rocker platform ingesteld op 7 ° en 8 min cyclustijd resulteert in continue bi-directionele perfusie binnen de microfluïdische kanalen. c) gradiënten worden gevormd door de invoering van twee verschillende concentraties binnen de putten, die voortdurend worden vernieuwd door passieve nivellering. d) verlopende visualisatie met behulp van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran. Bi-directionele stroming stabiliseert de gradiënt tot 3 dagen. Schaalbalk = 200 μm. Dit cijfer is gewijzigd van van duinen et al.¹⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: passieve pomp methode voor het zaaien van cellen. a) passief pompen wordt gedreven door drukverschillen die worden veroorzaakt door verschillen in oppervlaktespanning. Dit resulteert in een stroom van de druppel (hoge inwendige druk) naar het reservoir (lage inwendige druk). b) tijdsverloop van een druppel (grijze omtrek) die bovenop de inlaat (witte omtrek) van het microfluïdische kanaal (blauwe omtrek) wordt geplaatst. Vlak na de optelling (figuur 4b, i) krimpt de druppel bovenop de inlaat (figuur 4b, II: 1 s na optelling; IV: 2 s na optelling), wat resulteert in een stroom naar de uitlaat. Dit gaat door totdat de druppel meniscus wordt vastgemaakt door de inlaat (figuur 4b, IV). Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: robuuste 3D-spruiten van iPSC-EC-micro vaten. a) in de loop der tijd uit te spruiten van IPSC-EC. Micro vaten werden geteeld voor 48 h (rechts) en vervolgens gestimuleerd met een angiogene cocktail met 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P en 2 ng/mL PMA. De eerste tip-cellen die de collageen-1-steiger (midden) binnendringen zijn zichtbaar 24 h na blootstelling. De eerste lumen zijn zichtbaar (pijlen) 48 h na belichting (rechts) terwijl de punt-cellen verder zijn gemigreerd in de richting van het verloop. (b) array van 15 micro vaten die gedurende 2 dagen met VEGF, S1P en PMA werden gestimuleerd en gekleurd voor F-actin (geel) en kernen (blauw). Schaal staaf = 200 μm. (c) gestimuleerd microvat (positieve controle). d) ongestimuleerd microvat (negatieve controle). e) de maximale projectie van één enkel capillair in de gel. (f) zelfde als (g) maar gericht op het midden. Gestippelde lijn geeft de positie aan van de orthogonale weergave in paneel g. schaal staven (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: visualisatie van angiogene Sprout permeabiliteit voor en na anastomose. a) anastomose met een basaalkanaal activeert het snoeien en rijping van angiogene spruiten. Close-up van capillair bed op 2, 4, 6 en 7 dagen na stimulatie met angiogene groeifactoren. b) angiogene spruiten na 2 dagen na toevoeging van angiogene groeifactoren. Angiogene spruiten worden gevormd binnen gel, maar zijn nog niet aangesloten op het onderste perfusie kanaal. (c) perfusie van het micro-vat met 0,5 mg/ml albumine-Alexa 555 oplossing. Fluorescerende afbeeldingen verkregen bij 0 en 10 min. (d, e) hetzelfde als in panelen b en c, maar na 7 dagen van stimulatie. Spruiten zijn verbonden met de andere kant en vormden een Confluent Health micro vat in het basale perfusie kanaal. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Probleem	Oorzaak	Oplossing
Collageen-1 Betreed of vult het kanaal niet volledig	Collageen-1 druppel wordt niet bovenop de inlaat geplaatst	Plaats de druppel voorzichtig boven op de inlaat van het gelkanaal
	Volume collageen-1 is te laag	Gebruik 1,5 μL van de gel om het kanaal volledig te vullen
	Collageen-1 is te visceus	Gebruik een andere batch van collageen-1
Collageen-1 stroomt in perfusie kanalen	Collageen-1 wordt direct in de inlaat van het gelkanaal gepipetcoat	Plaats de druppel voorzichtig boven op de inlaat van het gelkanaal
Collageen-1 is niet helder/vezel vorming	Collageen-1 wordt niet goed opgeslagen	Bewaar collageen-1 bij 4 °C, niet bevriezen
	NaHCO3 en Hepes zijn niet goed gemengd voor het toevoegen van collageen-1	Meng de NaHCO3 en Hepes zorgvuldig door pipetteren voordat u het collageen-1 toevoegt
Druppel niet krimpen met behulp van passieve pomp methode	Druppel aan de zijkant van de put	Aspirate druppel en voeg nieuwe druppeltjes bovenop de inlaat
		Zorg ervoor dat de uitlaat goed is gevuld met ten minste 20 μL
Er wordt geen ontspruiten waargenomen	Groeifactoren worden niet toegevoegd of aliquots worden niet goed opgeslagen	Bereid het verse angiogene kiem medium voor
	Luchtbellen blokkeert perfusie/gradiënt vorming	Verwijder luchtbellen met een P20 of P200 pipet
	Volume verschillen tussen Wells	Volumes in alle putjes moeten gelijk zijn om een lineair verloop te vormen
Cellen niet levensvatbaar	Plaat niet geplaatst op Rocker platform/Rocker platform uitgeschakeld	Zorg ervoor dat het rocker platform is ingeschakeld en de juiste cyclustijd/hoek heeft (8 min/7 °)
	Geen perfusie mogelijk door aanwezigheid van luchtbellen	Verwijder luchtbellen met een P20 of P200 pipet
Er worden geen lumen gevormd, cellen migreren als afzonderlijke cellen	Angiogene kiem mengsel werd toegevoegd voordat een monolaag werd gevormd	Wacht nog eens 24 uur voordat u de angiogene groeifactoren toevoegt
Grote variatie in kiem dichtheid	Verschillen in celdichtheden na zaaien	Controleer of de celdichtheid homogeen is en vergelijkbaar is tussen microfluïdische eenheden. Voeg indien nodig nog een druppel celsuspensie toe

Tabel 1: veelvoorkomende fouten oplossen.

Discussie

Deze methode beschrijft de cultuur van 40 perfbruikbare endotheliale micro vaten binnen een robuust en schaalbaar microfluïdisch celcultuurplatform. Vergeleken met traditionele 2D-en 3D-celkweek methoden, laat deze methode zien hoe een fysiologische relevante cellulaire micro omgeving met verlopen en continue perfusie kan worden gecombineerd met 3D-celcultuur met adequate doorvoer voor screening Doeleinden.

Een van de grote voordelen ten opzichte van vergelijkbare microfluïdische assays is dat deze methode niet afhankelijk is van pompen voor perfusie, maar een rocker platform gebruikt om continue perfusie in alle microfluïdische eenheden tegelijk te induceren. Dit zorgt ervoor dat de assay robuust en schaalbaar is: platen kunnen op een rocker platform worden gestapeld. Belangrijk is dat alle microfluïdische eenheden individueel adresseerbaar blijven, waardoor deze methode kan worden geïmplementeerd binnen de geneesmiddelen screening, inclusief het genereren van een dosis-responscurve. Bovendien, zonder een pomp, is beeldvorming en medium vervanging veel eenvoudiger met minder risico op (kruis) verontreiniging.

Een ander voordeel van deze methode is het gebruik van een gestandaardiseerd, pre-gefabriceerd platform, terwijl vergelijkbare microfluïdische celculturen door de eindgebruikers moeten worden vervaardigd. Deze beschikbaarheid vergemakkelijkt de aanneming van deze test onder andere academische en farmaceutische onderzoeksgroepen, wat leidt tot standaardisatie. Ook, in tegenstelling tot microfluïdische prototypes, zorgt de 384-well plate-interface voor compatibiliteit met de huidige labapparatuur (bijv. aspiratoren, plaat handlers en multikanaalspipetten), waardoor de integratie binnen de huidige screening-infrastructuur wordt vergemakkelijkt .

Er zijn verschillende kritische stappen in het uitvoeren van deze test. De collageen-1 gel moet het gelkanaal volledig vullen. Tijdens het laden van de gel kan deze vulling worden waargenomen door de microfluïdische kanalen te inspecteren via het observatie venster (Figuur 2a) of door de plaat ondersteboven te spiegelen (zoals weergegeven in Figuur 1a). Tijdens het vullen moet de collageen gel in het middelste kanaal blijven, zonder in aangrenzende perfusie kanalen te vloeien. We merkten dat de kwaliteit van de collageen-1 gel cruciaal is voor de juiste assay prestaties. Collageen-1 batches met een te hoge viscositeit zullen leiden tot onvolledige vulling van het gelkanaal. Na 10 minuten polymerisatie bij 37 °C moet de gel homogeen en helder zijn. Als collageen-1 niet goed wordt opgeslagen (bijv. als gevolg van fluctuerende temperaturen in de koelkast), zal collageen in de kanalen polymeriseren met duidelijk zichtbare vezel vorming. Dit kan resulteren in de invasie van de ECs in de gel zonder toevoeging van angiogene factoren, maar zonder de juiste lumen ontwikkeling.

Wanneer de cellen worden gesest, wordt de fibronectin coating oplossing uit de putjes verwijderd, waardoor alleen de microfluïdische kanalen gevuld met coating oplossing. Aspiratie van de coating oplossing van microfluïdische kanalen kan leiden tot een verstoring van de gel of gel aspiratie. De celsuspensie moet deze coating oplossing vervangen/verplaatsen. Dit werkt het beste wanneer de celsuspensie wordt verdeeld met behulp van de passieve pomp methode, omdat het rechtstreeks pipetteren van de celsuspensie in de kanalen minder reproduceerbare zaaien dichtheden vertonen.

Omdat de micro vaten een stabiele monolaag vormen tegen de gel, resulteren deze kleine verschillen alleen in verschillende tijden die nodig zijn om confluentie te bereiken. Zo wordt het beginpunt van de test bepaald door confluentie in plaats van cultuur tijd. Indien nodig kan de kweektijd worden verlengd totdat er een duidelijke monolaag is gevormd tegen de gel.

In de putten kunnen luchtbellen worden gevangen door een onjuiste vulling van de putjes (Zie Figuur 2b). Deze luchtbellen zullen de stroom van het medium beperken, zelfs wanneer het apparaat op een rocker-platform wordt geplaatst, en resulteren in instorting van het microvat en onjuiste gradiënt vorming. Het indrukken van de pipetpunt tegen de zijwand van de putjes zal het succes van het volledig vullen van de put vergroten. Als er een luchtbel in de putjes zit, kan deze worden verwijderd door zachtjes een steriele pipetpunt in de glazen bodem te plaatsen. Luchtbellen kunnen ook voorkomen in de microfluïdische kanalen. Wanneer medium is verwijderd uit de putten, is de verdamping van het medium merkbaar van de microfluïdische kanalen na 30 min (vanwege de microliter volumes binnen de kanalen). Zo worden middelgrote veranderingen bij voorkeur zo snel mogelijk uitgevoerd. Wanneer medium wordt toegevoegd in een kanaal met verdampte medium, zullen luchtbellen worden gevangen in de microfluïdische kanalen. Deze luchtbellen binnen de microfluïdische kanalen kunnen handmatig worden verwijderd door een P20-pipet direct op de inlaat of uitlaat te plaatsen en het medium via de microfluïdica van de tegenovergestelde put te forceren. Succesvolle verwijdering van de luchtbellen resulteert in een kleine maar merkbare afname van het volume in de andere put. Tabel 1 geeft een overzicht van veelvoorkomende fouten en het oplossen ervan.

Het ontbreken van een pomp is een beperking wanneer continue beeldvorming vereist is, omdat het rocker platform de gebruiker beperkt tot het beeld met opeenvolgende tijdsintervallen. Bovendien, de perfusie van medium in dit platform bestaat uit bi-directionele stroom met lage niveaus van shear stress, terwijl de vasculatuur in vivo wordt blootgesteld aan unidirectionele stroom met hogere niveaus van shear stress. Hoewel we geen negatieve effecten waarnemen van de bi-directionele stroming met betrekking tot het angiogene spruitstuk, is stroming een belangrijke biomechanische stimulans en bij voorkeur gecontroleerd. Hoewel er in de handel verkrijgbare pomp opstellingen zijn, blijft de interfacing met de 384-well plate uitdagend en pomp opstellingen de schaalbaarheid van deze test ernstig belemmeren.

De mogelijkheid om iPSC-ECs te gebruiken om angiogene spruiten te bestuderen, opent nieuwe kansen in ziekte modellering en drugs onderzoek. In tegenstelling tot de primaire ECs, deze cellen kunnen worden gegenereerd in bijna onbeperkte hoeveelheden met een stabiel genotype en met behulp van genoom Editing technieken, cellen kunnen worden gegenereerd die met inbegrip van genen Knockouts en knock-ins. Echter, als de protocollen om ECs te onderscheiden van iPSC zijn relatief nieuw, het is nog onduidelijk wat leidt tot iPSC-ECs dat beste weerspiegelen primaire ECs en welke subtypen van EG zijn of kunnen worden gegenereerd. Ook zijn er nog resterende vragen over hun relevantie. Bijvoorbeeld, doen iPSC-ECs nog steeds vertonen de plasticiteit die typisch is voor endotheliale cellen? En in welke mate reageren iPSC-afgeleide cellen op en communiceren met hun cellulaire micro omgeving? Het gestandaardiseerde platform gepresenteerd hier kan worden gebruikt om een aantal van deze vragen te beantwoorden om verder te valideren het gebruik van iPSC-afgeleide ECs in vitro.

De meest ongecompliceerd toekomstige richting voor deze test is de integratie van andere celtypen die een belangrijke rol spelen tijdens angiogenese, zoals pericytes en macrofagen. Dit vergemakkelijkt het vermogen om de rol van macrofagen te bestuderen tijdens anastomose tussen kiemgroenten of de hechting van pericytes na capillaire vorming. Ook is het mogelijk om verschillende andere celtypen binnen of tegen een extracellulaire matrix te kweken (bijvoorbeeld, we hebben de cultuur van neuronen en verschillende epitheliale structuren zoals proximale tubuli en dunne darmen aangetoond), die kunnen worden gecombineerd met de vasculaire met deze methode gegenereerde bedden. Ten slotte zal het interessant zijn om angio geen kiemen in synthetische hydrogels te bestuderen, omdat hun gedefinieerde samenstelling de standaardisatie van de assay verder verhoogt en het afstemmen van stijfheid en bindende motieven mogelijk maakt die de interacties van de celmatrix beïnvloeden.

Concluderend toont deze methode de haalbaarheid van de iPSC-afgeleide ECs in een gestandaardiseerde en schaalbare 3D-angiogene test die fysiologische relevante cultuuromstandigheden combineert in een platform dat de vereiste robuustheid en schaalbaarheid heeft om te worden geïntegreerd in de infrastructuur voor geneesmiddelen screening.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2-10 μL Electronic repeater pipette	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3-baans OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA in PBS	Alfa Aesar	J61899
Basal culture medium	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pipettte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL in milliQ water
HBSS	Gibco	14025-050
Hoechst	Molecular Probes	H3569	10 mg/mL oplossing in water
iPSC-derived endothelial cells	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Rocker platform gebruikt om flow te bieden
Pen/Strep	Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg/mL in DMSO
PMA	Focus-Biomolecules	10-2165	2 μg/mL in PBS bevattende 0,1% DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM in methanol bevattende 1% azijnzuur
TRITC-albumine	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μg/mL in water bevattende 0,1% BSA