Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Samenvatting

De cel apoptosis is een natuurlijk proces en speelt een kritieke rol in embryonale ontwikkeling, homeostatische regelgeving, immune tolerantie inductie, en resolutie van ontsteking. Accumulatie van apoptotic puin in het lichaam kan leiden tot chronische inflammatoire reacties die leiden tot systemische auto-immuunziekten in de tijd. Verminderde apoptotic cel klaring is betrokken bij een verscheidenheid van auto-immuunziekten. Apoptotic klaring is een complex proces zelden ontdekt onder fysiologische omstandigheden. Het gaat om overvloedig oppervlak receptoren en signalering moleculen. Het bestuderen van het proces van apoptotic cel ontruiming biedt inzichtelijke moleculaire mechanismen en de daaropvolgende biologische reacties, die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Hier beschrijven we protocollen voor de inductie van apoptotic thymocyten, de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, en de analyse van apoptotic cel ontruiming doorstroming Cytometry en microscopie. Alle cellen zullen apoptose ondergaan in een bepaald stadium, en veel residentiële en circulerende cellen kunnen opname apoptotic puin. Daarom, het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotic cel binding en inname door vele andere soorten cellen.

Inleiding

Ons lichaam genereert 1-10 miljard apoptotic cellen op een dagelijkse basis. Zulk een groot aantal apoptotic cellen moet op een bepaalde manier worden ontruimd dat de immune reacties rustig blijven. Om de goedkeuring van apoptotic cellen tijdig te verzekeren, ontwikkelen talrijke types van weefsel ingezetene cellen en circulerende cellen mechanismen om apoptotic cellen over te spoelen¹. Disfunctionele regulering van apoptosis is betrokken bij het begin en de progressie van verschillende inflammatoire aandoeningen en autoimmuniteit². Apoptosis speelt ook een kritieke rol in de pathogenese van kankerontwikkeling en zijn verdere weerstand tegen conventionele behandelingen^3,4. Verwijdering van apoptotic cellen bevordert in het algemeen een anti-inflammatoire reactie, die kan worden gekoppeld aan immunologische tolerantie⁵. Verstoring van apoptotic Cell klaring drives zelf-immunisatie en draagt bij tot de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten in zowel mensen als muizen⁶.

Wanneer de cellen apoptosis ondergaan, stellen zij de fosfatidylserine (PtdSer) van de binnen folder aan de buiten folder van het membraan bloot. PtdSer zal dan door fagocyten door oppervlakte receptoren worden erkend. Meer dan een dozijn receptoren zijn geïdentificeerd te herkennen en/of te vergemakkelijken de overspoeling van apoptotic cellen. In het algemeen zijn er ten minste drie soorten oppervlakte-receptoren die betrokken zijn bij de apoptotic cel klaring: Tethering receptoren, herkennen apoptotic cellen; kietelen receptoren, initiëren overspoeling; chaperoning receptoren, vergemakkelijken het hele proces⁷. TAM receptor tyrosine kinases (TAM RTKs) bestaan uit Tyro-3, AXL, en Mer en worden voornamelijk uitgedrukt door myeloïde cellen van het immuunsysteem⁸. De primaire functie van TAM RTKs is om te dienen als Tethering receptoren, het vergemakkelijken van de fagocyterende verwijdering van apoptotic cellen en puin. Onze groep heeft gestudeerd TAM gemedieerde apoptotic Cell klaring in de setting van de autoimmuniteit voor vele jaren. De vitamine K-afhankelijke eiwit de groeiarrestatie specifieke proteïne 6 (Gas6) en proteïne S (ProS) bindt aan en activeert de receptoren van TAM^9,10. Gas6 wordt geproduceerd in het hart, nieren, en de longen. ProS wordt hoofdzakelijk geproduceerd in lever¹¹. TAM erkent van apoptotic cellen op een zodanige wijze dat de N-terminal van Gas6/ProS bindt aan de PtdSer op een apoptotic cel en de C-terminal van Gas6/ProS bindt aan TAM-receptoren die verankerd op het oppervlak van fagocyten. Samen met de andere receptoren, overspoeling van apoptotic cellen komt¹². Hoewel Mer kan binden aan zowel de ligands ProS en Gas6, vonden we dat Gas6 lijkt te zijn de enige ligand voor Mer-gemedieerde macrofagen fagocytose van apoptotic cellen, die kunnen worden geblokkeerd door anti-Mer antilichaam¹³. Macrofagen zijn professionele fagocyten. Snelle ontruiming van apoptotic cellen door macrofagen is belangrijk voor de remming van ontstekingen en auto-immune reacties tegen intracellulaire antigenen. Mer receptor tyrosine kinase is van cruciaal belang voor de inspoeling van de macrofagen en efficiënte klaring van apoptotic cellen¹⁴. In muis milt, Mer voornamelijk uitdrukt op de marginale zone en tastbare lichaam macrofagen¹³.

Het hier voorgestelde protocol beschrijft een basismethode om cel apoptosis te veroorzaken en manieren aan te tonen om het proces en de efficiency van efferocytosis te meten. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan studie efferocytosis door andere cel types in het overspoelen van apoptotic cellen van verschillende oorsprong.

Protocol

Experimentele muizen werden gefokt en onderhouden in onze muizen kolonie. Alle dierlijk werk werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Cincinnati.

1. voorbereiding van CFSE gelabeld apoptotic thymocyten

1. Euthanaseren twee naïeve C57/B6 muizen door CO₂ inhalatie voor 10 min en ontleden om de borstholte te openen, verwijderen (pull out) de thymus met gebogen Fine-Tip Tang in weefselcultuur petrischaal met 10 ml van RPMI1640 medium.
2. Verkrijg enkele cel schorsing door het slijpen van de hele Thymus tegen twee matte uiteinden van de Microscoop dia's en vervolgens filteren de schorsing door middel van 100 μm cel zeef.
3. Verzamel de 10 mL Thymus suspensie in een 50 mL buis en centrifuge op 300 x g voor 5 min.
4. Verwijder de bovendrijvende, opnieuw op te schorten in 40 mL van 1x PBS, en Tel cel nummers met een hemocytometer.
5. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min en verwijder de bovendrijvende.
6. Hersuspendeer in 20 mL van 1x PBS in een 50 mL buis als een enkele cel schorsing met maximaal 2 x 10⁸ cellen (indien meer dan 2 x 10⁸ cellen, de rest van de cellen opnieuw op te schorten in een andere 20 ml van 1 x PBS in een andere 50 ml buis).
7. Maak 5 μM van CFSE in gelijk volume (20 mL) van 1x PBS in een aparte 50 mL buis door het pipetteren van 40 l van CFSE Stock Solution (2,5 mM) in 20 mL 1x PBS en meng goed door het inverteren van de buis 2-3 keer.
8. Voeg de 20 mL CFSE van stap 1,7 in de 20 mL van de cel schorsing van stap 1,6 (de uiteindelijke concentratie van CFSE is nu 2,5 μM).
   Opmerking: voor elke 20 mL cel schorsing is een 20 mL CFSE buis nodig.
9. Omkeren van de cel en CFSE mengsel buis 2-3 keer en Incubeer het mengsel in het donker bij kamertemperatuur voor een maximum van 2 min, dan stoppen met de reactie door toevoeging van 10 mL warmte-geïnactiveerde paard serum.
10. Centrifugeer het 50 mL Tube mengsel bij 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
    Nota: als de CFSE etikettering succesvol is, zal de cel korrel lichtgeel van kleur worden.
11. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de Cell pellet in 40 mL van 1x PBS en Tel de cel nummers met een hemocytometer.
12. Centrifugeer de cel suspensie bij 300 x g voor 5 min en gooi de bovendrijvende.
13. Was de cel pellet weer met 40 mL van RPMI1640 medium.
14. Verwijder de bovendrijvende en opnieuw op te schorten cellen met RPMI1640 weefselkweek medium (RPMI1640 mM HEPES, 10% FBS (warmte geïnactiveerd), 20 mM glutamine, en 1x pen/keelontsteking) bij een concentratie van 7 x 10⁶ cellen/ml in een 100 mm weefselkweek schaal.
    Opmerking: als er meer cellen worden verkregen, zal een aparte 100 mm weefselkweek schotel nodig zijn.
15. Voeg staurosporine in de cel schorsing cultuur bij een definitieve concentratie van 1 μM en cultuur voor 4 uur bij 37 ° c in een weefselkweek incubator geleverd met 5% CO₂.

2. bereiding van de buik macrofagen

1. Injecteren twee C57B6 muizen (of een Gene-gemanipuleerde muizen in het lab) ze intraperitoneaal met 1 mL van 3% oud thioglycollaat op dag 0.
2. Euthanaseren de muizen op dag 5 als in stap 1,1, knippen en schil open de buikhuid, maar laat het buikvlies intact. Spoel de buikholte door snel 10 mL was buffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in de buikholte te duwen met een 10 mL spuit bevestigd met een naald van 18 G.
3. Haal de Wash buffer langzaam met dezelfde naald/spuit, en verzamel de Wash buffer in een 50 mL Tube (details verwijzen naar Janssen Lab artikel¹⁵).
4. Was het buikvlies sonde tweemaal met 1x PBS, hersuspendeer de buik macrofagen in RPMI1640 weefselkweek middel bij een dichtheid van 2 x 10⁶ cellen/ml en hoeveelheid 500 l in elk van de 24-Well plaat. Laat de plaat in een weefselkweek incubator voor 2 uur.
5. Verwijder de zwevende cellen door opzuigen en vervangen met 500 l van verse cultuurmedium, tweemaal.
6. Optioneel, voeg TAM receptor tyrosine-remmer, RXDX-106, bij concentraties aangegeven in de figuur legendes in elk goed van de macrofagen cultuur en incubeer voor een andere 2 h.

3. co-cultuur van buik macrofagen met apoptotic thymocyten

1. Verzamel apoptotic thymocyten van stap 1 en was drie keer met RPMI1640 medium. De efficiëntie van apoptotic inductie kan in dit stadium gemeten worden met de Annexine V/7-AAD Kit.
2. Distribueer 0-12 x 10⁶ cellen (in 500 l medium) in elke put van de macrofagen culturen van Protocol #2, volgens de experimentele regeling (bijv. Zie figuur 1). Dit maakt het gehele cultuur volume van 1 mL in elk goed van de 24-goed plaat. Voeg het blokkerende antilichaam in de cultuur onmiddellijk voor de toevoeging van apoptotic thymocyten.
3. Cultuur het cel mengsel bij 37 °C voor 4 h in een incubator van de weefselcultuur die met 5% CO₂wordt geleverd.
4. Was elk goed van de cultuur met 1x PBS (bevattend 500 μM EDTA) tweemaal om de vrij-drijft apoptotic cellen te verwijderen.
5. Vlek de plaat-gebonden macrofagen met CD11b-PE in dit stadium.
   1. Was de plaat-gebonden macrofagen met vlekken buffer (1x PBS, 1% BSA) een keer.
   2. Voeg 200 l van de vlek buffer met 2 l CD11b-PE in elk goed toe.
   3. Incubeer de plaat bij 4 °C gedurende 20 min.
   4. Was elk goed van de plaat drie keer met de kleuring buffer.
   5. Voeg 200 l van de vlek buffer toe en ga de plaat voorbeeld analyse onder de fluorescente microscoop te werk.
6. Alternatief, Los de plaat-gebonden macrofagen door toevoeging van 1 mL 1% lidocaïne in PBS en incubatie voor 10 min bij 37 ° c.
7. Maak plaat-gebonden macrofagen met REPEAT pipet los.
8. Breng de macro-suspensie over in een individuele 5 mL ronde-onderkant FACS buis van elk goed van de 24-Well plaat.
9. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min.
10. Verwijder de bovendrijvende en voeg 200 l van de vlek buffer toe met 2 l CD11b-PE (1:200 verdunning in kleur buffer).
11. Incubatie de cel schorsing in kleuring buffer bij 4 ° c voor 20 min.
12. Was de cel schorsing tweemaal met kleuring buffer.
13. Voeg 200 l van kleuring buffer en ga voor FACS analyse met een flow cytometer en analyseren voor het percentage van CFSE positiviteit macrofagen.

Resultaten

Analyse van het buikvlies macrofagen-gemedieerde overspoeling van apoptotic thymocyten. Buik macrofagen en apoptotic cellen werden voorbereid en co-Cultured zoals beschreven in het protocol. Macrofagen werden losgemaakt en gekleurd met PE geconjugeerd anti-CD11b antilichaam voor 20 min op ijs. Macrofagen werden vervolgens gewassen en verwerkt in een stroom cytometer. Zoals te zien, er is geen CFSE positieve macrofagen in de rechtsonder Kwadrant als er geen apoptotic cellen werden toegevoegd in de cultuur...

Discussie

Apoptosis is een hoogst behouden celdood proces dat vele signaalcascades impliceert en proteïne uitdrukking, afscheiding, en vervoer veroorzaakt. Apoptosis wordt vaak geassocieerd met cellulaire morfologie veranderingen¹⁷. Apoptotic cellen actief vrijgeven cytokines en chemokines die aantrekken fagocyten om te migreren naar de site en initiëren van het proces van overspoeling, een uiterst complexe route onder strakke controle¹⁸. Aan de andere kant, necrotic Cell Death relea...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Bereid 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Voeg 214,3 ml DMSO toe aan 100 mg om 1 mM stockoplossing te maken
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Bereid 3% thioglycolaat buffer in 1´PBS, geautoclaveerd en bewaar in het donker gedurende 3 maanden.