Diagnostische fragmentatie filtering, geïmplementeerd in MZmine, is een elegante, post-acquisitie benadering van het scherm LC-MS/MS datasets voor hele klassen van zowel bekende als onbekende natuurlijke producten. Deze tool zoekt MS/MS Spectra voor product ionen en/of neutrale verliezen die de analist heeft gedefinieerd als zijnde diagnostische voor de gehele klasse van verbindingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Natural product Discovery met LC-MS/MS diagnostische fragmentatie filtering: aanvraag voor Microcystin analyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Natuurlijke producten zijn vaak biogesynthetiseerd als mengsels van structureel vergelijkbare verbindingen, in plaats van een enkele verbinding. Vanwege hun gemeenschappelijke structurele kenmerken, veel verbindingen binnen dezelfde klasse ondergaan soortgelijke MS/MS versnippering en hebben een aantal identieke product ionen en/of neutrale verliezen. Het doel van diagnostische versnippering filtering (DFF) is om efficiënt te detecteren alle verbindingen van een bepaalde klasse in een complex extract door het screenen van niet-gerichte LC-MS/MS datasets voor MS/MS spectra die klasse specifieke product ionen en/of neutrale verliezen bevatten. Deze methode is gebaseerd op een DFF module geïmplementeerd binnen de open-source MZmine platform dat monster extracten vereist worden geanalyseerd door data-afhankelijke acquisitie op een hoge-resolutie massaspectrometer zoals quadrupole Orbitrap of quadrupole tijd-van-vlucht massa Analyzers. De belangrijkste beperking van deze aanpak is de analist moet eerst bepalen welke product-ionen en/of neutrale verliezen zijn specifiek voor de beoogde klasse van natuurlijke producten. DFF zorgt voor de daaropvolgende ontdekking van alle aanverwante natuurlijke producten binnen een complex monster, met inbegrip van nieuwe verbindingen. In dit werk, demonstreren we de effectiviteit van DFF door screening extracten van micro cystis aeruginosa, een prominente schadelijke algenbloei veroorzaakt cyanobacteriën, voor de productie van microcystins.
Inleiding
Tandem massaspectrometrie (MS/MS) is een veelgebruikte massaspectrometrie methode die het isoleren van een voorloper Ion en het induceren van fragmentatie via de toepassing van activeringsenergie, zoals Collision geïnduceerde dissociatie (CID)1. De wijze waarop een ionen fragmenten nauw verbonden zijn met de moleculaire structuur. De natuurlijke producten worden vaak biogesynthetiseerd als mengsels van structureel gelijkaardige samenstellingen eerder dan als één enkele unieke chemisch product2. Als zodanig, structureel verwante verbindingen die deel uitmaken van dezelfde biosynthetische klasse vaak delen belangrijke MS/MS fragmentatie kenmerken, met inbegrip van gedeelde product ionen en/of neutrale verliezen. De mogelijkheid om complexe monsters te screenen voor verbindingen die klasse-specifieke product ionen en/of neutrale verliezen bezitten is een krachtige strategie om hele klassen van verbindingen te detecteren, die mogelijk leiden tot de ontdekking van nieuwe natuurlijke producten3, 4 , 5 , 6. voor decennia, massaspectrometrie methoden zoals neutrale verlies scannen en voorloper Ion Scanning uitgevoerd op lage resolutie instrumenten hebben toegestaan ionen met dezelfde neutrale verlies of product-ionen te detecteren. Echter, de specifieke ionen of overgangen moesten worden gedefinieerd voorafgaand aan het uitvoeren van de experimenten. Aangezien de massaspectrometers met hoge resolutie populairder zijn geworden in onderzoekslaboratoria, worden complexe monsters nu vaak gescreend met behulp van niet-gerichte, data-afhankelijke acquisitie methoden. In tegenstelling tot de traditionele neutrale verlies en voorloper Ion Scanning, kunnen structureel verwante verbindingen worden geïdentificeerd door post-acquisitie analyse7. In dit werk tonen we een strategie die we hebben ontwikkeld genoemd diagnostische fragmentatie filtering (DFF)5,6, een rechttoe rechtaan en gebruiksvriendelijke aanpak om hele klassen van verbindingen op te sporen binnen complexe matrices. Deze DFF module is geïmplementeerd in de open-source, MZmine 2 platform en beschikbaar door het downloaden van MZmine 2,38 of nieuwere releases. DFF stelt gebruikers in staat om op efficiënte wijze te screenen op de datasets van MS/MS spectra die product Ion (s) en/of neutraal verlies (sen) bevatten die kenmerkend zijn voor hele klassen van verbindingen. Een beperking van DFF is kenmerkende product ionen en/of de neutrale verliezen voor een klasse van samenstellingen moeten door de analist worden bepaald.
Bijvoorbeeld, elk van de meer dan 60 verschillende fumonisin mycotoxinen geïdentificeerd8,9 beschikken over een tricarballylic kant keten, dat genereert een m/z 157,0142 (C6H5O5-) product Ion op fragmentatie van [M-H]- Ion4. Daarom kunnen alle vermeende fumonisinen in een sample worden gedetecteerd met behulp van DFF door alle MS/MS spectra te screenen binnen een Doha dataset die het prominente m/z 157,0142 product ion bevat. Ook kunnen gesulfaatde verbindingen worden gedetecteerd door de Doha-datasets te screenen voor MS/MS spectra die een diagnostisch neutraal verlies van 79,9574 da (dus3)3bevatten. Deze aanpak is ook met succes toegepast voor het opsporen van nieuwe cyclische peptiden5 en natuurlijke producten die tryptofaan of fenylalanine residuen bevatten6.
Om de effectiviteit van DFF en het gebruiksgemak binnen het MZmine platform10aan te tonen, hebben we deze benadering toegepast op de analyse van Microcystins (MCS); een klasse van meer dan 240 structureel verwante toxines die door zoet water cyanobacteriën11,12,13worden geproduceerd.
De meest gemelde cyanotoxins zijn MCs, met de MC-LR (Leucine [L]/Arginine [R]) congeneer het vaakst bestudeerd (Figuur 1). MCs zijn monocyclische niet-ribosomale heptapeptides, biogesynthetiseerd door veelvoudige cyanobacteriën genera met inbegrip van Microcystis , Anabaena, Nostoc, en Planktothrix12,13. MCs bestaat uit vijf gemeenschappelijke residuen en twee veranderlijke posities bezet door L-aminozuren. Bijna bezitten alle MCs een kenmerkend β-aminozuur 3-amino-9-methoxy-2, 6, 8-Trimethylpentaandiolmonoisobutyraat-10-phenyldeca-4, 6-dienoic zuur (ADDA) residu bij positie 511. De MS/MS fragmentatie trajecten van MCS zijn goed beschreven14,15; de Adda residu is verantwoordelijk voor de prominente MS/MS product ion, m/z 135,0803+ (c9h11O+) en andere product ionen waaronder m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (Figuur 2). Niet-gerichte Doha-datasets van Microcystis aeruginosa cellulaire extracten kunnen worden gescreend voor alle microcystins aanwezig met behulp van deze diagnostische ionen, toegekend dat de Microcystins een Adda residu hebben.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van niet-gerichte vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS datasets
Opmerking: DFF kan worden uitgevoerd met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer en analytische methode geoptimaliseerd voor een doelgroep van analyten. MC geoptimaliseerd LC-MS/MS voorwaarden op Orbitrap massaspectrometer zijn opgenomen in de tabel van materialen.
-
Downloaden MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Opmerking: voorbeeld data CPCC300. RAW is te vinden op https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- Onder de RAW-gegevens methoden drop-down menu, selecteert u de ruwe data import optie.
- Kies het te analyseren gegevensbestand. Er kunnen enkele of meerdere bestanden worden geïmporteerd.
- Optionele Als de gegevensindeling van de leverancier niet wordt ondersteund door MZmine, gebruikt u Proteowizard16 om centroided. mzml-gegevensbestanden te genereren.
- Kies het Peak picking filter om door de leverancier geleverde centroiding algoritme toe te passen.
2. diagnostische fragmentatie filtering van geïmporteerde bestanden van Doha
- Met behulp van de cursor, selecteer en markeer de gegevensbestand (en) in de RAW-gegevensbestanden kolom van de belangrijkste MZmine scherm.
- Onder de visualisatie drop-down menu, selecteert u de Diagnostische fragmentatie filter optie.
- In het dialoogvenster DFF dat verschijnt (Figuur 3), voert u de volgende opties in:
- Retentietijd – gebruik auto bereik of definieer het bereik van retentietijden in minuten wanneer de beoogde klasse van analyten zal Elueer.
- Voor loper m/z -gebruik auto bereik of definieer de m/z bereik van de beoogde klasse van analyten, met inbegrip van de mogelijkheid voor meerdere geladen verbindingen indien nodig.
- m/z tolerantie – input van de haalbare MS/MS massa nauwkeurigheid van de MSinstrument; 0,01 m/z of 3,0 ppm is geschikt voor een Orbitrap platform. Als alleen diagnostische product ionen zullen worden onderzocht, input 0,0 in de Diagnostische neutrale verlies waarde (da) optie. Omgekeerd, als slechts de kenmerkende neutrale verliezen zullen worden onderzocht, input 0,0 in de kenmerkende product ionen (m/z) optie.
-
Diagnostische product ionen (m/z) -input van de klasse specifieke product Ion (s) m/z. Scheid meerdere product ionen met een komma.
Nota: het invoeren van veelvoudige product ionen zal Spectrums visualiseren die alle vermelde product ionen bevatten. -
Diagnostische neutrale verlies waarde (da) -input van de klasse specifieke neutrale verlies (sen). Scheid meerdere neutrale verliezen met een komma.
Opmerking: het invoeren van meerdere neutrale verliezen zal Spectrums visualiseren die alle vermelde neutrale verliezen bevatten. Het invoeren van zowel diagnostische product ionen en neutrale verliezen zal visualiseren spectra die voldoen aan alle criteria. - Minimale diagnostische ion intensiteit (% base Peak) – als een% van de basis piek van de MS/MS spectra, definieer de minimale intensiteit voor diagnostische product ionen en/of neutrale verliezen te overwegen.
- Peaklist output file -Selecteer een pad en bestandsnaam om de output van de resultaten.
- Klik op de knop OK om de DFF-analyse te starten. Een DFF plot zal verschijnen op succesvolle voltooiing van de bovenstaande stappen
Opmerking: er worden twee CSV-gegevensbestanden gegenereerd. {Peaklist output file}. CSV bevat de voorloper m/z, scan nummers, en retentietijden van de scans. Dit kan in bestaande MZmine modules met inbegrip van ruwe gegevens methodes worden gebruikt > piek opsporing > gerichte piek opsporing om geëxtraheerde ionen chromatogrammen van voorlopers te produceren die aan de gedefinieerde DFF criteria voldeden. {Peaklist output file} _data. CSV bevat de voorloper m/z, product Ion m/z en retentietijden om het genereren van DFF percelen buiten MZmine mogelijk te maken.
3. voorbeeld gebruik van DFF voor microcystin analyse
-
Monstervoorbereiding
- Steriliseren 250 mL erlenmeyer kolven met 30 mL steriele MA media17 of andere cyanobacteriën groeimedia (BG-11) voorzien van een schuim stopper.
- Inoculeren gesteriliseerde groeimedia met een cyanobacteriën cultuur tot ongeveer 5 × 105 cellen ml-1 onder aseptische omstandigheden. Monitor cel dichtheid met een hemocytometer. In dit voorbeeld, Grow M. aeruginosa stam CPCC300 photoautotrophically bij 27 ° c, verlicht met koele witte tl-licht (30 µ e M-2 s-1) met behulp van een 12 h licht: 12 h donker regime. Wervel de cellen eenmaal per dag.
- Scheid de cellen van de cultuurmedium na 26 dagen door vacuümfiltratie met behulp van 47 mm diameter GF/C glas microfiber filter papieren.
- Voeg 3 mL 80% methanol (AQ) toe aan geoogste cellen in 14 ml reageerbuis (s).
- Vortex en vervolgens Bewerk de reageerbuis (en) met cyanobacteriën cellen voor 30 s elk. Bewaar de reageerbuis (en) bij-20 °C voor 1 h. Breng de reageerbuis terug op kamertemperatuur en laat het monster (s) gedurende 15 minuten ontdooien.
- Herhaal stap 3.1.5 twee extra tijden om de cellen effectief te lyse.
- Filter de resulterende cyanobacteriën cel extract (s) door middel van een 0,22 μm PTFE spuit filter (s).
- Droog extract (en) met een verdamper bij een temperatuur van 30 °C met een zachte stroom van stikstof gas. Bewaar het extract droog bij-20 °C tot LC-MS/MS analyse.
- Reconstrueren het gedroogde residu met 500 µ L van 90% methanol (AQ) en Vortex voor 30 s in een Amber HPLC flacon voorafgaand aan de analyse.
- Analyseer het cyanobacteriën-extract met een acquisitie methode van Demol op een massaspectrometer met hoge resolutie.
Opmerking: de geoptimaliseerde LC-MS voorwaarden voor MC-analyse die hier worden gebruikt zijn opgenomen in de lijst van materialen. - Bereid de Doha-data file (s) voor en importeer deze in MZmine volgens de stappen 1,1 en 1,2.
- Selecteer de data files en start de DFF modules volgens de stappen 2.1-2.2.
- Voor MC analyse, gebruik de volgende instellingen binnen de DFF module (Figuur 3).
- Retentietijd -input van het bereik van 2,00 tot 6,00 min.
- Voorloper m/z -input m/z bereik van 430,00 tot 1200,00.
- m/z tolerantie – Breng m/z tolerantie van 0,01 m/z of 3,0 ppm.
- Diagnostische product ionen (m/z) – input m/z van 135,0803, 163,1114 als de diagnostische product ionen
- Diagnostische neutrale verlies waarde (da) – input 0,0 om te definiëren dat er geen diagnostische neutrale verliezen worden gebruikt.
- Minimale diagnostische ion intensiteit (% base Peak) – gebruik 15,00 als de minimale intensiteit drempel
- Peaklist output file -Definieer de output bestand als putative_MCs. CSV.
- Klik op de knop OK om de DFF-analyse te starten. Een DFF plot (Figuur 4) zal verschijnen bij het succesvol voltooien van de bovenstaande stappen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De DFF plot gegenereerd na de analyse van M. aeruginosa CPCC300 is weergegeven in Figuur 4. De x-as van dit perceel is de m/z van de voorloper ionen die tevreden zijn met de gedefinieerde DFF criteria, terwijl de y-as toont de m/z van alle product ionen binnen de MCS MS/MS spectra. Voor deze analyse, de criteria voor MC detectie opgenomen voorloper ionen binnen de m/z bereik van 440-1200, retentietijden tu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
DFF is een rechttoe rechtaan en snelle strategie voor het opsporen van hele klassen van verbindingen, met name relevant voor natuurlijke productsamenstelling ontdekking. Het belangrijkste aspect van DFF is het definiëren van de specifieke MS/MS fragmentatie criteria voor de beoogde klasse van verbindingen. In dit representatieve voorbeeld werd DFF gebruikt om alle Adda residuen te detecteren die MCs bevatten in een M. aeruginosa cellulair extract. Hoewel de overgrote meerderheid van MCs een Adda-residu bevat, zi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Heather Roshon (Canadese phycological Culture Centre, Universiteit van Waterloo voor het verstrekken van de cyanobacteriën cultuur bestudeerd en Abusharkh (Carleton University) voor technische bijstand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Uitgerust met HESI-ionisatiebron |
| 1290 UHPLC | Agilent | Uitgerust met binaire pomp, autosampler, kolomcompartiment | |
| C18 kolom | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD kolom (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solventen | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitril | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Anders | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE spuitfilters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glasmicrovezelfilters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) (hoeveelheid / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Natriumglycerofosfaat, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metaaloplossing, 5 mL | |||
| Breng het volgende tot 1 L met ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 & middot;6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2& middot;4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2& middot;6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4& middot;2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X zoetwateroplossing | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
Referenties
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).
- Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
