Methodenartikel

Beoordeling van de vasculaire Toon responsiviteit met behulp van geïsoleerde mesenterica slagaders met een focus op modulatie door Perivasculaire vetweefsel

DOI:

10.3791/59688

⸱

3 juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology and the Department of Pharmacology and Pharmacy, University of Hong Kong

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft het gebruik van draad myography te evalueren van de Transmurale isometrische spanning van mesenterica slagaders geïsoleerd van muizen, met speciale aandacht voor de modulatie door factoren vrijkomen van endothelial cellen en perivasculaire vetweefsel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De veranderde vasculaire Toon ontvankelijkheid aan pathofysiologische stimuli draagt tot de ontwikkeling van een brede waaier van cardiovasculaire en metabolische ziekten bij. Endothelial dysfunctie vertegenwoordigt een belangrijke boosdoener voor de verminderde vasodilatation en verbeterde vasoconstrictie van slagaders. Vetweefsel rond de slagaders spelen een belangrijke rol in de regulatie van endoteel ontspanning en/of samentrekking van de vasculaire gladde spiercellen. De cross-Talks tussen de endoteel en perivasculaire vetweefsel kunnen worden beoordeeld ex vivo met behulp van gemonteerde bloedvaten door een draad myography systeem. Er moeten echter optimale instellingen worden vastgesteld voor slagaders die afkomstig zijn van dieren van verschillende soorten, leeftijden, genetische achtergronden en/of pathofysiologische aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dilataties en vernauwingen van slagaders worden bereikt door versoepelingen en samentrekkingen, respectievelijk, van hun vasculaire gladde spiercellen. Veranderingen in de vasculaire responsiviteit van kleine slagaders bijdragen aan de homeostatische regulatie van arteriële bloeddruk door autonome zenuwen en hormonen aanwezig in het bloed (bijv. catecholamines, angiotensine II, serotonine, vasopressine). Op plaatselijk niveau, worden de vasculaire reacties van vlotte spiercellen gemoduleerd door signalen van zowel de endothelial cellen van intima als het vetweefsel dat de slagaders omringt (Figuur 1).

De endoteel is niet alleen een passieve barrière, maar dient ook als een oppervlak om signalen tussen het bloed en de onderliggende vasculaire gladde spiercellen uit te wisselen. Door het vrijgeven van verschillende vasoactieve stoffen, de endoteel speelt een cruciale rol in de lokale controle van vasculaire Toon reacties1. Bijvoorbeeld, in reactie op acetylcholine, endothelial stikstofmonoxide synthase (eNOS) wordt geactiveerd in de endoteel te produceren stikstofmonoxide (NO), die versoepeling van de onderliggende vasculaire gladde spier induceert door het activeren van oplosbare guanylyl cyclase (sGC) 2. andere vasoactieve stoffen omvatten de producten van cyclooxygenases (bijv. prostacycline en Tromboxaan A2), lipoxygenase (bijv. 12-hydroxyeicosatetraenoic zuren, 12-hete), en cytochroom P450 monooxygenases (HETEs en epoxyeicosatrienoic zuren, Eet's), reactieve zuurstofsoorten (ROS), en vasoactieve peptiden (b.v., endothelin-1 en angiotensine II), en endoteel-afgeleide hyperpolarizing factoren (EDHF)3. Een delicaat evenwicht tussen endoteel-afgeleide vasodilatoren en vasoconstrictoren handhaaft de lokale vasomotorische Toon4,5.

Endothelial dysfunctie wordt gekenmerkt door de bijzondere waardevermindering in endoteel-afhankelijke vasodilatation6, een kenmerk van vasculaire veroudering7. Met de leeftijd, het vermogen van endoteel te bevorderen vasodilatation wordt geleidelijk verlaagd, grotendeels te wijten aan een verminderde geen biologische beschikbaarheid, evenals de abnormale expressie en functie van eNOS in de endoteel en sGC in de vasculaire gladde spiercellen8 , 9 , 10. verminderde geen biologische beschikbaarheid potentiates de productie van endoteel-afhankelijke vasoconstrictoren11,12. In de leeftijd van slagaders, endothelial dysfunctie veroorzaakt hyperplasie in de media, zoals weerspiegeld door de duidelijke stijgingen van de wanddikte, het aantal mediale kernen, die doen denken aan de arteriële verdikking in hypertensie en atherosclerose waargenomen in de menselijke patiënten13,14. Bovendien pathofysiologische voorwaarden zoals zwaarlijvigheid, diabetes of hypertensie versnellen de ontwikkeling van endothelial dysfunctie15,16.

Perivasculaire vetweefsel (PVAT) releases tal van adipokines te reguleren vasculaire structuur en functie17. Het anti-samentrekbaar effect van PVAT wordt gemedieerd door ontspannende factoren, zoals adiponectine, no, waterstofperoxide en waterstofsulfide18,19,20. Echter, afhankelijk van de locatie en pathofysiologische conditie, PVAT ook kan verbeteren samentrekbaar reacties in verschillende slagaders21. De Pro-samentrekbaar substanties die door PVAT worden geproduceerd omvatten angiotensine-II, leptin, resistin, en Ros22,23.  In de meeste van de studies over geïsoleerde bloedvaten, is PVAT beschouwd als een eenvoudige structurele steun voor de vasculatuur en dus verwijderd tijdens de voorbereiding van bloedvat ringsegmenten. Aangezien vet dysfunctie vertegenwoordigt een onafhankelijke risicofactor voor hypertensie en de bijbehorende cardiovasculaire complicaties24, moet de PVAT rond de bloedvaten worden overwogen bij het onderzoek naar de vasculaire responsiviteit van verschillende slagaders.

De multi wire myograph systemen zijn op grote schaal gebruikt om de vasomotorische functies van een verscheidenheid van bloedvaten te onderzoeken, met inbegrip van de aorta, mesenterica, renale, femorale, cerebrale en coronaire slagaders25,26. De hierin beschreven protocollen zullen gebruik maken van draad myography om vasculaire responsiviteit te evalueren in mesenterica slagaders geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muismodellen, met een speciale focus op de modulatie door PVAT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren die voor de volgende studie werden gebruikt, werden verstrekt door de proefdier eenheid van de Faculteit der Geneeskunde, de Universiteit van Hongkong. De ethische goedkeuring werd verkregen door het departementale comité voor het gebruik van proefdieren voor onderwijs en onderzoek (CULATR, nr.: 4085-16).

1. preparaten

  1. Bereiding van drugs
    1. Bewaar drugs op de juiste wijze, zoals vermeld in het Material Safety Data Sheet (MSDS) onmiddellijk na ontvangst ervan. Los de geneesmiddelen in poedervorm in oplosmiddelen als High-concentratie voorraad oplossingen en vervolgens hoeveelheid voor opslag bij-20 ° c.
      Nota: de meeste drugs worden opgelost in gedistilleerd water om de voorraadoplossingen voor te bereiden; Verwarming of sonication kan nodig zijn voor sommige geneesmiddelen. Als de drugs niet volledig in water oplossen, kan een daling van 1 M NaOH worden toegevoegd, terwijl voor basis drugs een daling van 1 M HCl kan worden gebruikt. Hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) of absolute ethanol. In deze laatste gevallen moet de uiteindelijke concentratie van het bad (in M) bekend zijn en moeten passende controles worden uitgevoerd om de effecten van de oplosmiddelen uit te sluiten.
    2. Voorafgaand aan het experiment, Los de drug fracties (tabel van materialen) in Krebs-Ringer bicarbonaat oplossing (Krebs) met 115 mm NaCl, 4,6 mm KCl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mM MgSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glucose en 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
    3. Voor de cumulatieve concentratie-respons curven, de voorraden en werkoplossingen van verschillende geneesmiddelen door seriële verdunningen (tabel 1) voor te bereiden.
  2. Het instrument instellen
    1. Kalibreer de kracht omvormer voor alle kanalen voordat u het myograph systeem op elke dag, of elke keer dat het systeem is verplaatst.
      Opmerking: de gedetailleerde kalibratie procedure varieert afhankelijk van het model. In het algemeen, een twee-gram gewicht wordt toegepast op de kaken en de overeenkomstige kracht moet 9,81 ± 0,1 mN. Als de lezing is uitgeschakeld door meer dan 0,1 mN, moet de transducer opnieuw worden gekalibreerd. Voor het systeem dat in dit protocol wordt gebruikt (Zie de tabel met materialen) moeten de bedrijfswaarden voor de kracht omvormer tijdens de kalibratie tussen 3000 en 3500 liggen. Als de waarde van de omvormer hoger of lager is, moet de kracht omvormer worden vervangen.
    2. De Bevestigingssteunen in elke kamer aanpassen en uitlijnen. Het ononderbroken en herhaalde gebruik van de myograph kamer kan sommige verkeerde opstelling van de steun veroorzaken, die occasionele aanpassing vóór experimenten vergt om ervoor te zorgen dat de kaken behoorlijk worden gericht.
      Opmerking: speciale aandacht is nodig bij het aanpassen van de Bevestigingssteunen als de kracht transducers zijn zeer gevoelig en kwetsbaar.
    3. Schakel kachels en gas (95% O2 en 5% Co2) ten minste 30 min voor het experiment om de kamers en buffers worden opgewarmd tot 37 ± 0,1 °c en geëquilibreerd met het gasmengsel.
      1. Controleer de temperatuur op de thermometer om de nauwkeurigheid van de kachel te garanderen. Temperatuur kan worden aangepast aan koeling of opwarming experimenten lopen. Als de temperatuur niet correct is ingesteld, past u de offset functie van de machine toe om de instellingen te verhogen of te verlagen om de gewenste temperatuur te bereiken.
    4. Aan het einde van het experiment, schoon alle kamers en zet de kachel en het gas loopt naar de Setup.
      1. Draai het gas niet uit voordat alle vloeistof in de kamer is gezogen uit het systeem, anders is het zuur/gedistilleerd water kan uitspugen en de orgel-kamer te bereiken tijdens het volgende gebruik.
      2. Voor het reinigen van de kamers van de draad myograph, de meest effectieve manier is het uitvoeren van zuur-wassen met behulp van een verdunde azijnzuur oplossing. Reinig de rand en de binnenkant van de kamers met een wattenstaafje.
      3. Na het wassen, spoel de kamers grondig met gedestilleerd water. Veeg de buitenkant van de kamers met een natte doek om gedroogd zout te verwijderen. Ethanol kan ook worden gebruikt als hydrofobe drugs zijn gebruikt tijdens het experiment.
      4. Een voorbeeld van de was procedure is als volgt. Vul de kamers met 8% azijnzuur oplossing en incubeer voor 2 min. gebruik een wattenstaafje applicator om het stalen kamer oppervlak mechanisch schoon te maken. Vermijd contact met het aluminium gedeelte van de myograph.
      5. Aspireren het azijnzuur en was de myograph kamer en ondersteunt meerdere malen met gedistilleerd water en droog de oppervlakken met behulp van absorberend papier of katoen-tip applicators.
  3. Dissectie van de mesenterica arteriële ringen
    Nota: de dieren die voor de huidige studie worden gebruikt waren high-fat dieet gevoede mannelijke Adipo-SIRT1 muizen en wild type nestgenoten als controles. Elk dier woog ongeveer 45 g op het tijdstip van de experimenten.
    1. Euthanaseren de muis door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (50 mg/kg).
    2. Met chirurgische schaar en Tang, voer een mid-line laparotomie om de abdominale inhoud te onthullen.
    3. Verzamel de mesenterica arcade in een silicium-gecoat Petri schaaltje.
    4. Verspreid en PIN vaststelling van de mesenterica netwerk in de Petri schaal te onthullen de vertakking van mesenterium en bindweefsel trabekelnetwerk.
    5. Onder een microscoop (10x), en met fijn-schaar en Tang, zorgvuldig ontleden uit de omliggende bindweefsel. Voorkom beschadiging van de adventitial laag. Als alternatief kan de omliggende vetweefsel worden bewaard rond het bloedvat voor experiment (indien nodig).
    6. Met behulp van de fijne scharen en tangen, accijnzen de secundaire takken van mesenterica slagaders in ijskoude Krebs-buffer.
      Opmerking: elke onderzoeker moet zijn/haar eigen set van dissectie Kit, snaren en stijgbeugels. Deze instrumenten moeten goed worden gehouden en schoongemaakt-up elke keer na het experiment als sommige geneesmiddelen zijn moeilijk weg te spoelen en residu kan vasthouden aan hen.
      1. Houd de bloedvaten in koude Krebs buffer, terwijl het scheiden van de omliggende bindweefsel, met inbegrip van PVAT. Tijdens de behandeling van het bloedvat, wees voorzichtig om onnodige schade aan de endoteel te voorkomen.
      2. Als het experiment de studie van PVAT impliceert, behoud een 1,5 tot 2 mm-diameter bol van PVAT rond het bloedvat. Als alternatief kunnen dezelfde hoeveelheden vetweefsel worden toegevoegd in elke kamer om te experimenteren.
    7. Optionele Verwijder de endoteel uit de ontledene bloedvat als een controle om de endoteel-afhankelijkheid van de reacties te evalueren. Voor mesenterica slagaders, verwijder de endoteel door zachtjes rollen het over een draad stijgbeugel of een haar.
    8. Snijd het bloedvat bereid als hierboven in kleine ringen (~ 2 mm lengte) en leg ze in een plastic schaal vol met belucht (95% O2 en 5% Co2) Krebs-buffer voor de daaropvolgende montage in de kamers van een draad myograph27.
    9. Breng het schip ringen in een myograph kamer geplaatst onder de Microscoop. De ringen zouden gelijk moeten worden geplaatst, met de hogere en lagere stijgbeugels parallel. De hechtdraad (40 µm) moet nieuw worden voorbereid als drugs kunnen binden aan de snaren.
    10. Rijg de bloedvaten ring op een geschikte lengte (2 cm) van de draad en veilig om een kaak van de montagekamer door schroeven om de positie vast te stellen.
    11. Passeer een tweede draad door de ring en anker aan de tegenovergestelde kaak.
    12. Met ringen schroefdraad en bevestigd aan de kamer kaken, Monteer de kamer op de myograph Setup en draai de micrometer schroef rechtsom om de draden dicht bij elkaar totdat de kracht lezing op de User Interface die overeenkomt met de kamer gemonteerd is nul of gewoon Hieronder.
      Opmerking: de draad aan de bovenste kaak moet worden van minimale lengte om ervoor te zorgen dat de spanning volledig kan worden transduced aan de detector.
    13. Equilibrate de voorbereidingen op 37 °C gedurende ten minste 30 minuten vóór de eerste toepassing van kracht met behulp van de verstelbare micrometer.
    14. Beoordeel de levensvatbaarheid van het weefsel in 115 mM hoog kalium (NaCl vervangen door KCl op een Molar basis) Krebs met 4,6 mM NaCl, 115 mM KCl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mm MgSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3 en 11,1 mM D-glucose bij pH 7,4.
      Opmerking: geïsoleerde vaartuigen worden beschouwd als levensvatbaar als de samentrekbaar kracht transduced en geregistreerd als afbuiging boven de baseline in de data-opname-software van de myograph systeem is meer dan 40% van hun rust Toon, in reactie op een samentrekbaar agent. Als de slagader niet adequaat contract, dan is ofwel de optimale basale spanning/muur druk niet goed is aangepast of de slagader kan zijn beschadigd tijdens de isolatie of de montage van het schip.
    15. Optionele Beoordeel de integriteit van endothelial cellen door het toepassen van fenylefrine om samentrekking van het schip te induceren tot 50% van de eerste reactie op KCl (zoals geregistreerd door de Force transducer in de data-opname-software), gevolgd door toevoeging van 1 µ M acetylcholine.
      Opmerking: een goede bloedvaten voorbereiding is cruciaal voor het verkrijgen van consistente en accurate resultaten. Een preparaat mag niet worden gebruikt voor het experiment, hetzij als de endothelial Integrity Test is onbevredigend of het niet reageert op KCl, wat aangeeft dat endothelial functie of vasculaire gladde spier contractiliteit, respectievelijk, zijn niet bevredigend. In dit geval moet het preparaat worden vervangen door een nieuwe ring van hetzelfde bloedvat of een nieuw bloedvat.

2. normalisatie om de optimale aanvankelijke spanning te bepalen

Opmerking: de normalisatieprocedure kan de bepaling van de optimale interne diameter (IC) van de slagaders waarbij het bloedvat ervaart een geschikte rust Transmurale druk (100 mmHg of 13,3 kPa voor mesenterica slagaders) en produceert maximale actieve krachten in reactie op vasoactieve agenten.

  1. Schakel de computer in en open de software voor het opnemen van gegevens (Zie de tabel met materialen).
  2. Sla het experiment op als een "LabChart-gegevensbestand" met een nieuwe naam om te voorkomen dat het oorspronkelijke instellings bestand wordt overschreven.
  3. Open het venster normalisatie-instellingen en stel de k -factor in als 1. Accepteer de standaardwaarden voor oculair kalibratie (0,3, als de lengte van het vaartuig onbekend is, of 1 als de lengte van het vaartuig bekend is), doel druk (13,3), online gemiddelde tijd (2) en vertragingstijd (60). Klik op OK om de instellingen op te slaan.
  4. Selecteer kanalen van belang en voer de draad diameter (40 µm), weefsel eindpunten (a1:0; a2: weefsel lengte zoals gemeten), de eerste micrometer lezing in het normalisatie venster.
  5. Start de normalisatieprocedure door de toepassing van de eerste passieve rek op het bloedvat (draai de micrometer schroef tegen de klok in).
  6. Wacht tot het schip te stabiliseren (3 min) en de input van de nieuwe micrometer lezing in het normalisatie venster. De wandspanning wordt automatisch berekend en weergegeven als een punt op de grafiek.
    Opmerking: de micrometer "stappen" gebruikt tijdens de passieve stretch hoeft niet hetzelfde te zijn. De eerste paar stukken kunnen worden 20 µm elk. Naarmate de stukken dichter bij de isobaar lijn komen, kunnen de stappen worden teruggebracht tot 10 µm, 5 µm, 2 µm of zelfs kleiner. Hebben de belangrijkste grafiekvenster te openen terwijl het aanpassen van de micrometer-instellingen-als een grote Spike overschrijding van de isobaar lijn op een lengte/spanning grafiek (die wijst op punten van druk die overeenkomt met een vooraf bepaalde waarde) verschijnt, vermindering van de spanning.
  7. Na elke passieve rek, vervang de controle Krebs met een ISO-osmotische hoge kalium Krebs met 115 mM KCl. Wanneer de samentrekking een plateau (ongeveer 3 min) bereikt, registreert de actieve kracht (F) door de passieve kracht bij elk rek van de kalium-geactiveerde kracht af te trekken. Bereken de wandspanning en de interne omtrek (IC) waarden.
    1. Meet de actieve spanning als de afbuiging boven de basislijn. De actieve spanning (T) wordt berekend op basis van de vergelijking F (mN) = T (mN/mm) x 2 x vaartuig lengte (mm). Interne omtrek (IC) waarden worden berekend op basis van de micrometer gegevens (IC = 205,6 µm + 2 x "gap").
  8. Verwijder de hoge kalium aandoening door vervanging met verse Krebs. Herhaal het wassen voor drie keer meer dan 5 minuten.
  9. Herhaal stap 2,5 tot 2,8 (door het opwekken van passieve rek, gevolgd door een actieve contractie in afwisselende bochten) totdat de actieve spanning begint te dalen (Figuur 2).
  10. Na meerdere rondes van alternatieve rek, de passieve lengte/spanning bochten geven de waarde van IC100, de interne omtrek van het schip bij een Transmurale druk van 100 mmHg, als het kruispunt met de isobaar lijn.
    Opmerking: elke micrometer waarde tijdens de passieve rek wordt handmatig ingevoerd in de software normalisatie module. Het programma registreert automatisch de overeenkomstige krachtmeting om de passieve lengte/spannings kromme te produceren, die de waarde van IC100 als kruispunt met de isobaar lijn (Figuur 2, juiste panelen) geeft. Hoe dichter het laatste punt is om de isobaar lijn, maar net boven de betere normalisatie is zonder beschadiging van de schepen. Een punt te ver boven de isobaar lijn kan fysiek schade aan het gemonteerde schip, waardoor onbetrouwbare resultaten tijdens het experiment.
  11. Maak de actieve lengte/spanning bochten om IC1 waarden te bepalen en bereken de normalisatie k factor als de verhouding van IC1/IC100, die zal worden gebruikt voor dit type bloedvaten in de daaropvolgende myography experimenten.
    Opmerking: de actieve lengte/spanning bochten worden gemaakt door het plotten van de IC-waarden berekend op basis van de micrometer gegevens op de x-as en actieve spanningen op de y-as. De IC1 is de waarde die binnen de Peak plateau regio ligt (rode sporen in Figuur 2, rechts panelen). Na het plotten van de actieve lengte/spanning bochten en het bepalen van IC1, de normalisatie k factor wordt berekend als de verhouding van IC1/IC100. Op basis van de normalisatie k factor, de optimale IC voor baseline, aangeduid als IC1, zal laten zien op de passieve lengte/spanning curve. De micrometer instelling voor deze IC verschijnt onder de curve en moet worden gebruikt om de micropositioneer set voor de daaropvolgende myography experimenten. De initiële spanning (T) is gelijk aan de doel druk (PI) x IC/2π en de optimale kracht (F) toegepast op het schip is gelijk aan T x 2 x vaartuig lengte.
  12. Grondig wassen van de hoge kalium Krebs en equilibrate de voorbereidingen voor nog eens 30 tot 45 min. reset de basale spanningen op "nul", zodat alleen actieve samentrekbaar reacties zullen worden geregistreerd tijdens het daaropvolgende experiment.

3. fenylefrine-geïnduceerde weeën

Opmerking: geneesmiddelen die kunnen worden geselecteerd voor het induceren van de vasoconstrictive reacties omvatten de niet-specifieke adrenoceptor agonist noradrenaline, de selectieve α-1 adrenoceptor agonist fenylefrine, het peptide hormoon angiotensine II, en de monoamine neurotransmitter 5-hydroxytryptamine. Fenylefrine wordt gebruikt in het huidige protocol voor onderzoek (tabel van materialen).

  1. Bereid en monteer gepaarde arteriële ringen zoals beschreven in punt 1,3, een met PVAT intact en de andere met PVAT verwijderd, uit de aangrenzende delen van elke slagader voor het experiment.
  2. Na normalisatie (beschreven in sectie 2), pre-contract de arteriële segmenten met een hoge kalium Krebs buffer door toevoeging van 115 mM KCl oplossing voor de kamer met Krebs.
  3. Wachten op contractie naar Plateau (3 min), wassen de hoge kalium en vervangen door verse beluchte Krebs-buffer. Herhaal het wassen drie keer meer dan 5 minuten.
  4. Herhaal de KCl stimulatie en het wassen drie keer en registreer de maximale samentrekbaar reactie/spanning te KCl door aftrekken van de baseline spanning van de spanning als gevolg van KCl stimulatie.
  5. Na de laatste samentrekking en wassen, vul de kamer met warme, beluchte Krebs buffer en laat de slagader te herstellen voor ongeveer 30 minuten voor het uitvoeren van de volgende taak.
  6. Aan elke kamer, voeg cumulatieve bedragen van fenylefrine (half-log stappen van 10-10 tot 10-4 M) om de concentratie-afhankelijke stijgingen van isometrische spanning van de rustige voorbereidingen te induceren.
  7. Begin met het toevoegen van een lage concentratie van de agonist aan de kamer. Na het toestaan van voldoende tijd voor een stabiele samentrekking (3 tot 5 min), voeg de volgende concentratie. Herhaal de stappen met toenemende concentraties van fenylefrine.
  8. Na het toevoegen van de laatste dosis van agonist (fenylefrine), spoel het medicijn grondig en vul de kamer met verse Krebs-buffer. De concentratie-afhankelijke reacties plots als een verhoging van de percentages van de KCl-geïnduceerde maximale contracties (Figuur 3).
  9. Optionele Ter beoordeling van de bijdrage van Nee, Incubeer de preparaten met de NO synthase remmer, L-naam (10-4 M), gedurende 30 minuten voorafgaand aan de toevoeging van fenylefrine. L-naam verbetert fenylefrine-geïnduceerde samentrekkingen in de rustige voorbereidingen van mesenterica slagaders (Figuur 4).
    Nota: de inhibitors of de antagonisten moeten voldoende tijd hebben om evenwicht te bereiken, gewoonlijk 30-45 min (ben verenigbaar voor om het even welke reeks experimenten).
  10. Voor het uitvoeren van een tweede concentratie-respons curve sequentieel, was de kamer volledig en herhaaldelijk om alle van de vorige agonisten te verwijderen, totdat er geen verdere veranderingen in de Toon worden waargenomen.
    Opmerking: parallelle experimenten blootstelt ten minste twee ringen verkregen uit hetzelfde bloedvat aan de agonist, een onder controle voorwaarden en een in de aanwezigheid van de remmer (s); in elke ring wordt de concentratie-respons curve slechts één keer uitgevoerd. Het is de voorkeur aan parallelle experimenten uit te voeren, omdat dit zorgt voor een betere controle voor de werking van de drug en bloedvaten gevoeligheid. Seriële experimenten krijgen een concentratie-respons curve aan een agonist in een enkele ring; wassen het uit, het veranderen van de experimentele omstandigheden (bijv. het toevoegen van een remmer), en vervolgens herhalen van de concentratie respons curve op dezelfde ring. In dit geval, tijd controles zijn nodig om aan te tonen dat de Drug reacties niet te wijten zijn aan veranderingen van het weefsel in de tijd. Men kan nooit zeker zijn dat het weefsel in precies de zelfde staat na blootstelling aan een concentratie-reactie experiment is. Voldoende tijd (ten minste 30 – 60 min) moet worden gegeven om het schip segmenten om terug te keren naar hun rust (basale) spanning, hoewel in sommige gevallen, kan dit niet direct na dissociatie van de hoge affiniteit agonist van de receptoren. Daarnaast kan een hoge kalium Krebs worden toegepast tussen de cumulatieve concentratie-respons bochten te verminderen desensibilisatie28. Vergeet niet dat de meeste antagonisten niet volledig kan worden uitgewassen, dus blijven toevoegen voor de rest van het experiment.

4. endoteel-afhankelijke versoepelingen/contracties

  1. Pre-contract een vers gemonteerde arteriële segment (zoals beschreven in de stappen 3,2 tot en met 3,5). Nogmaals, Registreer de maximale samentrekbaar reactie/spanning te KCl door aftrekken van de baseline spanning van de spanning als gevolg van KCl stimulatie.
  2. Optionele Incubeer de preparaten met de NO synthase remmer, L-naam (10-4 M), gedurende 30 minuten voorafgaand aan de toevoeging van U46619.
  3. Voeg de vooraf berekende concentraties van U46619 aan de kamer toe en laat een stabiele, aanhoudende samentrekking van de slagader segmenten toe.
    Opmerking: Vasodilatory reacties worden geïnduceerd in mesenterica slagaders vooraf gecontracteerd tot ongeveer 80% van de maximale reacties op 115 mM KCl. verschillende agonisten kunnen worden gebruikt om weeën op te wekken door activering van hun specifieke receptoren. Hier worden de bloedvat segmenten met of zonder PVAT vooraf gecontracteerd met U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Tabel van materialen), een tromboxaan a2-receptor agonist, om stabiele en aanhoudende soepele spiersamentrekkingen te induceren.
  4. Voeg cumulatieve concentraties van acetylcholine (10-10 tot 10-4 M) toe aan de orgaan kamer. Concentratie-afhankelijke vasodilatory reacties van slagader segmenten worden gepresenteerd als percentage van U46619-geïnduceerde samentrekbaar Reacties (Figuur 5).
    Nota: voor het grootste deel van het experiment, zou de volgende concentratie van de ontspannende agonist onmiddellijk moeten worden toegevoegd wanneer een plateau wordt waargenomen om rebound in spanning te verhinderen. Concentratie-afhankelijke vasodilatory reacties van slagader segmenten zijn genormaliseerd als percentage van U46619-geïnduceerde samentrekbaar reacties aan te passen voor kleine verschillen in innervatie en de diameter tussen de slagader segmenten (Figuur 5). Kleine veranderlijkheid in responsiviteit tussen individuele ringen verkregen uit hetzelfde bloedvat worden minimaal wanneer een groep van zes of meer experimenten statistisch worden geanalyseerd. Bij het uitdrukken van antwoorden als percentage van de eigen maximale samentrekkingen van het individuele weefsel, is het wenselijk een gepaarde analyse te gebruiken (bijv. de t-toets van de gepaarde student) om de antwoorden van hetzelfde soort weefsels van verschillende dieren te vergelijken reacties van een enkel weefsel voor en na een interventie. Bij het analyseren van de effecten van PVAT, wordt in twee richtingen ANOVA gebruikt, gevolgd door multiple-vergelijkende test.
  5. Na het toevoegen van de laatste dosis van de ontspannende agonist, verwijder het medicijn uit elke kamer en vullen met verse Krebs-buffer. Was de kamer grondig met Krebs buffer en laat de slagader te stabiliseren voor ten minste 45 min voor het uitvoeren van eventuele extra experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek van de lengte/spanning relaties te verkrijgen van de normalisatie factor k

De hoeveelheid rek toegepast op een schip segment beïnvloedt de omvang van de actine-myosine interactie en dus de maximale actieve kracht ontwikkeld. Zo is voor elk type bloedvat, het bepalen van de hoeveelheid rek die nodig is voor maximale actieve kracht is vereist voor een goede myography studies. Hier, normalisering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afgezien van de endothelial cellen, signalen afgeleid van PVAT spelen een belangrijke rol in de regulering van gladde spiertonus reactiviteit30. Gezonde PVAT releases geen en anti-inflammatoire adiponectine om een anti-samentrekbaar effect op de slagaders uit te oefenen, die verloren is gegaan onder pathologische omstandigheden zoals obesitas en metabool syndroom31,32. In ziektetoestanden, PVAT draagt bij tot de ontwikkeling van endothelia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel gesteund door de subsidies van de Raad van de toelage van het onderzoek van Hong Kong [17124718 en 17121714], het gezondheids-en medische Fonds van het onderzoek van Hong Kong [13142651 en 13142641], het Samenwerkingsfonds van het onderzoek van Hong Kong [C7055-14G], en de nationale basis Het programma van het onderzoek van China [973 programma 2015CB553603].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetylcholineSigma-AldrichA6625Voorraadconcentratie: 10-1 M
Werkconcentratie: 10-10 tot 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-AldrichN5751Voorraadconcentratie: 3 x 10-2 M
Werkconcentratie: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Voorraadconcentratie: 10-2 M
Werkconcentratie: 10-10 tot 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)EnzoBML-PG023-0001Voorraadconcentratie: 10-5 M
Werkconcentratie: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myographDanish MyoTechnology (DMT)620M
PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Adipo-SIRT1 wild type miceLaboratory Animal Unit, The University of Hong KongCULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishesDanish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wiresDanish MyoTechnology (DMT)300331
Surgical tools

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153(1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3(2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415(2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200(2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Draadmyografie systeemIsometrische conditiePassieve rekHoog kalium KrebsFenylefrineconcentratieL NAME inhibitieLengte spanningsrelatie

Gerelateerde artikelen