Methodenartikel

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

DOI:

10.3791/59695

⸱

21 mei 2019

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ubiquitin-proteasome-systeem is een belangrijke regulator van eiwit degradatie en een verscheidenheid aan andere cellulaire processen in eukaryoten. In de hersenen, stijgingen van de activiteit van ubiquitin-proteasome zijn van cruciaal belang voor synaptische plasticiteit en Geheugenvorming en afwijkende veranderingen in dit systeem zijn geassocieerd met een verscheidenheid van neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen. Een van de problemen bij het bestuderen van ubiquitin-proteasome functioneren in de hersenen is dat het aanwezig is in alle cellulaire compartimenten, waarin de eiwit doelen, functionele rol en mechanismen van regulering sterk kunnen variëren. Als gevolg daarvan is de mogelijkheid om de hersenen ubiquitine eiwit targeting en proteasoom katalytische activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten binnen hetzelfde dier direct te vergelijken, essentieel om volledig te begrijpen hoe de ups bijdraagt aan synaptische plasticiteit, geheugen en ziekte. De hier beschreven methode maakt verzameling van nucleaire, cytoplasmatische en ruwe synaptische fracties van dezelfde knaagdier (rat) hersenen, gevolgd door gelijktijdige kwantificering van proteasoom katalytische activiteit (indirect, het verstrekken van activiteit van de proteasoom kern alleen) en koppelings specifieke ubiquitine-eiwit tagging. Zo, de methode kan worden gebruikt om direct te vergelijken subcellulaire veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit in verschillende hersengebieden in hetzelfde dier tijdens synaptische plasticiteit, Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden. Deze methode kan ook worden gebruikt om de subcellulaire verdeling en functie van andere eiwitten binnen hetzelfde dier te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ubiquitin-proteasome systeem (UPS) is een complex netwerk van onderling verbonden eiwit structuren en ligasen die de afbraak van de meeste kortstondige eiwitten in de cellen1regelt. In dit systeem, eiwitten zijn gemarkeerd voor afbraak of andere cellulaire processen/Fates door de kleine modifier ubiquitin. Een doeleiwit kan 1-7 ubiquitine-modificaties verwerven, die samen kunnen linken op een van de zeven lysine (K)-sites (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63) of de N-terminale methionine (M1; zoals lineair genoemd) in de vorige ubiquitine2. Sommige van deze polyubiquitin Tags zijn afbraak-specifieke (K48)3, terwijl anderen zijn grotendeels onafhankelijk van het eiwitafbraak proces (M1)4,5,6. Zo is het eiwit Ubiquitination proces ongelooflijk complex en het vermogen om veranderingen in een specifieke polyubiquitin-tag te kwantificeren is van cruciaal belang om uiteindelijk de rol van die gegeven modificatie in cellulaire werking te begrijpen. Door de studie van dit systeem verder te compliceren, is het proteasome, dat de katalytische structuur van de ups7is, beide eiwitten degradeert, maar kan het ook worden betrokken bij andere niet-Proteolytische processen8,9. Niet verrassend dan, sinds de eerste ontdekking, normale en afwijkende ubiquitin-proteasome activiteit is betrokken bij de lange-termijn Geheugenvorming en een verscheidenheid van ziektetoestanden, met inbegrip van vele neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen10,11. Als gevolg hiervan zijn methoden die effectief en efficiënt de activiteit van UPS in de hersenen kunnen kwantificeren essentieel om uiteindelijk te begrijpen hoe dit systeem wordt ontregeld in ziektetoestanden en de uiteindelijke ontwikkeling van behandelingsopties die gericht zijn op ubiquitine en/of proteasoom functioneren.

Er zijn een aantal problemen bij het kwantificeren van ubiquitine-proteasome activiteit in hersenweefsel van ratten en muizen, de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt om de UPS-functie te bestuderen, waaronder 1) de diversiteit van ubiquitine-modificaties, en 2) distributie en differentiële regulering van ups die in subcellulaire compartimenten12,13en14functioneren. Bijvoorbeeld, veel van de vroege demonstraties van ubiquitin-proteasoom functie in de hersenen tijdens Geheugenvorming gebruikt hele celllysates en aangegeven tijdafhankelijke verhogingen in beide eiwit Ubiquitination en proteasoom activiteit15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. we vonden echter onlangs dat ubiquitin-proteasome-activiteit sterk varieerde over subcellulaire compartimenten in reactie op leren, met gelijktijdige stijgingen in sommige regio's en dalingen in andere, een patroon dat aanzienlijk verschilt van wat eerder werd gerapporteerd in de hele cel eiwitlysaten21. Dit is in overeenstemming met de beperking van een hele celbenadering, omdat het de bijdrage van veranderingen in de UPS-activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten niet kan ontkoppelen. Hoewel meer recente studies hebben gebruikt synaptische fractie protocollen voor het bestuderen van de ups specifiek op synapsen in reactie op het leren van22,23,24, de gebruikte methoden occlude de mogelijkheid om te meten nucleaire en cytoplasmische ubiquitine-proteasome veranderingen in hetzelfde dier. Dit resulteert in een onnodige noodzaak om experimenten meerdere malen herhalen, het verzamelen van een andere subcellulaire Fractie in elk. Dit resulteert niet alleen in een groter verlies van dier levens, maar elimineert de mogelijkheid om de UPS-activiteit direct te vergelijken met verschillende subcellulaire compartimenten in reactie op een bepaalde gebeurtenis of tijdens een specifieke ziektestatus. Gezien het feit dat eiwit doelen van ubiquitine en het proteasoom sterk variëren in de cel, begrijpen hoe ubiquitine-proteasoom signalering verschilt in verschillende subcellulaire compartimenten is essentieel voor het identificeren van de functionele rol van de ups in de hersenen tijdens Geheugenvorming en neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen.

Om deze behoefte aan te pakken, hebben we onlangs een procedure ontwikkeld waarin nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties kunnen worden verzameld voor een bepaald hersengebied van hetzelfde dier21. Om rekening te houden met de beperkte hoeveelheid eiwitten die kan worden verkregen uit het verzamelen van meerdere subcellulaire fracties uit hetzelfde monster, hebben we eerder vastgestelde protocollen geoptimaliseerd om in vitro proteasoom activiteit en koppelings-specifieke eiwit ubiquitinatie in gelyseerd cellen verzameld uit knaagdier hersenweefsel. Met behulp van dit protocol, we waren in staat om te verzamelen en direct te vergelijken leer afhankelijke veranderingen in proteasoom activiteit, K48, K63, M1 en algehele eiwit polyubiquitination niveaus in de Nucleus en cytoplasma en bij synapsen in de laterale amygdala van ratten. Hier beschrijven we in detail onze procedure (Figuur 1), die ons begrip van hoe de ups betrokken is bij de lange termijn Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden aanzienlijk zou kunnen verbeteren. Echter, opgemerkt moet worden dat de in vitro proteasoom activiteit die in ons protocol wordt besproken, terwijl op grote schaal gebruikt, niet direct de activiteit van complete 26s proteasoom complexen meet. Eerder, deze bepaling meet de activiteit van de kern van de 20s, wat betekent dat het kan alleen dienen als een volmacht om te begrijpen van de activiteit van de kern zelf in tegenstelling tot de gehele 26s proteasoom complex.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures, met inbegrip van dierproef personen, zijn goedgekeurd door het Virginia Polytechnic Institute en de State University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).

1. verzameling en dissectie van het hersenweefsel van knaagdieren

Opmerking: Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van hersengebieden en gebruikt met verschillende weefsel verzameling procedures. Hieronder is de procedure die wordt gebruikt in ons lab voor subcellulaire van Rat hersenweefsel, met behulp van 8-9 week oude mannelijke Sprague Dawley ratten. Om alle cellulaire compartimenten in hetzelfde dier te verwerken, paragraaf 1,3. moet worden gevolgd ongeacht de gebruikte weefselinzamelings procedure.

  1. Extract de hersenen van de rat en plaats in een cryogene beker voorgekoeld op droogijs. Flash-Freeze de hersenen op droogijs, of gebruik vloeibare stikstof indien beschikbaar, en overbrengen naar a-80 °C vriezer. Hersenen kunnen dezelfde dag of op een later tijdstip worden ontleed.
  2. Verwijder de bevroren hersenen uit de cryogene beker en plaats ze in een rat-hersen matrix gekoeld met droogijs. Elke sleuf op de matrix komt overeen met 0,5 mm, die kan worden gebruikt om de geschatte locatie van de regio van belang (ROI) te bepalen.
    1. Met behulp van een rat hersenen Atlas, steek een scheermesje in de matrix direct voor (anterior) van de voorspelde start van de ROI. Plaats vervolgens een scheermesje onmiddellijk aan het voorspelde uiteinde (posterior) van de ROI.
    2. Verwijder het segment tussen de scheermesjes met behulp van een scalpel en plaats op een Microscoop-dia gekoeld op droogijs. Meestal zijn secties 2-3 mm dik, maar dit varieert op basis van de ROI.
  3. Met behulp van een scalpel, ontleden de ROI één halfrond op een moment. Plaats elke halve bol in afzonderlijke micro centrifugebuizen van 1,5 mL, voorgekoeld op droogijs. Bevroren weefsel kan onmiddellijk worden gebruikt voor subcellulaire fractionering of op een later tijdstip worden verwerkt indien opgeslagen bij-80 °C.

2. nucleaire en Cytoplasmorische extractie

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van premade stamoplossingen van gemeenschappelijke labchemicaliën, waaronder 0,1 M HEPES, 1 M MgCl1,2m Dithiothreitol (DTT), 0,5 m ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 5 m NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) en 50% glycerol. Als eindpunt wordt gebruikt in proteasoom activiteit assays, kunnen glycerol en ATP worden toegevoegd aan alle buffers om te voorkomen dat de demontage van proteasoom complexen tijdens lysis.

  1. Bereid de Lysisbuffer voor. Voeg 8,63 mL ultrazuiver (gedeïoniseerd en gedistilleerd) water toe aan een steriele 15 mL conische buis.
    1. Voeg aan de conische buis 1.000 μL van 0,1 M HEPES, 15 μL van 1 M MgCl, 100 μL van 1 M DTT en 50 μL 10% NP-40 toe.
    2. Voeg een cocktail van 100 μL proteaseremmer en een cocktail van 100 μL fosfatase remmer toe. Draai de oplossing kort om te mengen en te plaatsen op nat ijs om te relaxen. Merk op dat de oplossing een gele tint kan hebben van de fosfatase remmer.
      Opmerking: Het gebruik van proteaseremmers is essentieel om eiwitten te bewaren en te zorgen voor de specificiteit van de in vitro proteasoom activiteit test. Echter, deze remmers kunnen ook resulteren in een lichte afname van de proteasoom activiteit, wat betekent dat de activiteit gemeten op de in vitro assay kan een onderschatten van de werkelijke activiteit niveaus.
  2. Bereid de extractie buffer voor. Voeg 5,925 mL ultrazuiver (gedeïoniseerd en gedistilleerd) water toe aan een steriele 15 mL conische buis.
    1. Voeg aan de conische buis 2.000 μL van 0,1 M HEPES, 1250 μL 50% glycerol, 15 μL van 1 M MgCl2,5μL van 1 m DTT, 5 ΜL 0,5 m EDTA en 600 μL van 5 m NaCl.
    2. Voeg een cocktail van 100 μL proteaseremmer en een cocktail van 100 μL fosfatase remmer toe. Draai de oplossing kort om te mengen en te plaatsen op nat ijs om te relaxen. Merk op dat de oplossing een gele tint kan hebben van de fosfatase remmer.
  3. Verwijder de 1,5 mL centrifuge microtube met één hemisfeer van de ROI van de-80 °C vriezer. Zorg ervoor dat de gebruikte halve bol wordt gecompenseerd door de extractieomstandigheden voor elke experimentele groep. Bijvoorbeeld, in een experiment met twee groepen, gebruikt u de linker hemisfeer voor de eerste twee dieren in elke groep en de rechter hemisfeer voor de volgende twee monsters, enz.
  4. Gebruik een scalpel om het bevroren hersenweefsel over te brengen naar een 2 mL Teflon-homogenisator van glas. Voeg 500 μL Lysisbuffer toe aan de Teflon Tube.
    1. Met behulp van een stamper B homogeniseer je hetzelfde weefsel met 15 slagen totdat er geen zichtbare hoeveelheid vast materiaal aanwezig is. Gebruik een draaibeweging (rechtsom of linksom) tijdens elke slag.
  5. Breng met een pipet van 1.000 μL het gehomogeniseerde monster over in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Plaats de buis op nat ijs en inbroed gedurende 30 minuten.
  6. Plaats de buis in micro centrifuge en draai gedurende 10 minuten bij 845 x g en 4 °c. Verwijder na voltooiing het supernatant voorzichtig door pipetteren en plaats in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL; Dit is de Cytoplasmische Fractie, die kan worden opgeslagen op ijs of op 4 ° c tot sectie 2,9.
  7. Voeg 50 μL extractiebuffer toe aan de resulterende pellet en respendeer door pipetteren. De pellet niet Vortex. Plaats de buis met de geresuspendeerde pellet op ijs en inbroed gedurende 30 minuten.
  8. Plaats de buis in microcentrifuge en draai gedurende 20 minuten bij 21.456 x g, 4 °c. Verwijder na voltooiing het supernatant voorzichtig door pipetteren en plaats in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL; Dit is de nucleaire Fractie. De pellet kan nu weggegooid worden.
  9. Meten van de eiwitconcentratie van het cytoplasma en nucleaire extracties met behulp van de DC-eiwit test (volgens de instructies van de fabrikant), of een gelijkwaardige test voor monsters die worden verzameld met behulp van niet-ionische detergenten. Ga onmiddellijk verder met de proteasoom activity assay (sectie 4) of Western blotting (rubriek 5). Als alternatief kunnen monsters worden bewaard bij-80 °C tot dat nodig is.

3. synaptische fractie verzameling

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van premade voorraadoplossingen van gemeenschappelijke labchemicaliën, waaronder 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl en 10% SDS. Als eindpunt wordt gebruikt in proteasoom activiteit assays, kunnen glycerol en ATP worden toegevoegd aan alle buffers om te voorkomen dat de demontage van proteasoom complexen tijdens Lysis

  1. Bereid de TEVP buffer met 320 mM sucrose. Voeg 60 mL ultrazuiver (gedeïoniseerd en gedistilleerd) water toe aan een schoon bekerglas van 100 mL.
    1. Aan het bekerglas, voeg 1.300 μL van 1 M Tris (pH 7,5), 260 μL 0,5 M EDTA, 100 μL protease inhibitor cocktail, 100 μL fosfatase inhibitor cocktail en 10,944 g sucrose toe. Meng met een roerstaaf tot sucrose volledig is opgelost.
    2. Breng pH tot ~ 7,4 door het toevoegen van zoutzuur (HCL) druppelsgewijs aan de oplossing met behulp van een pipet.
    3. Breng de oplossing over in een maatkolf van 100 mL. Breng het volume tot 100 mL door het toevoegen van ultrapuur water. Chill de uiteindelijke oplossing op ijs totdat het nodig is.
  2. Bereid de homogenisatie buffer. Voeg 60 mL ultrazuiver (gedeïoniseerd en gedistilleerd) water toe aan een schoon bekerglas van 100 mL.
    1. Aan het bekerglas, voeg 5.000 μL van 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 μL van 5 M NaCl, 100 μL protease inhibitor cocktail, 100 μL fosfatase inhibitor cocktail en 2.000 μL 10% SDS toe. Meng met een roer stang.
      Opmerking: Ionic detergenten kunnen interfereren met proteasoom activiteit testen door het ontstaan van denaturering van het proteasoom complex. Het volume van SDS kan worden verlaagd om de proteasoom functie te helpen behouden indien gewenst.
    2. Breng pH naar ~ 7,4 door HCL druppelsgewijs toe te voegen aan de oplossing met behulp van een pipet.
    3. Breng de oplossing over in een maatkolf van 100 mL. Breng het volume tot 100 mL door het toevoegen van ultrapuur water. Bewaar de uiteindelijke oplossing bij kamertemperatuur; niet chillen als SDS zal neerslaan uit de oplossing.
  3. Verwijder de 1,5 mL centrifuge met één hemisfeer van de ROI van de-80 °C vriezer. Zorg ervoor dat de gebruikte halve bol wordt gecompenseerd door de extractieomstandigheden voor elke experimentele groep. Bijvoorbeeld, in een experiment met twee groepen, gebruikt u de linker hemisfeer voor de eerste twee dieren in elke groep en de rechter hemisfeer voor de volgende twee monsters, enz.
  4. Gebruik een scalpel om het bevroren hersenweefsel over te brengen naar een 2 mL Teflon-homogenisator van glas. Voeg 500 μL TEVP-buffer toe aan de Teflon-buis.
    1. Met behulp van een stamper B homogeniseer je hetzelfde weefsel met 15 slagen totdat er geen zichtbare overdrachten van vast materiaal aanwezig zijn. Gebruik een draaibeweging (rechtsom of linksom) tijdens elke slag.
  5. Breng met een pipet van 1.000 μL het gehomogeniseerde monster over in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer het monster bij 1.000 x g gedurende 10 min, 4 °c.
  6. Verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL met een pipet van 1.000 μL. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 10 min, 4 °c. De originele pellet (P1) bevat kernen en het grote puin en kan weggegooid worden.
  7. Breng de supernatant over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Dit is een cytosolische Fractie. Voeg 50 μL homogenisatie buffer toe aan de pellet (P2) en hervat door pipetteren totdat er geen vast materiaal zichtbaar is.
  8. Centrifugeer het monster bij 20.000 x g gedurende 10 min, 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL; Dit is de ruwe Synaptosomale membraan (Synaptic) Fractie. De pellet kan weggegooid worden.
  9. Meet de eiwitconcentratie van de synaptische fractie met behulp van de DC-eiwit test (volgens de instructies van de fabrikant), of een gelijkwaardige test voor monsters die worden verzameld met ionogene detergentia. Ga onmiddellijk verder met de proteasoom activity assay (sectie 4) of Western blotting (rubriek 5). Als alternatief kunnen monsters worden bewaard bij-80 °C tot dat nodig is.

4. bepaling van de proteasome activiteit

Opmerking: Proteasome activiteit kan worden gemeten in gehomogeniseerde hersenweefsel met behulp van een licht gewijzigde versie van de jaren twintig Proteasome activity Kit. Deze test meet niet direct de activiteit van complete 26s proteasoom complexen. Integendeel, het meet de activiteit van de kern van de 20s, wat betekent dat het alleen als een proxy kan dienen om de activiteit van de kern zelf te begrijpen in tegenstelling tot het hele 26s proteasoom complex. Het succes van deze test daalt met herhaalde vries-dooi cycli en/of toenemende detergenten, met name Ionic, en vereist het gebruik van een plaat lezer met een 360/460 (excitatie/emissie) Filterset en verwarmings mogelijkheden tot 37 °C.

  1. Plaat lezer instellingen: pre-warm tot 37 °C en houd de run.
    1. Stel excitatie in op 360 en uitstoot naar 460. Als de 96 goed plaat gebruikt is duidelijk, zet de optiek positie naar beneden. Als een donkere/zwarte 96 goed plaat wordt gebruikt, stelt u de optiek positie naar boven.
    2. Stel oudere plaat lezers modellen in op auto-Gain onder de fluorescerende leesopties; nieuwere modellen zijn hiervoor vooraf ingesteld. Program meer een kinetische run met een tijd van 2 uur, scannen (lezen) elke 30 min.
  2. Reconstitueer de 10x-assay buffer die in de kit wordt geleverd met 13,5 mL ultrapuur water. Voeg 14 μL 100 mM ATP toe aan de nu 1-buffer; Dit verbetert de proteasoom activiteit in de monsters aanzienlijk en verbetert de betrouwbaarheid van de assay. De uiteindelijke test buffer van 20S kan worden opgeslagen op ijs of bij 4 °C totdat het nodig is en gedurende enkele maanden stabiel is.
  3. Reconstitueer de in kit met 100 μL DMSO geleverde AMC-standaard. Voer deze stap uit in het donker of onder omstandigheden met weinig licht, omdat de standaard lichtgevoelig is.
  4. Maak een standcurve van AMC met behulp van de gereconstitueerde standaard, in het donker of bij weinig licht.
    1. In afzonderlijke micro centrifugebuizen van 0,5 mL, Voeg 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 en 0 μL van de AMC-standaard, die overeenkomt met 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 en 0 μM AMC-concentratie.
    2. Aan deze buizen, in dezelfde volgorde, toevoegen 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 en 100 μL van 20S test buffer. Dit creëert een reeks van hoge tot lage AMC concentraties, die zullen worden gebruikt voorplaat lezers kalibratie en analyse van proteasoom activiteit in de gehomogeniseerde monsters.
    3. Bewaar alle verdunde normen op ijs in het donker totdat het nodig is.
  5. Reconstitueer het proteasoom substraat (SUC-llvy-AMC) dat in kit met 65 μL DMSO wordt geleverd. Voer deze stap uit in het donker of onder omstandigheden met weinig licht, omdat het substraat lichtgevoelig is. Maak een 1:20 verdunning van het proteasoom substraat in een nieuwe 1,5 ml micro centrifugebuis met behulp van 20s assay buffer. Bewaar het verdunde substraat op ijs in het donker totdat het nodig is.
    Opmerking: Als de plaat bijvoorbeeld 10 samples en 1 blank heeft, hebt u voldoende verdunde ondergrond nodig voor 22 putjes (met duplicaten) van 10 μL per putje. Dit komt overeen met 220 μL + 30 μL voor Pipetteer fouten, waarbij 12,5 μL substraat en 237,5 μL van de test buffer van 20S nodig zijn.
  6. Ontdooien gewenste monsters (indien bevroren) en voeg een genormaliseerd bedrag toe aan een 96 goed bord. Voer elk voorbeeld in duplicaten uit. De hoeveelheid benodigde monster varieert op basis van weefsel preparaat. Over het algemeen is 10-20 μg voldoende voor een subcellulaire Fractie.
  7. Breng het monster goed naar 80 μL met ultrazuiver water. Het toegevoegde bedrag is afhankelijk van het volume van het toegevoegde monster. Als monster 1 bijvoorbeeld 4,5 μL eiwit was en monster 2 8,7 μL, dan is de benodigde hoeveelheid water respectievelijk 75,5 μL en 71,3 μL. Voeg in twee afzonderlijke putjes 80 μL water alleen toe; Dit zullen de Blanco's zijn.
    Opmerking: Om veranderingen in het eiwit volume te beperken als gevolg van Pipetteer fouten, kunnen eiwit concentraties worden genormaliseerd naar het minst geconcentreerde monster. Hierdoor kan in alle omstandigheden hetzelfde sample volume worden gebruikt.
  8. Voeg 10 μL van 20S-test buffer toe aan elke put, inclusief assay blanks. Een repeater/geautomatiseerde pipet wordt hier aanbevolen om een consistent assay volume over putten te garanderen.
  9. Optioneel: In dit stadium, introduceren in vitro manipulaties indien gewenst; Dit zal vereisen dat elk monster heeft een extra 2 putten per behandeling, met inbegrip van het voertuig. Als dat zo is, voeg dan 5-10 μL geneesmiddel/samenstelling van belang toe aan 2 van de monster putten en een gelijkwaardig volume van controle/voertuig naar andere 2 putten. Plaats de plaat gedurende 30 minuten op de voorverwarmde plaat lezer of in een incubator van 37 °C.
  10. Schakel de lampjes uit of voer een donkere kamer in. Voeg alle 100 μL verdunde AMC-normen toe aan een nieuwe put; elke standaard zal een enkele put hebben.
  11. Voeg in het donker 10 μL verdund proteasoom substraat toe aan putjes met monster-en assay-blanco's, maar niet aan de AMC-standaard. Een repeater/geautomatiseerde pipet wordt hier aanbevolen om een consistent assay volume over putten te garanderen.
  12. Plaats de plaat in de plaatje lezer en start de kinetische run.
    Opmerking: De plaat hoeft niet constant te schudden tijdens de kinetische run, maar de gebruiker kan desgewenst kiezen
  13. Aan het einde van de kinetische run exporteert u RAW 360/460 fluorescerende waarden naar Microsoft Excel.
    1. Gemiddelde samen dubbele putten voor elke standaard, elk monster en de assay blanco voor alle 5 scans. Onbewerkte fluorescentie waarden moeten voor de monsters over de scans toenemen, maar blijven stabiel (of licht afnemen) voor normen en Blanco's.
    2. Neem de hoogste AMC standaard goed gemiddelde en verdeel door de bekende concentratie (20 μM). Verdeel deze waarde door de monsterconcentratie die in de assay wordt gebruikt om een gestandaardiseerde AMC-waarde te krijgen. Verdeel door de gestandaardiseerde AMC-waarde voor elk monster en test blanco gemiddelde.
    3. Neem deze eindwaarde en verdeel door de monsterconcentratie die in de assay wordt gebruikt om de genormaliseerde waarde voor elk monster en de test blanco te krijgen. Doe dit voor alle 5 scans.
    4. Aftrekken van de genormaliseerde assay leeg waarde van elke genormaliseerde Sample waarde voor alle 5 scans.

5. kwantificering van koppelings-specifieke eiwit Ubiquitination

  1. Kwantificering van diverse polyubiquitin Tags in verschillende subcellulaire fracties verzameld van knaagdier hersenweefsel moet worden gedaan met behulp van een verscheidenheid van standaard westerse blotting protocollen in combinatie met unieke, koppelings-specifieke polyubiquitin antilichamen.
    1. Meng voor denaturering de genormaliseerde monsters met een gelijk volume Laemmli-monster buffer aangevuld met β-mercaptoethanol tot een percentage van 5% per volume, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voor de kwantificering van alle monoubiquitination en polyubiquitination aanpassingen ongeacht de koppeling, gebruik een pan-ubiquitin antilichaam.
    3. Om alle polyubiquitineerde eiwitten te herkennen, gebruikt u een ubiquitine antilichaam dat niet kruislings reageert met monoubiquitination.
    4. Gebruik voor koppelings-specifieke polyubiquitination antilichamen die lysine-27, lysine-48, lysine-63 en lineaire (M1) polyubiquitination kunnen detecteren.
  2. Om kruisbesmetting tussen ontwikkelingen te voorkomen, wat zou kunnen resulteren in een vals positief of interfereren met beeldvorming van een andere ubiquitine modificatie, strippen membranen tussen ontwikkelingen met behulp van 0,1 M NaOH voor 10 min.
    1. Was de membranen in TBS met 0,1% tween tweemaal gedurende 10 minuten en reblock (met behulp van welke blokkerende agent de voorkeur heeft in het gebruikte Western Blot Protocol).
    2. Inbroed het membraan met het secundaire antilichaam en herontwikkelen om te bevestigen dat het membraan is ontdaan van primaire en secundaire antilichamen correct.
    3. Aanbevolen: Voor een succesvolle ontwikkeling van verschillende ubiquitine-antilichamen zonder verontreiniging, gebruikt u fluorescerende of near-infrarood beeldvormingssystemen. Dit kan vaak het voorkomen van overdracht tussen antilichamen.
  3. Sommige afbeeldingen van de ubiquitine Western Blot bieden kolommen met verschillende bands (zoals M1), terwijl anderen een uitstrijkje achtig patroon produceren met weinig of geen duidelijke lijnen (gebruikelijk bij K48). Voor de kwantificering van afbeelding gemaakt ubiquitine Western blots tekent u een vak rond de kolom die de volledige moleculaire standaarden ladder uitbreidt.
    1. Pas de doos omhoog (of omlaag) als de ubiquitine kleuring zich uitstrekt via de hele ladder; Dit is gebruikelijk voor lysine-48 modificaties en varieert sterk over subcellulaire compartimenten.
    2. Verwijder de achtergrond, die wordt berekend als de gemiddelde extinctie van de achtergrond direct rondom de kolom aan alle zijden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hier beschreven procedure, nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties werden verzameld uit de laterale amygdala van de hersenen van de rat (Figuur 1). De zuiverheid van de afzonderlijke fracties werd bevestigd via Western blotting, het indringende met antilichamen tegen eiwitten die moeten worden verrijkt of uitgeput in het lysaat. In het eerste halfrond waar een ruwe synaptische Fractie werd verzameld, postsynaptisch dichtheid eiwi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we een efficiënte methode voor het kwantificeren van veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit over verschillende subcellulaire compartimenten in hetzelfde dier. Momenteel zijn de meeste pogingen om subcellulaire veranderingen in activiteit van het ubiquitin-proteasome systeem te meten beperkt tot één compartiment per monster, wat resulteerde in de noodzaak om experimenten te herhalen. Dit leidt tot aanzienlijke kosten en verlies van dierlijk leven. Ons protocol lost dit probleem op door hemisferen te s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Startup funds van het College of landbouw en Life Sciences en het College of Science bij Virginia Tech. T.M. wordt ondersteund door het George Washington Carver-programma van Virginia Tech.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTAFisher15575020Various other vendors
20S Proteasome Activity KitMillipore SigmaAPT280Other vendors carry different versions
ATPFisherFERR1441Various other vendors
Beta-actin antibodyCell signaling4967SVarious other vendors
Beta-tubulin antibodyCell signaling2128TVarious other vendors
BioTek Synergy H1 plate readerBioTekVATECHH1MT3Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanolFisherICN19024280Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035Various other vendors
Cryogenic cupFisher033377BVarious other vendors
DMSODMSOD8418Varous other vendors
DTTMillipore SigmaD0632Various other vendors
GlycerolMillipore SigmaG5516Various other vendors
H3 antibodyAbcamab1791Various other vendors
HEPESMillipore SigmaH3375Various other vendors
Hydrochloric acidFisherSA48Various other vendors
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Various other vendors
K48 Ubiquitin AntibodyAbcamab140601Various other vendors
K63 Ubiquitin AntibodyAbcamab179434Various other vendors
KClMillipore SigmaP9541Various other vendors
KONTES tissue grinderVWRKT885300-0002Various other vendors
Laemmli sample bufferBio-rad161-0737Various other vendors
Linear Ubiquitin AntibodyLife SensorsAB-0130-0100Only M1 antibody
MgClMillipore Sigma442611Various other vendors
MicrocentrifugeEppendorf2231000213Various other manufacturers/models
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Carried by Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014Various other vendors
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02Other vendors carry different versions
Phosphatase InhibitorMillipore Sigma524625Various other vendors
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373Various other vendors
Protease InhibitorMillipore SigmaP8340Various other vendors
PSD95 antibodyCell signaling3450TVarious other vendors
SDSMillipore SigmaL3771Various other vendors
Sodium hydroxideFisherSS255Various other vendors
SucroseMillipore SigmaS0389Various other vendors
TBSAlfa AesarJ62938Varous other vendors
TrisMillipore SigmaT1503Various other vendors
Tween-20FisherBP337-100Various other vendors
Ubiquitin AntibodyEnzo Life SciencesBML-PW8810Various other vendors

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349(2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Subcellulaire fractioneringProteasoomassayWestern blotSynaptische fractieNucleaire fractieCytoplasmatische fractieKoppeling specifieke ubiquitiniteringProte nedegradatie

Gerelateerde artikelen