We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vele biologische cellen/weefsels voelen de mechanische eigenschappen van hun lokale milieu's via mechanoreceptoren, proteïnen die aan krachten zoals druk of mechanische verstoringen kunnen antwoorden. Mechanoreceptoren detecteren hun stimuli en zenden signalen uit via een grote diversiteit aan mechanismen. Enkele van de meest voorkomende rollen voor mechanoreceptoren zijn in neuronale reacties, zoals aanraking en pijn, of haarcellen die functioneren in balans en gehoor. Mechanosensation is ook belangrijk voor cel types die regelmatig worden blootgesteld aan shear stress, zoals endothelial cellen, die lijn bloedvaten, of bloedcellen die shear ervaring in de normale circulatie. Viscometers zijn apparaten die de viscositeit van vloeistoffen te detecteren. Rotatie viscometers kan ook worden gebruikt om een bekende shear kracht toe te passen op vloeistoffen. Het vermogen van deze instrumenten om uniforme shear te voeren om vloeistoffen is geëxploiteerd om vele biologische vloeistoffen, waaronder bloed en plasma studie. Viscosimeter kan ook worden gebruikt om shear toe te passen op de cellen in een oplossing, en om de effecten van shear op specifieke ligand-receptor paren te testen. Hier gebruiken we Cone-plate viscosimeter om de effecten van endogene niveaus van shear stress testen op bloedplaatjes behandeld met antilichamen tegen de bloedplaatjes mechanosensory receptor complex GPIb-IX.
Inleiding
Mechanoreceptoren zijn eiwitten die reageren op mechanische prikkels, zoals druk of mechanische verstoring/vervorming. Voor sommige mechanoreceptoren, het ontdekken van deze mechanische verstoringen is expliciet aan de functie van de cel types waarin zij worden uitgedrukt. Neem, bijvoorbeeld, de rek receptoren in baroreceptor neuronen; Deze mechanosensitive ionenkanalen reguleren de bloeddruk door het ontdekken van vasculaire "stretch"1,2. In het binnenoor, ion kanalen op haarcellen detecteren mechanische vervormingen veroorzaakt door geluidsgolven3, en cutane lage drempel Mechanoreceptoren (LTMRs) vergemakkelijken de overdracht van tactiele informatie4. In andere gevallen, mechanoreceptoren verstrekken belangrijke informatie aan de cel voor de totstandbrenging van adhesie of de groei. De cellen kunnen de starheid van hun lokaal milieu voelen, en kunnen op samentrekbaar krachten via actine cytoskelet en integrines baseren om de groei of het uitspreiden te dicteren5,6.
Wanneer het bestuderen van receptor-ligand interactie in cel of weefsel-gebaseerde modellen, bestaan de gemeenschappelijke analyses die snel en nauwkeurig de gevolgen kunnen rapporteren van het veranderen van temperatuur, pH, ligand concentratie, tonicity, membraan potentieel, en veel andere parameters die kan variëren in vivo. Nochtans, kunnen deze zelfde analyses plotseling vallen wanneer het over het ontdekken van de bijdrage van mechanische kracht aan receptor activering komt. Of cellen zijn sensing hun micromilieu, het opsporen van geluidsgolven, of reageren op Stretch, een ding de bovengenoemde mechanoreceptoren gemeen hebben is dat ze deelnemen aan interacties waar de ligand, receptor, of beide, zijn verankerd aan een Oppervlak. De analyses die worden ontwikkeld om de gevolgen van mechanische krachten op receptor interactie te testen wijzen vaak op dit paradigma. Microfluidics en stromings kamers worden gebruikt om de effecten van shear flow op cellen en receptoren7,8te bestuderen. Dit soort experimenten hebben het voordeel van het toestaan van Fine-tuning van de shear rates via gevestigde stroomsnelheden. Andere technieken gebruiken fluorescente moleculaire sondes om krachten te ontdekken die door cellen op ligand-rijke oppervlakten worden toegepast, opbrengend een nauwkeurige uitlezing van de omvang en de richtlijnen van krachten betrokken bij interactie9,10.
In aanvulling op mechanosensation voorkomende waar een of beide partners zijn verankerd aan een oppervlak, shear stress kan van invloed zijn eiwitten en cellen in oplossing. Dit wordt vaak waargenomen in bloedcellen/proteïnen die constant in de omloop zijn, en kunnen zich via activering van mechanoreceptoren manifesteren die normaal oppervlakte-verankerd11, of door blootstelling van doel opeenvolgingen zijn die onder afgesloten zouden zijn statische voorwaarden12. Echter, relatief minder technieken assay de effecten van shear Force op deeltjes in oplossing. Sommige in-oplossing benaderingen introduceren shear via wervelende cellen in vloeibare suspensie met verschillende snelheden en duur, hoewel deze benaderingen niet mogelijk een zeer nauwkeurige bepaling van de shear stress gegenereerd. Rotatie viscometers maatregel viscositeit door toepassing van een specifieke shear kracht op vloeistoffen. Hierin beschrijven we een toegepaste methode voor het bepalen van het effect van specifieke laminaire shear tarieven op cellen of cel fragmenten in oplossing.
Een van de hoogst uitgedrukte eiwitten op het plaatoppervlak is het glycoproteïne (GP) IB-IX complex. GPIb-IX is de primaire receptor voor de plasma proteïne Von Willebrand factor (VWF). Samen is dit receptor-ligand paar al lang erkend als de fundering van de bloedplaatjes reactie op shear stress13. In het geval van vasculaire schade, VWF bindt aan blootgesteld collageen in de sub-endothelial matrix14, waardoor het werven van bloedplaatjes op de site van de schade via de VWF-GPIB-IX interactie. VWF engagement om haar bindende site in de GPIbα subeenheid als GPIb-IX onder fysiologische shear stress induceert ontvouwen van een membraan-proximale mechanosensory domein (MSD), die op zijn beurt activeert GPIb-IX15. In een recente studie hebben we aangetoond dat antilichamen tegen GPIbα, zoals die gegenereerd in veel immuun trombocytopenie (ITP) patiënten, zijn ook in staat het induceren van bloedplaatjes signalering via MSD ontvouwen onder shear stress11. Nochtans, in tegenstelling tot VWF, die shear-veroorzaakte GPIb-IX activering door het complex onder normale omloop te immobiliseren vergemakkelijkt, kunnen de bivalente antilichamen crosslink bloedplaatjes via GPIb-IX en de MSD in omloop openen. Op deze manier, een mechanoreceptor die normaal wordt geactiveerd door de oppervlakte immobilisatie onder shear kan worden geactiveerd in oplossing. In het onderhavige verslag, zullen we aantonen hoe een viscometer-gebaseerde uniform shear assay werd benut om de effecten van specifieke niveaus van shear stress op receptor activering in oplossing te detecteren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden met behulp van donor-afgeleide menselijke bloedplaatjes hierin beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Emory University/Children's Healthcare van Atlanta.
1. bloed trekken en plaatjes isolatie
- Trek menselijk bloed van toestemmende gezonde volwassen donors via punctie op de dag van het experiment in 3,8% trinatriumfosfaat citraat. Een 4,5 mL buis van bloed is voldoende om de opbrengst voldoende bloedplaatjes rijk plasma (PV) voor 20-25 voorwaarden bij donoren waarvan de bloedplaatjes zijn dicht bij 250 x 103 per l.
Opmerking: Vermijd het tekenen van bloed via smalle meter naalden (kleiner dan 21 G). - Bereid PV via Centrifugeer bij 22 °C en 140 x g voor 12 min met een lange rem voor. Dit zal resulteren in twee verschillende lagen, met rode bloedcellen aan de onderkant en het licht gekleurde PV aan de top.
- Isoleer de bovenste, bewolkte, gele laag van het PV via zorgvuldige pipetten door middel van een pipet uiteinde gesneden op een 45 ° hoek en het verkrijgen van de bloedplaatjes tellen via een complete bloedbeeld (CBC).
- Indien nodig, wassen bloedplaatjes in PIJPen-gebufferde zoutoplossing (150 mM NaCl, 20 mM PIJPen) in aanwezigheid van prostaglandine E1 (PGE1) en hersuspend in de buffer van Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mm MgCl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm Hepes, pH 7,35) met 5 mm glucose, anders gaat u verder met stap 1,5. De volgende stappen beschrijven het wassen in het kort.
- Pas het PV-volume aan op 10 mL met PIJPen-gebufferde zoutoplossing en Voeg 0,6 μM PGE1 toe.
- Centrifugeer gedurende 8 min bij 1.900 x g, gooi bovendrijvende en laat de plaatjes pellet in 400 l van Tyrode en glucoseoplossing voor 5 minuten zitten.
- Zachtjes opnieuw op te schorten de bloedplaatjes pellet en houd het ongestoord voor 30 min.
- Stel het aantal bloedplaatjes in op ~ 250 x 103 bloedplaatjes per l met gepoolde menselijke bloedplaatjes-slecht plasma (PPP) en houd de schorsing bij 22 °c ongestoord of onder zachte rotatie.
2. ligand en uniform shear behandeling
Opmerking: alle stappen in sectie 2 die nodig zijn om te pipetteren moeten langzaam worden uitgevoerd, om geen shear te introduceren.
- Voeg het gewenste antilichaam of ligand toe aan de PV-of gewassen bloedplaatjes en meng zachtjes door op en neer te pipetteren of te roeren met een pipet tip. Laat het ongestoord bij kamertemperatuur voor 5-10 min. Voeg een gelijkwaardig volume van PPP of Tyrode buffer toe aan een negatieve controle.
- Zet de kegel-plaat viscometer, zet de plaat temperatuur tot 22 ° c en laat de tijd om de plaat te laten deze temperatuur te bereiken.
- Pipetteer de behandelde PV-of gewassen bloedplaatjes op de door de temperatuur gecontroleerde kegel plaat viscometer direct in het midden van de plaat. Zorg ervoor dat alle van het monster wordt gedeponeerd tussen de kegel en de plaat op het punt van contact, en niet op de buitenkant van de rand van de kegel.
- Afschuinen op een passende snelheid en duur.
- Bereken shear zoals aangegeven door de viscometer handleiding, of zoals eerder getoond15,16.
- Bepaal shear rate van viscositeit en gewenste shear stress via de wet van Newton van de viscositeit;
; de viscositeit van het plasma is 1.5-1.6 centipoise (cP)17. Bijvoorbeeld, een normaal scheren bereik voor menselijke circulatie is 5-30 dyn/cm2 en shear moet worden toegepast op de enkele cijfers minuten tijdschaal.
- Til de kegel van de plaat slighlty (~ 2 mm), zodat het monster blijft in contact met zowel de plaat en kegel, en gebruik een gel-loading of een andere lange pipet tip om 5-10 l te verzamelen uit het midden van het monstervolume.
- Incubeer de geschoren monsters met de gewenste markeringen voor 20 min bij kamertemperatuur. Voor markeringen van fosfatidylserine, β-galactose, en P-selectine blootstelling gebruik Lactadherin C2 domein (LactC2) bij 0,08 μM18, Erythrina cristagalli LECTINE (ecl) bij 6,25 μg/ml, en anti-P-selectine antilichaam (20 µ g/ml), respectievelijk.
- Bevestig monsters in 2% Paraformaldehyde voor 20 min bij RT vóór verdunning of koude opslag, en ga verder met stap 3,1 of op te slaan monsters bij 4 ° c voor niet langer dan 12 uur.
3. detectie van oppervlakte-markers en crosslinking via flow Cytometry
- Analyseer het monster via flow Cytometry, het verzamelen van ten minste 20.000 evenementen voor elke voorwaarde.
- Quantitate signaalsterkte van de fluorescente markeringen gebruikend de hoogtewaarde voor de intensiteit van elke fluorophore, of de geometrische gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI).
- Als gericht op het detecteren van bloedplaatjes crosslinking na shear behandeling, analyseren het monster op een Imaging-staat flow cytometer en quantitate crosslinking per gebied en aspect ratio parameters.
- Plot een histogram van gebied en/of aspect ratio.
- Gebruik een negatieve controle met boviene serum albumine (BSA) of voertuig om een poort te trekken met uitzondering van de meeste volledig circulaire gebeurtenissen (deze poort wordt meestal getekend op een aspect ratio ~ 0,819,20) en quantitate het percentage van de gebeurtenissen binnen van deze poort. Gebeurtenissen met een lagere beeldverhouding zijn waarschijnlijk kruisverwijzende.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 schetst hoe de trigger model van GPIB-IX activering, in eerste instantie geïntroduceerd om shear-afhankelijke receptor activering verklaren wanneer verankerd aan de vaatwand, kan ook ondersteuning activering van bloedplaatjes kruisverwijzende door een multivalente ligand. Figuur 2 toont uitlezingen van menselijke bloedplaatjes activatie behandeld door twee antilichamen gericht op de N-Terminal domein van GPIB-IX (6B4 en 11A8), en een controle antilichaa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol beschreven in dit manuscript maakt een snelle en veelzijdige beoordeling van het effect van laminaire shear op bloedplaatjes en cel oppervlak receptoren. De specifieke representatieve resultaten hier te onderstrepen hoe de effecten van multimeric of bivalente liganden kunnen worden beïnvloed door shear flow. In aanvulling op deze toepassing, een uniforme shear assay heeft brede toepassingen in het observeren van shear-afhankelijke effecten. Bij afwezigheid van een bekend ligand-receptor paar, kan een uniform...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk relevant voor deze studie werd gesteund voor een deel door nationale instituten van gezondheid (NIH) nationaal hart, Long, en het Instituut van het bloed verleent HL082808, HL123984 (R.L.), en F31HL134241 (M.E.Q.). Financiering ook verstrekt door NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); en pilot Grant Funds van kinderen de gezondheidszorg van Atlanta en Emory University Pediatric flow Cytometry core. De auteurs willen bedanken Dr. Hans Deckmyn voor het delen van de 6B4 antilichaam, en de Emory Children's Pediatric Research Center flow Cytometry core voor technische ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | - | |
| FITC-geconjugeerd Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Gepoold normaal humaan plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer lichtblauwe bloedopvangbuis (natriumcitraat) | BD | 369714 | |
| Vacutainer-bloedafnameset, 21G x ¾" naald | BD | 367287 |
Referenties
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301(2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870(2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584(2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863(2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , Springer Science, Business Media. (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
