Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Samenvatting

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Samenvatting

De ziekte van Parkinson (PD) wordt veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM). Cel vervangende therapie heeft een grote belofte voor de behandeling van PD. onlangs, geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs) zijn ontstaan als een potentiële kandidaat voor cel vervangende therapie als gevolg van het verminderde risico van tumorvorming en de plasticiteit te geven aanleiding tot regiospecifieke neuronen en glia. iNSCs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe somatische cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (Pbmnc's) en verschillende andere soorten cellen. Vergeleken met andere soorten somatische cellen, zijn Pbmnc's een aantrekkelijk starter celtype vanwege het gemak om te openen en uit te breiden in cultuur. Sendai virus (SeV), een RNA-niet-integratief virus, coderen van herprogrammeer factoren, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc, heeft een negatief gevoel, enkel-streng, niet-gesegmenteerd genoom dat niet integreert in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering. In deze studie beschrijven we een protocol waarin iNSCs worden verkregen door het herprogrammeren van Pbmnc's, en onderscheiden in gespecialiseerde VM DA neuronen door middel van een tweetraps methode. Dan worden DA-precursoren getransplanteerd in eenzijdig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD-Muismodellen om de veiligheid en werkzaamheid voor de behandeling van PD te evalueren. Deze methode biedt een platform voor het onderzoeken van de functies en therapeutische effecten van patiënt-specifieke DA neurale cellen in vitro en in vivo.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) is een gemeenschappelijke neurodegeneratieve aandoening, veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM), met een prevalentie van meer dan 1% in de populatie van meer dan 60 jaar oud ^{1 , 2}. in de afgelopen tien jaar, cel therapie, gericht op hetzij het vervangen van de degeneratieve of beschadigde cellen, of het voeden van de micro omgeving rond de ontstellende neuronen, heeft aangetoond potentieel in de behandeling van PD³. Ondertussen heeft herprogrammeerings technologie aanzienlijke vooruitgang geboekt⁴, die een veelbelovende cellulaire bron voor vervangende therapie biedt. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en embryonale stamcellen (Esc's) zijn bewezen in staat te zijn om te differentiëren in DA neurale cellen, die kunnen overleven, matureren en de motorische functies verbeteren wanneer ze worden geënt in rat en niet-humane primaat PD-modellen^{5 ,6,7,8}. iPSCs vormen een mijlpaal in cellulaire herprogrammeer technologieën en hebben een groot potentieel in celtransplantatie; echter, er is nog steeds een bezorgdheid over het risico van tumorvorming van de niet volledig gedifferentieerde cellen. Een alternatieve cellulaire bron voor celtransplantatie is stamage-gepleegde volwassen stamcellen verkregen door directe herprogrammering, zoals geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs), die kunnen worden afgeleid van de instabiele tussen producten, het omzeilen van de pluripotentie etappe^9,10,11.

Zowel ipscs als inscs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (pbmnc's) en diverse andere soorten cellen^12,13,14, waardoor de immunogeniciteit van getransplanteerde cellen in hoge mate. Bovendien, in vergelijking met iPSCs, iNSCs zijn inherent aan verminderde risico van tumorvorming en Lineage-geëngageerde plasticiteit, alleen in staat om te differentiëren in neuronen en glia¹¹. In de eerste studies werden de ipscs en inscs van mensen of muizen gegenereerd uit fibroblasten verkregen uit huid biopsieën, wat een invasieve ingreep^14,15is. Met dit respect zijn Pbmnc's een aantrekkelijke starter celbron vanwege het minder invasieve bemonsteringsproces en het gemak om grote aantallen cellen te verkrijgen binnen een korte periode van expansie tijd¹⁶. Initiële herprogrammering studies gebruikt integratieve leveringssystemen, zoals lentivirale of retrovirale vectoren, die efficiënt en gemakkelijk te implementeren in vele soorten cellen¹⁷; Deze toedieningssystemen kunnen echter mutaties en reactivatie van residuele transgenen veroorzaken, die veiligheidsproblemen voor klinische therapeutische doeleinden¹²opleveren. Sendai virus (SeV) is een niet-integratief RNA-virus met een negatief gevoel, enkel-streng genoom dat niet wordt geïntegreerd in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering^{18 ,19}. Recombinant SeV vectoren zijn beschikbaar die herprogrammering factoren bevatten, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc in hun open reading frames. Bovendien kunnen SeV-virale vectoren verder worden verbeterd door temperatuurgevoelige mutaties in te voeren, zodat ze snel kunnen worden verwijderd wanneer de cultuur temperatuur wordt verhoogd tot 39 °C²⁰. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opnieuw programmeren van PBMNCs naar iNSCs met behulp van het SeV-systeem.

Veel studies hebben gemeld afleiding van da neuronen van menselijke ESCs of ipscs met behulp van verschillende methoden^6,8,21. Er is echter een tekort aan protocollen die de differentiatie van DA-neuronen van iNSCs in Details beschrijven. In dit protocol beschrijven we de efficiënte generatie van DA neuronen van iNSCs met behulp van een tweetraps methode. De DA neuronale precursoren kunnen worden getransplanteerd in het striatum van PD Muismodellen voor de veiligheid en werkzaamheid evaluaties. Dit artikel zal een gedetailleerd protocol dat betrekking heeft op verschillende stadia van de generatie van geïnduceerde neurale stamcellen door Sendai virus, differentiatie van iNSCs in DA neuronen, oprichting van muis PD modellen, voor transplantatie van de voorlopers van de DA in het striatum presenteren. van de PD-modellen. Met dit protocol kan men iNSCs van patiënten en gezonde donoren genereren en DA-neuronen afleiden die veilig, standaardiseerbaar, schaalbaar en homogeen zijn voor celtransplantatie doeleinden, of voor het modelleren van PD in een gerecht en onderzoek van de mechanismen onderliggende ziekte aanvang en ontwikkeling.

Protocol

Alle procedures moeten de richtsnoeren van de Commissie ethiek van het institutioneel menselijk onderzoek volgen. Geïnformeerde toestemming moet worden verkregen van patiënten of gezonde vrijwilligers vóór het verzamelen van bloed. Dit protocol werd goedgekeurd door de Commissie ethiek van menselijke onderzoek en werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling voor de zorg en het gebruik van dieren.

1. inzameling, isolatie en uitbreiding van Pbmnc's

1. Verzameling van Pbmnc's
   1. Verzamel 10-20 mL perifeer veneuze bloed van de donor door venipunctie met een natrium heparinenconserverings injectieflacon.
      Opmerking: bloedmonsters moeten worden opgeslagen of verzonden bij kamertemperatuur (RT). Verwerk de bloedmonsters binnen 24 uur.
2. Bereiding van kweekmedium
   1. Bereid serumvrij medium (SFM) voor door de volgende componenten te combineren: 245 mL van Iscove gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM), 240 mL van Ham F-12,5 mL insuline-transferrin-selenium-X supplement (ITS-X), 5 mL 100x glutamine stockoplossing (tabel van Stoffen), 5 ml chemisch gedefinieerd lipide concentraat, 2,5 g foetaal runderserum, 0,025 g ascorbinezuur en 9 μL van 1-thioglycerol. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
      Let op: ascorbinezuur en 1-thioglycerol zijn giftig bij huidcontact en inademing.
   2. Om mononucleaire cel (MNC) medium te bereiden, het SFM-medium aanvullen met 10 ng/mL humaan interleukine 3 (IL-3), 2 U/mL Erytropoëtine (EPO), 100 ng/mL humane stamcel factor (SCF), 40 ng/mL humane insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1), 100 μg/mL holo-transferrin en 1 μM dexamethason. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
      Opmerking: bereid het medium onmiddellijk voor gebruik voor.
3. Isolatie van Pbmnc's
   1. UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
   2. Breng het perifere bloed (PB) over in een conische buis van 50 mL en Verdun de PB met een gelijk volume steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
   3. Bereid 15 mL gesteriliseerde dichtheidsgradiënt (tabellen van materialen) in een andere conische buis van 50 ml.
      Opmerking: Houd de dichtheidsgradiënt en PB bij RT om een betere isolatie van Pbmnc's mogelijk te maken.
   4. Kantel de conische buis met het dichtheidsgradiënt medium in een hoek van 45 ° en leg vervolgens langzaam en zorgvuldig 30 mL verdund PB op het dichtheidsgradiënt medium.
      Let op: Wees voorzichtig en laat de PB langzaam de zijkant van de conische buis op de middellaag van de dichtheidsgradiënt lopen. Rode bloedcellen zal storten op de bodem van de buis. Kantel de buis voorzichtig om verstoring van de laag interface te minimaliseren.
   5. Centrifugeer de buisjes op 800 x g gedurende 15 minuten bij RT met de centrifuge-rem ingesteld op de stand "off". Aspireren de gele, bovenste plasmalaag en gooi het weg. Breng vervolgens de witte bewolkte dunne filmlaag met Mnc's over met een pipet van 10 mL naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
      Opmerking: het omschakelen van centrifuge remmen is belangrijk voor de isolatie van Mnc's.
   6. Voeg 30 mL D-PBS toe aan de buis met Mnc's en centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en voeg vervolgens 45 mL D-PBS toe om de cellen opnieuw op te schorten. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
      Opmerking: de centrifuge-rem moet hiervoor worden ingeschakeld en de volgende stappen voor centrifugeren. Als de celpellets dicht zijn, voegt u 1-2 mL D-PBS toe om de pellets voorzichtig opnieuw op te schorten en vervolgens D-PBS toe te voegen aan 45 mL.
   7. Gooi de supernatant weg en onderbreek de cellen opnieuw met 5 mL D-PBS en Tel de levende cellen met de trypan Blue-uitsluitings methode.
   8. Na het opzij zetten van de Mnc's die nodig zijn voor uitbreiding, bevriezen de resterende cellen voor toekomstig gebruik.
      Opmerking: ten minste 5 x 10⁶ mnc's kunnen in één injectieflacon worden bevroren met 1 ml Vries medium (tabel met materialen). Het protocol kan hier worden onderbroken.
4. Uitbreiding van Mnc's
   1. Op dag-14, zaad MNCs met een dichtheid van 2-3 x 10⁶ cellen per milliliter in een goed van zes-well platen met 1,5 ml pre-opgewarmd (37 °C) mnc medium. Incuberen bij 37 °C, 5% CO₂ voor 2 dagen.
   2. Op dag-11, verzamel de cellen en het medium met een gesteriliseerde pipet en breng over naar een nieuwe conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen op 250 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en onderbreek de cellen opnieuw in 1 ml voorverwarmde (37 °C) mnc-medium.
   3. Tel de levensvatbare cellen met trypan Blue. Zaai de Mnc's met een dichtheid van 1 x 10⁶ cellen per milliliter in VOORVERWARMDE mnc medium en inincuberen bij 37 °c, 5% Co₂ voor 3 dagen.
      Opmerking: het is te verwachten dat het totale aantal cellen op dag-11 kan afnemen.
   4. Herhaal op dag 8 de stappen 1.4.2-1.4.3 en kweek de cellen gedurende 3 dagen.
   5. Herhaal op dag 4 de stappen 1.4.2-1.4.3 en kweek de cellen gedurende 3 dagen.
      Opmerking: na 14 dagen cultuur moet een gelijk of groter aantal Mnc's in de cultuur blijven.

2. herprogrammering van Pbmnc's naar iNSCs door SeV infectie

1. Bereiding van oplossing en kweekmedium
   1. Bereid een poly-D-Lysine (PDL) stockoplossing door het oplossen van 100 mg PDL met 100 mL van H₂O tot een concentratie van 1 mg/ml. Bewaren bij-20 °C in 1 mL aliquots.
   2. Bereid een insuline voorraadoplossing door het oplossen van 100 mg insuline in 20 mL 0,01 N HCl tot een concentratie van 5 mg/mL. Bewaren bij-20 °C in 1 mL aliquots.
   3. Om 200 mL iNSC basal medium te bereiden, combineren 96 mL DMEM-F12 en 96 mL basismedium (tafel van de materialen) met 2 ml 100x glutamine stockoplossing, 2 ml niet-essentieel aminozuur (neaa), 2 ml N2 supplement en 2 ml B27 supplement. Voeg 10 ng/mL recombinant humane leukemie remmende factor, 3 μM CHIR99021 en 2 μM SB431542 vóór gebruik. Filtreer het medium en bewaar het op 4 °C.
      Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken. Voeg recombinant humane leukemie remmende factor, CHIR99021 en SB431542 onmiddellijk voor gebruik.
2. Herprogrammering van Pbmnc's naar iNSCs door SeV infectie
   1. UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
   2. Op dag 0, verzamel de cellen in MNC medium en breng over naar een conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant op en onderbreek de cellen opnieuw met 1 ml VOORVERWARMDE mnc-medium.
   3. Tel de levensvatbare cellen met trypan Blue. Resuspendeer de cellen met voorverwarmde (37 °C) MNC-medium tot een concentratie van 2 x 10⁵ cellen per put in 24-Well platen.
   4. Na het verwijderen van de SeV buizen van-80 °C opslag, ontdooien de buisjes met SeV in 37 °C waterbad voor 5-10 s, en laat ze vervolgens ontdooien bij RT. Zodra ontdooid, plaats ze onmiddellijk op ijs.
   5. Voeg de SeV codering Human Klf4, Oct3/4, SOX2 en c-MyC aan de putten, bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. Centrifugeer cellen met platen bij 1.000 x g gedurende 30 minuten om het gehechtheid van cellen te vergemakkelijken. Laat de cellen en supernatant in de platen. Plaats de platen in de incubator bij 37 °C, 5% CO₂.
      Let op: alle procedures met betrekking tot SeV moeten worden uitgevoerd in een veiligheidskast en alle uiteinden en buisjes moeten vóór verwijdering met ethanol of bleekwater worden behandeld.
   6. Breng op dag 1 het medium en de cellen over in een centrifugebuis van 15 mL. Spoel de put af met 1 mL MNC medium. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant op en onderbreek de cellen opnieuw met 500 μL vers VOORVERWARMDE mnc-medium in 24-put platen.
      Opmerking: gebruik een lage bijlage 24-put plaat om te voorkomen dat de bevestiging van cellen voor het beplating op PDL/laminin.
   7. Verdun op dag 2 1 mL van 1 mg/mL PDL met 19 mL D-PBS tot een concentratie van 50 μg/mL. Jas 6-well platen met 50 μg/mL PDL voor ten minste 2 uur bij RT.
   8. Verdun 200 μL van 0,5 mg/mL laminine met 20 mL D-PBS tot een concentratie van 5 μg/mL. Aspirate PDL in de 6-well platen, en droog op de verticale schone Bank.
   9. Jas 6-well platen met 5 μg/mL laminine en inincuberen voor 4-6 h bij 37 °C. Wassen met D-PBS voor gebruik.
   10. Op dag 3, plaat de getransduceerde cellen verkregen in stap 2.2.6 in iNSC medium op PDL/laminin-Coated 6-well platen.
       Opmerking: Verplaats de platen voorzichtig indien nodig nadat de cellen op PDL/laminincoated platen zijn geplaatst, probeer de gehechtheid van de cellen niet te verstoren.
   11. Voeg op dag 5 1 mL pre-warmed (37 °C) iNSC medium in elke put in 6-well platen zachtjes toe.
       Opmerking: er wordt verwacht dat de cellen een drastische dood zullen ondergaan (> 60%).
   12. Voeg op dag 7 1 mL pre-warmed (37 °C) iNSC medium in elke put in 6-well platen zachtjes toe.
   13. Van dag 9 tot dag 28, vervang het gebruikte medium met verse voorverwarmde (37 °C) iNSC-medium elke dag. Bewaak de opkomst van iNSC-kolonies. Pick en transfer iNSC klonen voor uitbreiding in ongeveer 2-3 weken. Neem kolonies met de juiste morfologie op met behulp van gebrande glazen pipetten, met uitzondering van eventueel vervuilende cellen, en aspireren de kolonies met 200 μL tips.
       Opmerking: de gekenmerkte iNSCs kunnen worden bevroren voor toekomstig gebruik met 2-5 kolonies in één injectieflacon. Het Vries medium omvat serumvrij Basaal medium (tabel van de materialen) en Dimethylfumaraat sulfoxide gemengd met een verhouding van 9:1, die onmiddellijk voor gebruik moet worden bereid. Het protocol kan hier worden onderbroken.

3. differentiatie van iNSCs naar Dopaminerge neuronen

1. Bereiding van oplossing en kweekmedium
   1. Bereid 200 mL iNSC-differentiatie basale medium voor door 192 mL DMEM-F12 te combineren met 2 mL 100x glutamine stockoplossing, 2 mL NEAA, 2 mL N2-supplement en 2 mL B27 supplement.
      Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken.
   2. Voorbereiden iNSC differentiatie fase I medium door aanvulling van de iNSC differentiatie basale medium met 1 μM SAG1 en 100 ng/mL FGF8b.
      Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken.
   3. Voorbereiding iNSC differentiatie fase II medium door aanvulling van de iNSC differentiatie basale medium met 0,5 mM cyclisch adenosinemonofosfaat (kamp), 0,2 mM ascorbinezuur, 10 μM DAPT, 10 ng/mL hersenen afgeleide neurotrophic factor (BDNF), 10 ng/mL gliacellen afgeleid neutrofisch factor (GDNF) en 1 ng/mL transformerende groeifactor βIII (TGF-βIII).
      Opmerking: gebruik het medium binnen 2 weken.
2. Coating van de cultuur gerechten
   1. UV-steriliseren een schone bank voorafgaand aan het gebruik. Steriliseren alle oppervlakken en apparatuur met 75% alcohol. Steriliseer alle tips met behulp van een autoclaaf.
   2. Verdun voor de PDL-coating ten minste één dag voordat de cellen opnieuw worden beplating 1 mL 1 mg/mL PDL met 19 mL D-PBS tot een concentratie van 50 μg/mL. Jas 12 mm glazen dekstroken die zijn gesteriliseerd met 75% alcohol in de 24-put platen met 50 μg/mL PDL bij RT gedurende ten minste 2 uur.
   3. Verdun voor laminine coating 200 μL van 0,5 mg/mL laminine met 20 mL D-PBS tot een concentratie van 5 μg/mL. Aspirate PDL en droog de putten in de schone Bank. Mantel de 12 mm dekstroken met 5 μg/mL laminine en inincuberen voor 4-6 h bij 37 °C. Wassen met D-PBS voor gebruik.
3. Passage cellen voor differentiatie.
   1. Wanneer de samenvloeiing van gekweekte inscs 70-90% bereikt, aspiraat medium van de cultuur plaat, en voeg 1 ml D-PBS om de cellen te wassen. Voeg 1 mL voorverwarmde (37 °C) celdissociatie reagens (tabel met materialen) per put toe en incuberen bij 37 °c gedurende 3 minuten om de cellen te ontkoppelen.
   2. Na 3 minuten incubatie zijn de cellen semi-zwevend geworden; Voeg 3 mL pre-warmed (37 °C) DMEM-F12 medium per put toe en Pipetteer cellen op en neer om celpellets in afzonderlijke cellen te ontkoppelen.
   3. Breng cellen over in een conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 250 x g gedurende 3 min. zuig het supernatant op, onderbreek de cellen met het juiste volume vooraf opgewarmd (37 °C) INSC-medium volgens het aantal cellen.
   4. Tel de cellen met de trypan Blue-uitsluitings methode. Plaat 5 x 10³ cellen per 12 mm glas dekglaasje in 24-Well platen en inincuberen bij 37 °c, 5% Co₂.
4. Differentiëren iNSCs in de Dopaminerge neuronen.
   1. Begin met differentiatie 24 h na het opnieuw bekleden van de cellen op PDL/laminin-Coated dekstroken. Aspirate kweekmedium, was de cellen één keer met D-PBS, en voeg vervolgens 600 μL pre-warmed differentiatie fase I medium per goed in 24-Well platen en inbroed bij 37 °C, 5% CO₂.
   2. Verander het medium elke dag van dag 1 tot dag 10 tijdens de eerste fase van differentiatie.
   3. Op dag 10, aspireren het cultuurmedium, en was de cellen één keer met D-PBS. Voeg 600 μL voorverwarmde (37 °C) differentiatie fase II medium per goed toe in 24-put platen en inincuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
   4. Verander het medium elke andere dag van dag 11 tot dag 25 tijdens de tweede fase van differentiatie. De gedifferentieerde cellen kunnen door Paraformaldehyde op verschillende tijdstippen voor analyse worden vastgesteld.
   5. Voor immunofluorescentie kleuring moet u de cellen met D-PBS driemaal zachtjes wassen op de gekozen tijdstippen binnen differentiatie dag 11 tot en met 25.
   6. Pipetteer 300 μL van de nonionische oppervlakteactieve stof (tabel met materialen) in 100 ml PBS om een 0,3% nietionogene oppervlakteactieve stof in PBS te maken.
      Let op: nonionic oppervlakteactieve stof is toxisch door huidcontact en inademing.
   7. Repareer de cellen met 4% Paraformaldehyde gedurende 10 min bij RT. Vervolgens driemaal met 0,3% in PBS wassen.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig bij huidcontact en inademing.
   8. Blokkeer de cellen met 3% Donkey serum voor 2 uur bij RT.
   9. Verdun het primaire antilichaam in 1% Donkey serum in een geschikte concentratie en schud zachtjes om te mengen. Voeg 300 μL van de primaire antilichaam oplossing toe aan elk goed van de 24-put plaat. Incuberen de cellen bij 4 °C 's nachts. Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS.
   10. Verdun het secundaire antilichaam in 1% Donkey serum in een geschikte concentratie en schud zachtjes om te mengen. Voeg 300 μL van de oplossing voor secundair antilichaam toe aan elk goed van de 24-put plaat. Inincuberen van de cellen op RT voor 2 h, beschermd tegen licht.
   11. Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS. Verdun 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) met PBS met 1:500 verdunning. Inbroed de cellen in elk goed van de 24-goed plaat met 300 μL verdunde DAPI gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Was de cellen driemaal met 0,3% nonionische oppervlakteactieve stof in PBS.
   12. Neem voorzichtig de dekstroken uit de putjes van de platen met de Tang. Droog in het donker 's nachts op RT. Mount onder een fluorescentie Microscoop.

4. oprichting van unilaterale 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD Mouse-modellen

1. Om PD-Muismodellen voor celtransplantatie te genereren, gebruikt u volwassen mannelijke SCID-beige muizen met een gewicht van 20-25 g voor 6-OHDA injectie.
2. Voorbereiding van geneesmiddelen voor chirurgie
   1. Bereid een 0,2% ascorbinezuur oplossing door 0,2 g ascorbinezuur op te lossen in 100 mL gesteriliseerde fysiologische zout (0,9%) en bewaren bij-80 °C tot het gebruik. Op de dag van de operatie, Verdun 0,2% ascorbinezuur oplossing 10 keer om een 0,02% ascorbinezuur oplossing te verkrijgen.
      Opmerking: ascorbinezuur wordt toegevoegd om oxidatie van 6-OHDA naar een inactieve vorm te voorkomen.
   2. Om een 6-OHDA-oplossing te bereiden, weegt u de juiste hoeveelheid 6-OHDA in een gesteriliseerde 1 mL-buis en voegt u vervolgens een volume van 0,02% ascorbinezuur toe om een 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing te maken. Vortex het mengsel totdat het is opgelost. Plaats de 6-OHDA op ijs tot het gebruik.
      Opmerking: 6-OHDA is temperatuur en lichtgevoelig. Wees voorzichtig met het beschermen van de oplossing tegen licht en bewaar deze op ijs voor gebruik.
3. Bereid gesteriliseerde chirurgische apparatuur door autoclaven voor de operatie. Reinig alle apparatuur en oppervlakte gebieden met ethanol bij het instellen van het stereotaxic frame. Stel een muis herstel kooi in onder een verwarmings lamp.
4. Uitvoeren van een operatie om unilaterale 6-OHDA-lesioned Muismodellen te vestigen.
   1. Weeg elke muis, noteer het gewicht en bereken de hoeveelheid geneesmiddel die moet worden toegediend. Elke muis ontvangt 0,5 mg/kg atropine 20 min voorafgaand aan operaties. Anesthetiseer de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine.
   2. Toedienen van 0,5 mg/kg atropine door intraperitoneale injectie.
   3. Anesthetiseer de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie 20 min na toediening van atropine.
   4. Plaats de muis in een gesloten kamer. Na 3-5 min, zal de muis diep verdoerd worden zonder reactie op Hind been knijpen.
      Opmerking: verwacht wordt dat de muis die anesthesie heeft ontvangen een excitatie periode zou ervaren.
   5. Scheer het hoofd van de muis en breng erytromycine oogzalf aan op de ogen van de muis voor bescherming tegen het ontwikkelen van corneale zweren.
   6. Plaats de muis op het stereotaxus apparaat. Bevestig eerst de muis met de snijtanden-staven. Plaats de oorschelpen correct om de muis in een vlakke en veilige positie te laten gaan.
   7. Steriliseren het hoofd van de muis met Povidon jodium en isopropylalcohol. Snijd een sagittale incisie (~ 1,5 cm) op de hoofdhuid met een scalpel blad, en bloot de schedel. Pas de snijtanden-balk en de gehoor stangen aan om het hoogteverschil tussen bregma en Lambda te reduceren tot minder dan 0,1 mm.
      Opmerking: de muis bregma bevindt zich op de kruising van coronale en sagittale hechtingen, en Lambda is op de kruising van lambdoïde en sagittale hechtingen.
   8. Verplaats en verlaag de punt van de naald langzaam naar bregma en behandel de bregma als een nulpunt. Beweeg de punt naar een positie met coördinaten van A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm ten opzichte van bregma. Trek de punt in en markeer het puntje. Burr een klein gat in de schedel.
   9. Extractie van 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing in de micro spuit (tabel met materialen). Breng de naald terug naar het gemarkeerde punt en steek de naald in de D/V-3,2 mm.
   10. Injecteer 2 μL van 5 μg/μL 6-OHDA-oplossing (10 μg totaal) met een snelheid van 1 μL/min. Na injectie van 6-OHDA is voltooid, laat de naald op zijn plaats voor nog eens 5 min. Trek de injectienaald dan langzaam in.
   11. Sluit de incisie met hechtingen en breng erytromycine Eye zalf op de ogen van de muis. Lever 0,5 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen en breng een antibioticum zalf direct op de gehecht huid aan.
   12. Verwijder de muis van stereotaxic apparaat en plaats het in de herstel kooi. Zet de muis terug en geef toegang tot voedsel en water totdat het bewustzijn herwint. Behandel de muis met pijnstiller in drinkwater dagelijkse post-chirurgie voor 2-3 dagen, en een aanbevolen dosering van ibuprofen is 0,03 mg/g lichaamsgewicht per dag.
   13. Inspecteer de muis dagelijks na de operatie.

5. gedrags beoordeling na unilaterale 6-OHDA-lesioning

1. Twee tot drie weken na de operatie, gedrags beoordeling uitvoeren om PD-symptomen te schatten. Weeg elke muis, noteer het gewicht en bereken de hoeveelheid geneesmiddel die moet worden toegediend (0,5 mg/kg apomorfine voorafgaand aan de beoordeling).
2. Dien 0,5 mg/kg apomorfine toe door subcutane injectie vóór de beoordeling en plaats de muis in een glazen cilinder.
3. Na een gewennen periode van 5 minuten telt u het aantal contralaterale en ipsilaterale rotaties ten opzichte van de laesie zijde per minuut en registreert u hun activiteit met een videocamera.
4. Muizen met contralaterale minus ipsilaterale rotaties > 7 RPM/min worden beschouwd als succesvol lesioned en geselecteerd als kandidaten voor celtransplantatie experimenten. Retourneer de muizen na een rust van 30 minuten naar de behuizings kooien.
   Opmerking: als de muis met succes is lesioned, zal 6-OHDA geïnjecteerde muis een grotere bias vertonen bij het draaien naar contralaterale kant, omdat de DA agonist het supersensitive denervated striatum van de lesioned-zijde voornamelijk activeert.
5. De gedrags beoordeling uitvoeren een week voor en 2, 4, 6, 8, 12, 16 weken na transplantatie van de cel.

6. celtransplantatie van DA-precursoren

1. Bereid celsuspensie voor transplantatie. Voor celengraftment, opschorten 2 x 10⁵ da precursoren gemengd door D10 en D13 da precursoren in een verhouding van 1:7 in 4 μL van 5 g L^-1 glucose in gebalanceerde zoutoplossing (tabel van materialen) van transplantatie buffer.
2. Voer een transplantatie chirurgie uit volgens de procedures beschreven in punt 4,4, behalve dat 6-OHDA wordt vervangen door DA precursor celsuspensie of buffer.
3. Voer de gedrags beoordeling uit 2, 4, 6, 8, 12, 16 weken na de transplantatie van de DA-precursoren volgens de in punt 5 beschreven procedures. Tel het aantal apomorphine-geïnduceerde contralaterale rotaties ten opzichte van de laesie zijde per minuut en noteer hun activiteit met een videocamera.
   Opmerking: na transplantatie suggereert een gereduceerde snelheid van contralaterale rotaties een verbeterde motorische functie.
4. Bij 4, 8, 12 en 16 weken na de transplantatie van cellen, parfumeer de muis onder diepe anesthesie met 4% Paraformaldehyde totdat het lichaam van de muis stijf wordt en de lever van de muis bleek.
5. Scheid de hersenen van de muis zachtjes en zet de hersenen in 4% Paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts.
6. Op de tweede dag, zet de hersenen in 30% sucrose voor uitdroging totdat de hersenen zakt naar de bodem.
7. Snijd de hersenen op een dikte van 40 μm met behulp van een Vries microtoom.
8. Voer immunokleuring uit zoals eerder beschreven in stap 3.4.5-3.4.12.

Resultaten

Hier rapporteren we een protocol dat verschillende stadia van iNSC-DA-celtherapie behandelt om PD-modellen te behandelen. Ten eerste, PBMNCs werden geïsoleerd en uitgebreid, en opnieuw geprogrammeerd in iNSCs door SeV infectie. Een schematische weergave van de procedures met PBMNC-expansie en iNSC-inductie wordt weergegeven in Figuur 1. Op dag-14 werden Pbmnc's geïsoleerd door middel van een dichtheidsgradiënt (tabel met materialen). Vóór centrifugeren werden bloed verdund m...

Discussie

Hier presenteerden we een protocol dat verschillende stadia van iNSC-DA celtherapie voor PD-modellen bedekt. Kritieke aspecten van dit protocol zijn onder meer: (1) isolatie en uitbreiding van Pbmnc's en herprogrammering van Pbmnc's in iNSCs door SeV-infectie, (2) differentiatie van iNSCs naar DA neuronen, (3) oprichting van unilaterale 6-OHDA-lesioned PD Muismodellen en gedrags beoordeling, en (4) celtransplantatie van DA-precursoren en gedrags beoordeling.

In dit protocol omvat het eerste de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15-ml conische buis	Corning	430052
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxisch voor inademing en huidcontact
24-well plate	Corning	3337
50-ml conische buis	Corning	430828
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381
6-well plate	Corning	3516
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Celdissociatiereagens
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A92902	Toxisch bij huidcontact
B27 supplement	Invitrogen	17504044
BDNF	Peprotech	450-02	Hersenafgeleide neurotrofe factor
Bloedopvangbuisjes met natriumheparine	BD	367871
BSA	yisheng	36106es60	Fetaal bovien serum
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Dibutyryl-adenosine cyclisch monofosfaat
CellBanker 2	ZENOAQ	100ml	Gebruikt als bevriezingsmedium voor PBMNCs
Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat	Invitrogen	11905031
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
Dekglas	Fisher	25*25-2
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417-10mg
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Ezelsserum	Jackson	017-000-121
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Humaan erytropoëtine
FGF8b	Peprotech	100-25
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	P=1.077, dichtheidsgradiënt medium
GDNF	Peprotech	450-10	Glial-afgeleide neurotrofe factor
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 x Glutamine stockoplossing
Ham's-F12	Gibco	11765-054
HBSS	Invitrogen	14175079	Gebalande zout oplossing
Humaan leukemie-remmende factor	Millpore	LIF1010
Humaan recombinant SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Humaan insuline-achtig groeifactor
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Humaan interleukin 3
IMDM	Gibco	215056-023	Iscove's aangepaste Dulbecco's medium
Insulin	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Insulin-transferrine-selenium-X supplement
Knockout serum vervanging	Gibco	10828028	Serumvrij basaal medium
Laminine	Roche	11243217001
Microspuit	Hamilton	7653-01
N2 supplement	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Niet-essentieel aminozuur
Neurobasal	Gibco	10888	Basismedium
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	Poly-D-lysine
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Gene Operation	04-0010-10mg	Bewaar van licht bij -20?
Sendai virus	Life Technologies	MAN0009378
Sucrose	baiaoshengke
TGFβ?	Peprotech	100-36E	Transformatiegroeifactor β?
Transferrine	R&D Systems	2914-HT-100G
Triton X 100	baiaoshengke		Nionietisch oppervlakteactieve stof
Trypanblauw	Gibco	T10282
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126