Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC). Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De voorbereiding van hoge-kwaliteit muis oog secties voor Immunohistochemistry (IHC) is van cruciaal belang voor de beoordeling van de netvlies structuur en functie en voor het bepalen van de mechanismen ten grondslag liggen aan het netvlies ziekten. Het handhaven van structurele integriteit in het weefsel preparaat is van vitaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare retinale IHC gegevens, maar kan uitdagend zijn als gevolg van de kwetsbaarheid en complexiteit van het netvlies cytoarchitecture. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin de retinale structuur optimaal te bewaren, belemmeren zij vaak IHC analyse door de achtergrond fluorescentie en/of afnemende antilichaam-epitope interacties, een proces te verbeteren dat als epitope masking wordt bekend. Milder Fixatieven, aan de andere kant, zoals 4% Paraformaldehyde, vermindert de achtergrond fluorescentie en epitope-masking, nauwgezette dissectie technieken moeten worden gebruikt om het netvlies structuur te behouden. In dit artikel presenteren we een uitgebreide methode om muis oculaire achterste cups voor IHC die voldoende is om de meeste antilichaam-epitope interacties te behouden zonder verlies van retinale structurele integriteit te bereiden. Wij omvatten vertegenwoordiger IHC met antilichamen aan diverse retinale cel type tellers om weefsel behoud en richtlijn onder optimale en sub-optimale voorwaarden te illustreren. Ons doel is het optimaliseren van IHC studies van het netvlies door het verstrekken van een compleet Protocol van oculaire posterior Cup dissectie IHC.
Inleiding
Immunohistochemistry (IHC) is een krachtige techniek voor het lokaliseren van specifieke eiwitten en cellulaire structuren in weefsels in situ1,2,3. Ongepaste fixatie methoden en sub-optimale afdeling van complexe weefsels kan verstoren weefselstructuur, het genereren van hoge achtergrond vlekken of te verminderen antilichaam-epitope interacties, wat resulteert in vlekken artefacten en daaruit voortvloeiende verkeerde interpretatie van IHC gegevens4. Als de gewervelde Retina is een complex en zeer georganiseerd neuraal orgaan bestaat uit lagen van onderling verbonden fotoreceptoren, interneuronen en ganglioncellen, het is zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verstoord tijdens de dissectie en de sectie. Een gedetailleerd, gestandaardiseerd, en gevalideerd Protocol van muis oog dissectie en oriëntatie naar immunokleuring zal helpen aanzienlijk verminderen IHC artefacten, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten en waardoor meer accurate vergelijkende gegevens Analyse.
Er zijn vele protocollen voor weefsel voorbereiding voor IHC, echter, niet zijn allen geschikt voor netvlies weefsel. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin behouden de netvlies structuur tijdens dissectie en sectioning5. Helaas, sterke Fixatieven vaak leiden tot de versterkte achtergrond fluorescentie en epitope masking als gevolg van de chemische modificatie van epitopes6. Aan de andere kant, mildere Fixatieven, net als 4% Paraformaldehyde (toppunt) kan verlichten sommige van deze artefacten, maar vereisen nauwgezette dissectie en het delen van de optimale retinale structuur te behouden. Het snel doordringen van het gaasweefsel, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, verminderend het risico van epitope masking. Sinds korte tijd is de incubatie van het middel een vrij milde fixatie, vereisen de weefsels vaak het snelle bevriezen om antigenen te bewaren. Het is belangrijk om te voorkomen dat ijs kristalvorming tijdens het bevriezen van weefsels als ze vervormen en beschadiging van de integriteit van cellen en weefsels7.
Hier beschrijven we gedetailleerde en gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, fixatie, en Cryo-bescherming van de muis oculaire achterste cups die consistente en betrouwbare IHC gegevens opleveren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de nationale instituten van de gezondheidsgids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die door het Instituut voor laboratorium dierlijke hulpbronnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en het gebruik Comite van de Universiteit van Pennsylvania.
Alle gereedschappen en apparatuur voor de methoden worden weergegeven in Figuur 1 en vermeld in de tabel van materialen.
1. Muis Eye enucleation, Eye Cup dissectie, en inbedding
- Euthanaseren muizen met kooldioxide (CO2), gevolgd door een onthoofding (postnatale muizen P0-P11) of cervicale dislocatie (Adult > P11 muizen). Voor P0-P14 muizen, zijn de ogen bedekt door de huid. Zorg ervoor dat de huid te verwijderen voordat de volgende stappen.
- Markeer de temporele deel van het oog (Figuur 2a) door een beetje branden het hoornvlies met behulp van een staart cauterizer. Vermijd het branden van een gat in het hoornvlies door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde met de cauterizer.
- Onmiddellijk enucleate muis ogen met behulp van gebogen Dumont #5/45 Tang. Incubeer gedurende 15 min in een 1,5 mL cryotube buis met 1 mL van 4% Paraformaldehyde (speels) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op het ijs.
- Na 15 min in 4%-punt, breng het vaste oog met behulp van de gebogen Tang Dumont #5/45 naar een aangepaste 35 mm dissectie schotel (Zie tabel van materialen en figuur 1c) gevuld met PBS en plaats onder ontleden Microscoop.
- Maak een kleine incisie op het brandmerk, loodrecht op en net boven de limbus (grens van het hoornvlies) met behulp van de micro-mes.
- Steek de gebogen schaar in de incisie en voer een omtrek snede van het hoornvlies na de limbus (Figuur 2b).
- Verwijder het hoornvlies en pak de lens met een dunne Dumont #5 Tang, (Figuur 2b) en til het delicaat weg van het achterste gedeelte van het oog. Het glaslichaam, de heldere gel die de ruimte tussen de lens en het netvlies vult, zal komen met de lens (Figuur 2b) en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste Eye Cup. Zorg ervoor dat er geen zichtbare schade aan het netvlies, zoals gaten of tranen (figuur 2c).
- Was het oog cups tweemaal in 1 mL PBS voor 10 min bij kamertemperatuur.
- Cryoprotect het oog cups door equilibrating ze in een oplossing van 15% sacharose in PBS overnachting bij 4 ° c tot de Eye Cup zinkt
- Breng de Eye cups naar 30% sacharose in PBS voor 2-3 h tot de Eye Cup daalt.
- Embed de Eye cups in OCT in 10 x 10 mm cryomolds (Figuur 3a). Met behulp van een ontleden Microscoop, oriënteren het oog in de cryomold langs de dorsale-buik-as (figuur 2D, Figuur 3a) door het roteren van het oog tot het branden merk is op de top, de oogzenuw is aan de linkerkant en de cut-out deel van de mal gezichten het recht ( Figuur 2D). Zorg ervoor dat bubbels in de buurt van het weefsel te vermijden.
Opmerking: om de Eye Cup te manipuleren, gebruik dan een titanium sonde gemaakt van een titanium draad bevestigd aan een pipet tip. - Om het netvlies te breken, dompel de cryomold gedurende ten minste 5 min in een metalen beker met isopentane en plaats het bekerglas in vloeibare stikstof of droog ijs/100% ethanol bad (tot 1/3 van de hoogte van de metalen beker).
Let op: de cryomold moet worden ondergedompeld in isopentane tot meer dan de helft van de hoogte, maar hoeft niet volledig onder te dompelen. - Verwijder het bevroren blok en wikkel het in aluminiumfolie.
- Opslag bij-80 °C.
- Markeer de bevroren blok met behulp van een pen of Sharpie om de oriëntatie van het blok (Figuur 3b) vast te leggen.
2. Secties met een cryostat
- Na het aanpassen van de cryostat temperatuur (tussen-20 en-25 ° c), laat de mallen met de embedded Eye cups equilibrate aan de cryostat temperatuur voor 1 uur.
- Installeer het blok met dorso-buik oriëntatie (figuur 3c) en snijd 10 µm dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvlies secties op geannoteerde en genummerde Microscoop dia's.
- De dia's van de opslag in schuif dozen bij-20 °C of-80 °C tot IHC procedures.
3. Fluorescentie immunokleuring met het schuif rek
Opmerking: de dia rack systeem (bijv. Sequenza) houdt de glazen Microscoop dia's met een afdekplaat, het creëren van een ~ 100 µ L capillaire kloof tussen de dia en de plaat.
- Ontdooi de Cryo-secties bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h tot 4 uur om ze te laten drogen en hechten aan Microscoop dia's.
Let op: het is ook mogelijk om ze te drogen bij 30-37 °C voor 30 min tot 1 uur. - Plaats dia's in dia rek en was de retinale secties tweemaal in 100-200 µ L PBS voor 2 min.
- Permeabilize de netvlies secties door incubatie hen in 0,25% Triton-X/0,05% NaN3in PBS voor 5 min bij RT.
- Voeg 100 µ L van het blokkeren van oplossing voor de dia's.
- Voeg 100 µ L van primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing voor de dia's.
- Incubeer retinale secties overnachting op 4 ˚ C.
Opmerking: gedurende deze tijd, bedek de dia rek om uitdroging van de secties te voorkomen. - Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min, gebruikend 200 µ L PBS.
Nota: de toevoeging van 0,001-0,002% Triton-X100 aan PBS (PBS-T) staat een strengere was toe maar kan sommige membranen en cellulaire structuren verstoren. - Incubeer retinale secties in fluorescerende-gelabelde secundaire antilichamen voor 1 h bij RT. Van nu af aan te beschermen tegen licht.
- Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min.
- Incubeer de netvlies secties op RT voor 5 min met een nucleaire marker zoals Hoechst 33342 of DAPI oplossing.
- Was de netvlies secties 1 keer voor 15 minuten.
- Plaats een dekglaasje op de top van een papieren handdoek op het lab bankje.
- Voeg 2 druppels anti-fading montage media naar het midden van de dekglaasje.
- Draai de schuif om de retinale Cryo-sectie naar beneden te hebben.
- Voorzichtig Monteer de dekglaasje langzaam, op een ~ 45 ˚ hoek, tip de dia op de montage media.
Opmerking: het vermijden van het vormen van bubbels als je de dia op zijn plaats lager. - Breng zelfs druk, met behulp van een zware boek of catalogus (zie hieronder), om de dia-dekglaasje combinatie om overtollige montage media te elimineren.
Nota: om consistentie in steekproefvoorbereiding te verzekeren, gebruik altijd het zelfde voorwerp, (d.w.z., het zelfde boek of de catalogus) om zelfs druk aan de dekglaasje tijdens dia montage toe te passen. - Houd plat en laat verharden 's nachts op RT in het donker. Op te slaan dia's plat bij 4 °C voor onbepaalde tijd.
- Beeld via breed veld of confocale fluorescentie microscopie (Figuur 4).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te illustreren hoe deze protocollen, zorgen voor een optimale retinale bewaring voor IHC, we probed netvlies secties van P28 WT muizen (C57BL/6N) met antilichamen tegen rhodopsine (een fotoreceptor marker)8, glutamine acid decarboxylase 65 (Gad65, een amacrine cel marker)9, glutamine SYNTHETASE (GS, een Müller-cel marker)10, en calbindin (een horizontale cel marker)11 (F...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Muis Retina dissectie is een delicaat proces te wijten aan de kleine omvang en de vorm van muis ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies weefsel. Hoewel het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige dissectie is een kwestie van de praktijk, met een gedetailleerd protocol, het verstrekken van efficiënte methoden en tips is een noodzaak om het netvlies secties en IHC te verkrijgen. In aanvulling op de hier beschreven protocollen, zijn er verschillende tips die het mogelijk maken voor een consistente hoge kwaliteit netvlies s...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen onthullingen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door fondsen van NIH (RO1-GMO97327) en de Universitaire Stichting van het onderzoek (UPenn). Wij danken Svetlana Savina vooral voor haar hulp bij de ontwikkeling van het Immunohistochemistry protocol, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) en de Penn vet Imaging Core voor hulp bij microscopie en Leslie King, Ph.D. voor kritisch lezen van dit manuscript .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6qt. Roestvrij stalen beker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | Voor vloeibare stikstof (Figuur 1E) |
| Aluminiumfolie | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | Om de oogoriëntatie te markeren (Figuur 1A) |
| Gebogen pincetten, Dumont #5/45 pincetten, 45-graden gebogen | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | Voor enucleatie en onderhoud van muizenogen (Figuur 1A) |
| Gebogen schaar, Vannas Spring Scissors - 2,5 mm snijrand | Fine Science Tools | #15002-08 | Om de cornea omtrent te snijden (Figuur 1B) |
| 35 mm dissectiebak bedekt met tandheelkundig was | Voor het dissekeren van de oogbeker (Figuur 1C) | ||
| Dissectiemicroscoop | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives - Plastic Handgreep | Fine Science Tools | #10315-12 | Om een kleine insnijding te maken bij de brandplek (Figuur 1A) |
| Roze tandheelkundig was | Electron Microscopy Sciences | #72660 | Voor het coaten van de dissectiebak |
| Glijmiddel en dekplaat | Ted Pella | #36107 | Voor retinale IHC (Figuur 1G) |
| Roestvrij stalen beker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | Voor isopentaanbad (Figuur 1E) |
| Styrofoam doos | Voor geïsoleerde koelbox | ||
| Dunne pincetten Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | Om de cornea te verwijderen en de lens te extraheren (Figuur 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Microscopy Sciences | #62534-10 | Vorm voor OCT-inbedding |
| Buffers en reagentia | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Blockingoplossing | 2% normaal paardenserum, 1,5% koude vishuidjegel (bij 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovien serumalbumine (cat #AK1391-0100) in permeabilisatiebuffer. | ||
| Gelvatol (anti-fade mounting media) | Onder de afzuigkap 0,337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) oplossen in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Aanpassen naar pH 8-8,5 met 12N HCl (~ 5 druppels). Bewaren in een amberkleurig druppelflesje bij 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Geportioneerd en bewaard in het donker, bij 4°C voor maximaal 1 jaar of bij -20°C voor langetermijnopslag. Bereid vers op 1 ug/mL (1x) |
| Isopentaan, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Vloeibare stikstof | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Verversen van 4% PFA uit 16% PFA stock. Bewaar de resterende 16% PFA bij 4°C in het donker. |
| Permeabilisatieoplossing | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Vers bereiden. | ||
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4, pH 7,4. Bereid uit 10x stock |
| Sucrose oplossingen | Fisher Scientific | #S-5-500 | Los het juiste bedrag sucrose op in 37°C PBS (neemt ~15 min om op te lossen). Kan een paar dagen bewaard worden bij 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antilichamen | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Om horinzotale cellen te labelen |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Om GABAerge amacrine cellen te labelen |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | Om Müller cellen te labelen |
| anti-rhodopsine | Millipore | MAB5316 | Om staafjes te labelen |
Referenties
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
